第七章 凝膠層析

第七章凝膠層析層析法（也稱(chēng)色譜法）：早在1903年由俄國(guó)植物學(xué)家Tswett分離植物色素時(shí)采用。他在研究植物葉的色素成分時(shí)，將植物葉子的萃取物倒入填有碳酸鈣的直立玻璃管內(nèi)，然后加入石油醚使其自由流下，結(jié)果色素中各組分互相分離形成各種不同顏色的譜帶。這種方法因此得名為色譜法。以后此法逐漸應(yīng)用于無(wú)色物質(zhì)的分離，“色譜”二字雖已失去原來(lái)的含義，但仍被人們沿用至今。概述1.層析法簡(jiǎn)介層析法是利用混合物中各組分物理化學(xué)性質(zhì)的差異（如吸附力、分子形狀及大小、分子親和力、分配系數(shù)等），使各組分在兩相中的分布程度不同，從而使各組分以不同的速度移動(dòng)而達(dá)到分離的目的。其中固定的稱(chēng)為固定相；流過(guò)固定相的稱(chēng)為流動(dòng)相。2.層析法的基本原理根據(jù)層析分離機(jī)制柱層析紙層析薄層層析薄膜層析吸附層析離子交換層析凝膠層析親和層析氣相(氣-液;氣-固)層析液相(液-液;液-固)層析根據(jù)兩相所處狀態(tài)根據(jù)操作形式不同3.層析法的分類(lèi)凝膠層析第一節(jié)凝膠層析的基本原理第二節(jié)凝膠的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)第三節(jié)凝膠層析的實(shí)驗(yàn)條件和操作第四節(jié)色譜峰變寬的問(wèn)題（自學(xué)）第五節(jié)凝膠層析的應(yīng)用第一節(jié)凝膠層析的基本原理一、凝膠層析原理凝膠過(guò)濾、分子篩層析、排阻層析、凝膠滲透層析等。是將樣品混合物通過(guò)一定孔徑的凝膠固定相，由于各組分流經(jīng)體積的差異，使不同分子量的組分得以分離的層析方法。二、凝膠層析的重要參數(shù)1.外水體積、內(nèi)水體積、基質(zhì)體積、柱床體積、洗脫體積

⑴柱體積(VA)：柱體積是指凝膠裝柱后，從柱的底板到凝膠沉積表面的體積。在色譜柱中充滿(mǎn)凝膠的部分稱(chēng)為凝膠床，因此柱體積又稱(chēng)“床”體積(VA)。⑵外水體積（V0）：色譜柱內(nèi)凝膠顆粒間隙，這部分體積稱(chēng)外水體積，亦稱(chēng)間隙體積，常用V0表示。⑶內(nèi)水體積Vi：因凝膠為三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，顆粒內(nèi)部仍有空間，液體可進(jìn)入顆粒內(nèi)部，水的總和為內(nèi)水體積，又稱(chēng)定相體積，常用Vi表示。不包括基質(zhì)的體積（Vg）。VA=V0+Vi+Vg

V柱內(nèi)空間＝Vo＋Vi柱床體積VA可以通過(guò)加入一定量的水至層析柱預(yù)定標(biāo)記處，然后測(cè)量水的體積來(lái)測(cè)定。VA=1/4

D2h計(jì)算外水體積Vo可以通過(guò)測(cè)定完全排阻的大分子物質(zhì)的洗脫體積來(lái)測(cè)定，一般常用藍(lán)色葡聚糖-2000作為測(cè)定外水體積的物質(zhì)。因?yàn)樗姆肿恿看螅?00萬(wàn)），在各種型號(hào)的凝膠中都被排阻，并且它呈藍(lán)色，易于觀察和檢測(cè)。⑷峰洗脫體積（淋出體積Ve）：是指被分離物質(zhì)通過(guò)凝膠柱所需洗脫液的體積，常用Ve表示。Ve=V0+Vi，aceVi，ace是Vi的一部分，它與Vi之比成為Kd（分配系數(shù)）Ve=V0+ViKd152.分配系數(shù)Kd分配系數(shù)：

