第五章生物技術(shù)

第五章單倍體細(xì)胞培養(yǎng)第五章第一節(jié)單倍體及其應(yīng)用價(jià)值第二節(jié)離體花粉/小孢子發(fā)育途徑第三節(jié)花藥培養(yǎng)與花粉培養(yǎng)第四節(jié)植物單倍體育種本章主要內(nèi)容第四章本章教學(xué)目的與要求概念：花粉培養(yǎng)，花藥培養(yǎng)，花粉二型性單倍體的應(yīng)用價(jià)值離體花粉的發(fā)育途徑花粉培養(yǎng)與花藥培養(yǎng)的比較影響花藥培養(yǎng)的因素第四章第一節(jié)單倍體及其應(yīng)用價(jià)值一、概念二、單倍體的起源三、單倍體植物的特點(diǎn)及遺傳行為四、單倍體的應(yīng)用價(jià)值第五章一、概念單倍體是指具有配子染色體數(shù)的個(gè)體或組織，體細(xì)胞染色體數(shù)為n單倍體細(xì)胞培養(yǎng)主要包括三個(gè)方面：花藥培養(yǎng)花粉培養(yǎng)未受精子房及卵細(xì)胞培養(yǎng)第一節(jié)二、單倍體的起源①種間和屬間雜交

遠(yuǎn)緣雜交中，異種植物雖然不能與母本授粉、受精，由于遠(yuǎn)緣花粉的誘導(dǎo)作用，卵細(xì)胞在沒(méi)有受精的情況下受刺激而發(fā)育成胚土豆、大麥、小麥、玉米②物理照射和化學(xué)誘變

花粉用射線照射后失去了受精能力，然后與母株授粉，卵細(xì)胞在花粉的刺激作用下進(jìn)行孤雌發(fā)育，從而產(chǎn)生單倍體煙草、小麥、金魚(yú)草第一節(jié)③雙生苗的篩選（selectionoftwins）有些植物可產(chǎn)生多胚種子，即兩個(gè)或多個(gè)胚被共同的種皮包裹著，這些種子可產(chǎn)生單倍體-單倍體、二倍體-二倍體和單倍體-二倍體植株在辣椒中，雙生苗的頻率受母本基因型控制通過(guò)篩選可以提高雙生苗的頻率④花藥和花粉培養(yǎng)

第一節(jié)三、單倍體植物的特點(diǎn)及遺傳行為1、單倍體分成兩類:一倍單倍體（monohaploids），這類單倍體起源于二倍體物種多倍單倍體（polyhaploids），這類單倍體起源于多倍體（如4X，6X等）第一節(jié)diploid植物其haploid即為monoploid

玉米2n=2x=20n=x=10

水稻2n=2x=24n=x=12

柑橘2n=2x=18n=x=9

tetraploid植物其haploid為dihaploid

馬鈴薯2n=4x=48n=2x=24

陸地棉2n=4x=52n=2x=26

hexaploid植物其haploid為triploid

普通小麥2n=6x=42n=3x=21

octoploid植物其haploid為tetraploid

草莓2n=8x=56n=4x=28第一節(jié)2、單倍體植物的特點(diǎn)體細(xì)胞染色體數(shù)減半；生長(zhǎng)發(fā)育弱，體形小、各器官明顯減??；雌雄配子嚴(yán)重?cái)∮?，有的甚至不能進(jìn)入有性世代第一節(jié)3、單倍體的遺傳行為一倍的單倍體只有一個(gè)染色體基數(shù)（X），減數(shù)分裂時(shí)染色體不能配對(duì)，分離極不正常但具有一定同源關(guān)系的染色體可以部分配對(duì)，從而可以對(duì)染色體的演化過(guò)程進(jìn)行研究四、單倍體的應(yīng)用價(jià)值母本×父本F1F2花藥培養(yǎng)花粉植株加倍選擇鑒定品系比較試驗(yàn)區(qū)域試驗(yàn)品種5—8代（一）、縮短育種周期第一節(jié)（二）、提高目標(biāo)基因型的選擇效率如果某一性狀受一對(duì)基因控制AA×aa→F1→F2中純合AA個(gè)體只有1/4F1采用花藥或花粉培養(yǎng)，產(chǎn)生的后代中AA個(gè)體占1/2，比常規(guī)雜交育種提高一倍如屬兩對(duì)基因控制AAbb×aaBB,F2中要選出AABB個(gè)體的機(jī)率只有1/16F1采用花藥或花粉培養(yǎng)，AaBb只產(chǎn)生4種花粉：AB、Ab、aB、ab，加倍后AABB個(gè)體的頻率可達(dá)1/4比常規(guī)雜交育種效率提高4倍常規(guī)育種：?jiǎn)伪扼w育種=1/22n：1/2n。第一節(jié)（三）、排除雜種優(yōu)勢(shì)對(duì)后代選擇的干擾