當(dāng)Kd=1時(shí)，洗脫體積Ve=V0+Vi，為全滲入。當(dāng)Kd=0時(shí)，洗脫體積Ve=V0，為全排阻。0＜Kd＜1時(shí)，洗脫體積Ve=Vo+KdVi，為部分滲入。因此分子的正常Kd值0~1之間,這種由小到大的Kd值順序決定了物質(zhì)流出的順序。16物質(zhì)的Kd值3.排阻極限

排阻極限是指不能進(jìn)入凝膠顆?？籽▋?nèi)部的最小分子的分子量。所有大于排阻極限的分子都不能進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，直接從凝膠顆粒外流出，所以它們同時(shí)被最先洗脫出來(lái)。排阻極限代表一種凝膠能有效分離的最大分子量，大于這種凝膠的排阻極限的分子用這種凝膠不能得到分離。例如SephadexG-50的排阻極限為30,000，它表示分子量大于30,000的分子都將直接從凝膠顆粒之外被洗脫出來(lái)。4.分級(jí)分離范圍

分級(jí)分離范圍表示一種凝膠適用的分離范圍，對(duì)于分子量在這個(gè)范圍內(nèi)的分子，用這種凝膠可以得到較好的線性分離。例如SephadexG-75對(duì)球形蛋白的分級(jí)分離范圍為3,000－70,000，它表示分子量在這個(gè)范圍內(nèi)的球形蛋白可以通過(guò)SephadexG-75得到較好的分離。應(yīng)注意，對(duì)于同一型號(hào)的凝膠，球形蛋白與線形蛋白的分級(jí)分離范圍是不同的。5.吸水率和床體積

吸水率是指1g干的凝膠吸收水的體積或者重量。但它不包括顆粒間吸附的水份。所以它不能表示凝膠裝柱后的體積。而床體積是指1g干的凝膠吸水后的最終體積。20二、凝膠層析的特點(diǎn)（1）凝膠層析操作簡(jiǎn)便、設(shè)備簡(jiǎn)單(僅需一根層析柱)。（2）分離效果較好，重復(fù)性高，樣品回收率高,接近100%。（3）分離條件緩和。（4）應(yīng)用廣泛。適用于各種生化物質(zhì)，如肽類(lèi)、激素、蛋白質(zhì)、多糖、核酸的分離純化，脫鹽、濃縮以及分析測(cè)定類(lèi)。（5）分辨率不高，分離操作較慢。21第二節(jié)凝膠的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)一、葡聚糖凝膠

(Sephadex)二、修飾葡聚糖凝膠(ModifiedSephadex)三、聚丙烯酰胺凝膠

（Bio-GelP）四、瓊脂糖類(lèi)凝膠

（Sepharose）

五、多孔玻璃微球(Bio-glas)六、疏水性凝膠（hydrophobicgels）

22一、葡聚糖凝膠(Sephadex)商品名為SephadexG類(lèi).交聯(lián)葡聚糖的基本骨架是葡聚糖。再經(jīng)3-氯-1，2-環(huán)氧丙烷為交聯(lián)劑，形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的高分子化合物。其交聯(lián)度是通過(guò)交聯(lián)劑的加量及反應(yīng)條件來(lái)控制的。

1.結(jié)構(gòu)SephadexG-X，X數(shù)字代表1）代表交聯(lián)度X越?。航宦?lián)度越大，網(wǎng)孔越小，適用于分離低分子質(zhì)量生化產(chǎn)品。X越大：交聯(lián)度越小，網(wǎng)孔越大，適用于分離高分子質(zhì)量生化產(chǎn)品。2）代表持水量每克干膠溶脹時(shí)吸水體積的10倍G-25：1g干膠持水2.5mLG-100：1g干膠持水10mL3）溶漲時(shí)間；4）凝膠孔徑；5）分離范圍2規(guī)格型號(hào)：24葡聚糖凝膠性能與編號(hào)的關(guān)系編號(hào)交聯(lián)度吸液量膨脹速度凝膠孔徑分離限凝膠強(qiáng)度大（SephadexG－150）小大慢大大小?。⊿ephadexG－50）大小快小小大25葡聚糖凝膠（G類(lèi)）的規(guī)格3.性質(zhì)穩(wěn)定性。能被強(qiáng)酸、強(qiáng)堿和氧化劑破壞，對(duì)稀酸稀堿和鹽溶液穩(wěn)定，能耐受一定高溫。存在非特異性吸附含少量羥基：對(duì)陽(yáng)離子輕微吸附環(huán)狀結(jié)構(gòu)：對(duì)芳香族化合物和雜環(huán)化合物出現(xiàn)滯留274.保存濕法：加入一定量的防腐劑置于冰箱中作短期保存（6個(gè)月以?xún)?nèi)）。常用0.02%疊氮化鈉、0.02%三氯叔丁醇、20%乙醇等。干法：用濃度逐漸升高的乙醇分步處理洗凈的凝膠，脫水收縮，抽濾，用60~80℃吹干。半縮法：60-70%乙醇使凝膠部分脫水收縮，封口，4℃保存保存的方法有干法、濕法和半縮法三種。28二、修飾葡聚糖凝膠

(ModifiedSephadex)（一）親脂性葡聚糖凝膠（LipophilicSephadex）骨架結(jié)構(gòu)上引入一些有機(jī)基團(tuán)，如甲基、羥丙基，使呈親脂性，同時(shí)保留親水性。（二）交聯(lián)葡聚糖離子交換劑（Sephadex–ion-exchanger）將活性交換基團(tuán)連接于葡聚糖凝膠上制成的各種交換劑。29

（三）Superdex系凝膠由高交聯(lián)度多孔瓊脂糖與葡聚糖共價(jià)結(jié)合而成。（四）Sephacryl系凝膠是由丙烯烷基葡聚糖經(jīng)甲叉雙丙烯酰胺共價(jià)交聯(lián)制成的。理化穩(wěn)定性好，為硬性凝膠，可耐高壓滅菌。30三、聚丙烯酰胺凝膠

商品名為生物凝膠-P（Bio-GelP）。該凝膠由丙烯酰胺組成；以亞甲基雙丙烯酰胺為交聯(lián)劑，聚合而成。1.結(jié)構(gòu)312.聚丙烯酰胺凝膠的性質(zhì)

1）孔徑大?。赏ㄟ^(guò)交聯(lián)度調(diào)整）；2）穩(wěn)定性、強(qiáng)度；3）無(wú)非特異吸附，保存方便；4）生物凝膠的編號(hào)反映出它的分離界限。如Bio-GelP-100。32四、瓊脂糖類(lèi)凝膠

（Sepharose）

（一）瓊脂糖凝膠1.結(jié)構(gòu)是由β-D-半乳糖與3，6-脫水-L-半乳糖以α-1，3-和β-1，4-糖苷鍵相間連接而成的鏈狀分子。332.瓊脂糖凝膠特點(diǎn)1、沒(méi)有共價(jià)鍵的交聯(lián)。2、孔徑瓊脂糖的濃度。3、瓊脂糖凝膠的化學(xué)穩(wěn)定性較差。4、顆粒強(qiáng)度差。5、非特異性吸附力低。6、分離范圍大。34瓊脂糖凝膠分離范圍瓊脂糖凝膠有3個(gè)規(guī)格：Sepharose2B、4B、6B分別表示瓊脂糖濃度為2%，4%，6%。瓊脂糖凝膠做成珠狀后不再脫水干燥，否則不能再溶脹恢復(fù)原有形狀，因此商品在都以含水狀態(tài)供應(yīng)，并應(yīng)在濕態(tài)保存。一般懸浮在10-3mol/LEDTA和0.02%疊氮化鈉溶液中。避免硼酸緩沖液3.保存36（二）架橋瓊脂糖凝膠（SepharoseCL）

架橋瓊脂糖凝膠為瓊脂線性分子經(jīng)1，3-二溴丙醇交聯(lián)的凝膠。它的凝膠孔徑均勻，機(jī)械強(qiáng)度明顯加大。對(duì)熱和化學(xué)物質(zhì)的穩(wěn)定性大大增加,在pH3~14范圍內(nèi)穩(wěn)定。