對(duì)于雜交育種來(lái)講，由于低世代很多基因位點(diǎn)尚處于雜合狀態(tài)，會(huì)有不同程度的雜種優(yōu)勢(shì)表現(xiàn)，對(duì)個(gè)體的選擇會(huì)造成一定誤差采用DH群體進(jìn)行選擇育種，由于各基因位點(diǎn)在理論上均處于純合狀態(tài)，選擇到的變異能更大程度上代表真實(shí)變異第一節(jié)（四）、遺傳研究的良好實(shí)驗(yàn)材料體系

單倍體在作物的數(shù)量遺傳研究中可能有較大用途，如：基因相互作用的檢測(cè)、遺傳變異的估計(jì)、連鎖群的檢測(cè)、影響數(shù)量性狀的基因數(shù)目的估計(jì)及多基因的定位等

DH系是分子標(biāo)記遺傳作圖的良好群體單倍體可用來(lái)創(chuàng)造非整倍體材料，用單倍體與二倍體雜交，可創(chuàng)造一系列的附加系，從而研究染色體的遺傳功能花藥和花粉培養(yǎng)體系還是發(fā)育遺傳研究的良好材料，可以用來(lái)研究細(xì)胞的分裂及分化，研究花粉發(fā)育途徑的轉(zhuǎn)變，以及與轉(zhuǎn)變有關(guān)的基因的表達(dá)與調(diào)控第一節(jié)（五）、突變體的篩選單倍體的每個(gè)基因都是單拷貝的，各種隱性基因都可以表現(xiàn)出來(lái)，加倍后形成的雙單倍體各基因均處于純合狀態(tài)，突變體很容易表現(xiàn)出來(lái)，大大提高了抗性或其它突變體的篩選效率對(duì)花藥進(jìn)行離子照射，然后對(duì)花藥愈傷篩選，可以獲得理想的突變體第一節(jié)（六）、消除致死基因單倍體帶有致死基因的個(gè)體即使加倍后形成雙單倍體也會(huì)由于基因的純合而被消除而致死基因在自然群體里常常因?yàn)殡s合體的存在而不易被徹底消除。（七）、選育新型自交系對(duì)雙親或多親雜交的雜種一代進(jìn)行花藥或花粉培養(yǎng)，獲得的雙單倍體實(shí)際上是純合的自交系，在雜種優(yōu)勢(shì)利用育種中有很大用途第一節(jié)（八）、遺傳轉(zhuǎn)化的受體材料在轉(zhuǎn)基因育種中，如果用體細(xì)胞為受體，經(jīng)常遇到轉(zhuǎn)基因后代材料分離問(wèn)題，經(jīng)多代選擇才能穩(wěn)定下來(lái)如用單倍體細(xì)胞作受體，獲得的轉(zhuǎn)基因材料經(jīng)加倍后，從理論上講會(huì)很快達(dá)到純合狀態(tài)受體材料可以是花粉、單倍體原生質(zhì)體、單倍體胚或單倍體植株作外植體第一節(jié)本節(jié)完第二節(jié)離體花粉/小孢子發(fā)育途徑一、花粉/小孢子的正常發(fā)育階段二、離體小孢子的發(fā)育途徑三、雄核發(fā)育啟動(dòng)機(jī)理第二節(jié)一、花粉/小孢子的正常發(fā)育階段（一）、花粉不均等分裂途徑(A途徑

)小孢子第一次有絲分裂為不均等分裂，形成營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞和生殖細(xì)胞。（1）A-V途徑（營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞發(fā)育途徑）由營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞重復(fù)分裂形成單倍體（2）A-G途徑（生殖細(xì)胞發(fā)育途徑）由生殖細(xì)胞重復(fù)分裂形成單倍體（3）E途徑(營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞和生殖細(xì)胞并進(jìn)發(fā)育途徑）由營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞和生殖細(xì)胞各自獨(dú)立分裂，共同形成單倍體（4）C途徑營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞和生殖細(xì)胞通過(guò)核融合，形成多倍體植株二、離體小孢子的發(fā)育途徑第二節(jié)第二節(jié)（二）花粉均等分裂途徑（B途徑）小孢子第一次有絲分裂為均等分裂，形成大小相近的兩個(gè)細(xì)胞。然后由這兩細(xì)胞繼續(xù)分裂形成單倍體植株，或者核融合形成多倍體植株1、雄核發(fā)育與P花粉的形成花粉的二型性：在花藥/花粉培養(yǎng)時(shí)，由于對(duì)培養(yǎng)條件的反應(yīng)不同，花粉在形態(tài)上形成兩種類型，一類是具胚性的，在煙草和大麥中，花粉小，染色淺；另一類為花粉大，染色深，朝成熟花粉方向發(fā)展P-花粉：具胚胎發(fā)生潛能的花粉。也稱小花粉（S-花粉）或不染色花粉（NS-花粉）三、雄核發(fā)育啟動(dòng)機(jī)理第二節(jié)在煙草和大麥中，花粉小，染色淺，為胚性的胚性小孢子第三節(jié)水稻花粉二型性在水稻中，胚性小孢子（約10%）比非胚性小孢子大、高度液泡化胚性小孢子第三節(jié)2、逆境處理與雄核發(fā)育的誘導(dǎo)

熱激處理物理或化學(xué)處理低溫處理營(yíng)養(yǎng)饑餓處理重金屬脅迫激發(fā)花粉產(chǎn)生原胚促使細(xì)胞同步分裂改變細(xì)胞分裂周期第二節(jié)本節(jié)完第三節(jié)花藥培養(yǎng)與花粉培養(yǎng)一、花藥培養(yǎng)操作技術(shù)二、花粉培養(yǎng)操作技術(shù)三、單倍體植株再生、鑒定及加倍四、花粉培養(yǎng)與花藥培養(yǎng)的比較五、影響花藥培養(yǎng)的因素六、禾本科植物花藥培養(yǎng)中的白化苗現(xiàn)象第三節(jié)花藥培養(yǎng):是植物雄性生殖器官-花藥為外植體離體培養(yǎng)技術(shù)，就培養(yǎng)方法和技術(shù)來(lái)講，屬于器官培養(yǎng)的范疇。花粉培養(yǎng)：將處于一定發(fā)育階段的花粉從花藥中分離出來(lái)，再加以離體培養(yǎng)。也稱為小孢子培養(yǎng)(microsporeculture)一、花藥培養(yǎng)操作技術(shù)1、取材鏡檢，根據(jù)花粉的發(fā)育時(shí)期，選取大小適宜的花蕾。

2、消毒

70％酒精浸泡30-60s花蕾后在1％次氯酸鈉溶液中浸泡10-20min，無(wú)菌水沖洗3-5次。

3、培養(yǎng)固體或液體培養(yǎng)基均可。先進(jìn)行脫分化培養(yǎng)，至小孢子大量分裂形成胚或愈傷，并突破花藥壁表面，形成突出物（2-3周）；后轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基培養(yǎng)，形成小植株。第三節(jié)二、花粉培養(yǎng)操作技術(shù)(一)花粉的分離與純化1、自然散落法(漂浮培養(yǎng)散落小孢子收集法)