37（三）超膠（Utro-gelACA）所謂超膠是瓊脂糖與聚丙烯酰胺的混合凝膠。商品名稱(chēng)后面的編號(hào)為兩位數(shù)，各表示混合膠中聚丙烯酰胺與瓊脂糖的百分濃度。38

（四）Superose系凝膠

是由珠狀瓊脂糖經(jīng)兩次交聯(lián)制得的可用于HPLC的高速凝膠過(guò)濾介質(zhì)。有6%和12%兩個(gè)規(guī)格。39五、多孔玻璃微球(Bio-glas)特點(diǎn)：1、化學(xué)穩(wěn)定性高、強(qiáng)度大。2、對(duì)糖類(lèi)、蛋白質(zhì)等物質(zhì)有吸附作用。3、編號(hào)表示其孔徑,越大，分離分子量也越大。40六、疏水性凝膠（hydrophobicgels）聚甲基丙烯酸酯凝膠和聚苯乙烯凝膠。Styragel商品,分離范圍為1600～40000000。生物珠（Bio-BeadS），適于分離分子量較小的物質(zhì)。分離不溶水的有機(jī)物質(zhì)。41一第三節(jié)

凝膠層析的實(shí)驗(yàn)條件和操作

4243一、凝膠的選擇和處理

二、凝膠層析柱的設(shè)計(jì)和制備

三、凝膠層析操作

四、主要參數(shù)測(cè)算五、凝膠層析的擴(kuò)展

44一、凝膠的選擇和處理（一）凝膠的選擇(1).將分子量極為懸殊的兩類(lèi)物質(zhì)分開(kāi)，如蛋白質(zhì)與鹽類(lèi)，稱(chēng)作類(lèi)分離。(2).將分子量相差不大的大分子物質(zhì)加以分離，如分離血清球蛋白與白蛋白，這叫做分級(jí)分離。451）類(lèi)分離（1）使大分子的分配系數(shù)Kd=0；（2）小分子的Kd=1。選用SephadexG-25凝膠，分離范圍1000～5000。462）分級(jí)分離（1）使各種物質(zhì)的Kd值盡可能相差大。（2）使組分的分子量盡可能分布在凝膠分離范圍的兩側(cè)，或接近兩側(cè)的位置。（3）樣品中含有3個(gè)組分：一個(gè)接近全排阻另一個(gè)接近全滲入第三個(gè)為部分滲入，且分子量大于滲入限的3倍，并小于排阻限的1/3。。如用SephadexG-200分離血清蛋白質(zhì)的效果要比SephadexG-150為好。47（二）凝膠粒度的選擇細(xì)粒凝膠柱流速低，洗脫峰窄，分辨率高，用于精制分離或分析。粗粒凝膠柱流速高，洗脫峰平坦，分辨率低，用于粗制分離，脫鹽。48（三）凝膠的預(yù)處理使用前須溶漲，使干膠顆粒充分吸收溶劑，并達(dá)到平衡。干膠以10倍以上吸液量的溶劑浸泡。熱法溶漲(水浴)。49二、凝膠層析柱的設(shè)計(jì)和制備

（一）層析柱的選擇1.柱比：層析柱長(zhǎng)度與直徑的比值稱(chēng)作“柱比”。對(duì)于類(lèi)分離，柱比5:1到10:1即可。對(duì)于分級(jí)分離，柱比在25至100之間。2.柱的下端口

要滿(mǎn)足兩個(gè)要求：不易阻塞；死體積小。玻璃板上鋪濾紙玻璃板下填充小玻璃珠51凝膠柱床大小與所需凝膠量的關(guān)系

52（二）凝膠柱的裝填常用的支持物有棉花、玻璃纖維、玻璃珠、垂熔玻璃等。支持物要求不漏不堵，不吸附樣品，且能保持一定流速空柱中應(yīng)留約1/5的水或溶劑.不斷攪拌下使膠粒均勻沉降，使不發(fā)生凝膠分層和膠面傾斜。凝膠懸液濃度適當(dāng)

層析柱

（a）自制簡(jiǎn)易層祈柱（1．玻璃管；2.橡皮塞；3．尼龍網(wǎng)）；（b）普通商品柱；（c）雙底板層析柱（1.洗脫液進(jìn)出口；2.多孔底板；3．柱床；4．恒溫水進(jìn)口；5．恒溫水出口；6．可調(diào)節(jié)的塞子）

層析系統(tǒng)連接示意圖

1．密封橡皮塞；2．恒壓管，3，恒壓瓶；4，層析流出液，5．可調(diào)蜾旋夾；6.自動(dòng)收集器；7.核酸一蛋白質(zhì)檢測(cè)儀

BS－100自動(dòng)部分收集器安裝圈1．反全閥；2換管臂；3滴管；4，5換管臂固定螺絲；6.豎桿；7.豎桿囤定螓絲；8報(bào)警板；9.試管；10．收集盤(pán)；11.時(shí)間選揮旋鈕；12.時(shí)間選擇固定螺釘；13．自動(dòng)開(kāi)關(guān)；14、指示燈；15.電源開(kāi)關(guān)；16．換向開(kāi)關(guān)（逆、順）；17．手動(dòng)開(kāi)關(guān)56（三）凝膠床的檢查和維護(hù)觀察有無(wú)凝膠分層、溝流和氣泡等現(xiàn)象。平衡有色物質(zhì)溶液過(guò)柱，觀察柱床有無(wú)溝流，色帶是否平整。檢查物質(zhì)為藍(lán)色葡聚糖。57操作壓

層析柱由于進(jìn)出口之間液位壓力差形成的對(duì)凝膠顆粒的壓力稱(chēng)作“操作壓”。

58層析床橫截面所允許的最大壓力

59三、凝膠層析操作（一）樣品和加樣蛋白質(zhì)類(lèi)樣品濃度:不大于4%。樣品粘度小于0.01Pas樣品渾濁應(yīng)先過(guò)濾除顆粒后上柱

樣品黏度對(duì)洗脫曲線的影響（1）加葡萄糖2000，使終濃度為5%，相對(duì)粘度11.8;（2）加葡萄糖2000，使終濃度為2.5%，相對(duì)粘度4.2;（3）加葡萄糖2000，使終濃度為1%.

61（1）直接將樣品加到層析床表面。（2）樣品比重高。加樣時(shí)應(yīng)盡量減少樣品的稀釋?zhuān)澳z床面的攪動(dòng)。1.洗脫劑常采用緩沖鹽溶液進(jìn)行洗脫洗脫液的成分也不應(yīng)改變，以防凝膠漲縮引起柱床體積變化或流速改變。流速較低，分辨率較高，樣品稀釋較輕

（二）洗脫與收集632、流速（操作壓、型號(hào)、粒度）。整個(gè)洗脫過(guò)程中始終保持一定的操作壓編號(hào)小，顆粒粗---流速大與操作壓成正比，柱長(zhǎng)成反比3、部分收集器。65（三）凝膠柱的再生板結(jié)、不溶物污染、嚴(yán)重吸附反沖。重新裝柱。66四、主要參數(shù)測(cè)算V0及Vi的測(cè)算Kd及Kav的值分辨率R67（一）V0及Vi的測(cè)算1．重量法Vt=Vo+Vi+Vg=π/4·d2h

Vi=g·WrVo=Vt－（Vi+Vg） Vg估算為1cm3/g干膠。2．過(guò)柱法已知物質(zhì)的洗脫體積Ve=Vo+KdVi如用全滲入（Kd=1）或全排阻（Kd=0）的物質(zhì)過(guò)柱，測(cè)量其洗脫體積，計(jì)算該凝膠柱的V0值及Vi值。常用藍(lán)色葡聚糖（Kd=0）及重鉻酸鉀（Kd=1）。68（二）分配系數(shù)測(cè)定分配系數(shù)當(dāng)測(cè)得某物質(zhì)的Ve及Vt

，內(nèi)水體積Vi及外水體積V0時(shí)，算出Kd及Kav的值。Kd及KavVe被認(rèn)為是一種組分對(duì)于某一個(gè)凝膠柱的特征常數(shù)。69（三）分辨率凝膠層析中，兩物質(zhì)（A和B）和分辨率（R）定義為：

當(dāng)R值＞1，兩物質(zhì)完全分開(kāi)，小于1時(shí)