將花藥接種在預(yù)處理液或液體培養(yǎng)基上，待花粉自動(dòng)散落后，收集培養(yǎng)。2、擠壓法在燒杯或研缽中擠壓花藥，將花粉擠出后收集培養(yǎng)。3、機(jī)械游離（1）磁攪拌法：用磁力攪拌器攪拌培養(yǎng)液中的花藥，使花粉游離出來(lái)；（2）超速旋切法：通過(guò)攪拌器中的高速旋轉(zhuǎn)刀具破碎花蕾、穗子、花藥，使小孢子游離出來(lái)（此法應(yīng)用最廣）。4、小孢子純化對(duì)上述方法獲得的小孢子混合物進(jìn)行分級(jí)過(guò)篩、梯度離心處理純化小孢子第三節(jié)(二)花粉培養(yǎng)方式1、平板培養(yǎng)：花粉置瓊脂固化培養(yǎng)基上培養(yǎng)。2、液體培養(yǎng)：花粉懸浮在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，需震蕩，以利通氣。3、雙層培養(yǎng)：花粉置固體-液體雙層培養(yǎng)基上培養(yǎng)。培養(yǎng)基制作方法：先鋪一層瓊脂固體培養(yǎng)基，凝固后，在表面加入少量液體培養(yǎng)基。

4、看護(hù)培養(yǎng)：利用花藥或花藥愈傷組織釋放出的活性物質(zhì)促進(jìn)花粉小孢子發(fā)育。5、微室培養(yǎng)：利用小的蓋玻片和凹穴載玻片形成微室進(jìn)行花粉培養(yǎng)6、條件培養(yǎng)基培養(yǎng)：利用培養(yǎng)過(guò)花藥的液體培養(yǎng)基或含失活花藥提取物的培養(yǎng)基上培養(yǎng)?；ㄋ帡l件培養(yǎng)基、子房條件培養(yǎng)等。第三節(jié)看護(hù)培養(yǎng)：第三節(jié)（一）花粉植株的形態(tài)發(fā)生方式1、器官發(fā)生型花粉-----多細(xì)胞花粉粒----細(xì)胞團(tuán)（愈傷組織）-----繼代培養(yǎng)-----單倍體植株。2、胚狀體發(fā)生型花粉-----多細(xì)胞花粉粒----進(jìn)一步培養(yǎng)----胚壯體-----釋放-----植物體。第三節(jié)三、單倍體植株再生、鑒定及加倍第三節(jié)（二）、單倍體植株鑒定1、染色體直接計(jì)數(shù)法：通常取根尖、莖尖等分生組織區(qū)進(jìn)行制片，直接計(jì)數(shù)染色體數(shù)目。2、間接鑒定（1）流式細(xì)胞儀鑒定：主要測(cè)定葉片單個(gè)細(xì)胞中DNA的含量確定細(xì)胞的倍性，材料的使用量可少到1cm2。（2）細(xì)胞形態(tài)學(xué)鑒定法：葉片保衛(wèi)細(xì)胞大小、單位面積上的氣孔數(shù)及保衛(wèi)細(xì)胞中葉綠體的大小和數(shù)目與倍性具有高度的相關(guān)性。第三節(jié)（3）植株形態(tài)學(xué)鑒定法：?jiǎn)伪扼w植株瘦弱，葉片窄小，花小柱頭長(zhǎng)，花粉粒小，不結(jié)實(shí)。（4）雜交鑒定法：自交或測(cè)交鑒定，看后代分離情況確定二倍體植株是來(lái)自小孢子還是體細(xì)胞。（5）分子標(biāo)記鑒定 如RFLP、RAPD、AFLP等第三節(jié)（三）、染色體加倍1.莖段培養(yǎng)：將單倍體植株的莖段進(jìn)行培養(yǎng)，誘導(dǎo)愈傷組織形成。由