第四章 發(fā)酵工程

第四章發(fā)酵工程

1什么是發(fā)酵工程？請(qǐng)大家看一看利用發(fā)酵工程生產(chǎn)的產(chǎn)品的一些實(shí)例：234第一節(jié)概述一、發(fā)酵工程發(fā)酵工程（fermentationengineerin）又稱微生物工程，是利用微生物制造工業(yè)原料與工業(yè)產(chǎn)品并提供服務(wù)的技術(shù)?，F(xiàn)代發(fā)酵工業(yè)已經(jīng)形成完整的工業(yè)體系，包括抗生素、氨基酸、維生素、有機(jī)酸、有機(jī)溶劑、多糖、酶制劑、單細(xì)胞蛋白、基因工程藥物、核酸類物質(zhì)及其他生物活性物質(zhì)等的生產(chǎn)。5二、發(fā)酵工程發(fā)展的四個(gè)階段

第一階段，20世紀(jì)以前時(shí)期，人類利用傳統(tǒng)的微生物發(fā)酵過程來生產(chǎn)葡萄酒、酒、醋、醬、奶酪等食品。第二階段，1900-1940年期間，隨著微生物培養(yǎng)技術(shù)的不斷進(jìn)步，新的發(fā)酵產(chǎn)品不斷問世。新的產(chǎn)品主要有酵母、甘油、乳酸、檸檬酸、丁醇和丙酮等。第三階段，發(fā)酵工業(yè)大發(fā)展時(shí)期，青霉素工業(yè)化成功推動(dòng)了發(fā)酵工業(yè)的發(fā)展。主要標(biāo)志有：深層培養(yǎng)、生產(chǎn)大規(guī)?；?，多種抗生素、氨基酸、核酸發(fā)酵成功，甾體的微生物轉(zhuǎn)化。第四階段，基因工程等高技術(shù)應(yīng)有那個(gè)階段。6巴斯德巴斯德，于1822年12月27日生于法國(guó)1854年9月，法國(guó)教育部委任他為里爾工學(xué)院院長(zhǎng)兼化學(xué)系主任，在那里，他對(duì)酒精工業(yè)發(fā)生了興趣，而制作酒精的一道重要工序就是發(fā)酵。巴斯德深入工廠考察，把各種甜菜根汁和發(fā)酵中的液體帶回實(shí)驗(yàn)室觀察。經(jīng)過多次實(shí)驗(yàn)，他發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵液里有一種比酵母菌小得多的球狀小體，它長(zhǎng)大后就是酵母菌。過了不久，在菌體上長(zhǎng)出芽體，芽體長(zhǎng)大后脫落，又成為新的球狀小體，在這循環(huán)不斷的過程中，甜菜根汁就“發(fā)酵”了。巴斯德繼續(xù)研究，弄清發(fā)酵時(shí)所產(chǎn)生的酒精和二氧化碳?xì)怏w都是酵母使糖分解得來的。這個(gè)過程即使在沒有氧的條件下也能發(fā)生，他認(rèn)為發(fā)酵就是酵母的無氧呼吸并控制它們的生活條件，這是釀酒的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

巴斯德弄清了發(fā)酵的奧秘，從此開始，巴斯德終于成為一位偉大的微生物學(xué)家，成了微生物學(xué)的奠基人。

7三、發(fā)酵工程的研究?jī)?nèi)容

發(fā)酵工程的內(nèi)容包括菌種的培養(yǎng)和選育、菌的代謝與調(diào)節(jié)，培養(yǎng)基滅菌、通氣攪拌、溶氧、發(fā)酵條件的優(yōu)化、發(fā)酵過程各種參數(shù)與動(dòng)力學(xué)、發(fā)酵反應(yīng)器的設(shè)計(jì)和自動(dòng)控制、產(chǎn)品的分離純化和精致等。發(fā)酵工業(yè)的發(fā)展水平取決于三個(gè)要素：生產(chǎn)菌種、發(fā)酵工藝和發(fā)酵設(shè)備。8

四、發(fā)酵工程的關(guān)鍵技術(shù)問題

1、微生物資源庫(kù)和微生物功能基因組學(xué)技術(shù)

微生物菌種或酶是工業(yè)生物技術(shù)的基礎(chǔ)。從自然界中篩選所需要的菌種是目前工業(yè)生物技術(shù)的主要特點(diǎn)，大部分成功的高產(chǎn)工業(yè)化菌株是從自然界篩選得到的野生型菌株。

2、生物催化劑快速定向改造新技術(shù)

近年來發(fā)展起來的定向進(jìn)化技術(shù)，大大加速了人類改造酶原有功能和開發(fā)新功能的步伐。蛋白質(zhì)定向進(jìn)化技術(shù)可以使蛋白質(zhì)（酶）在自然界需要幾百萬(wàn)年才能完成的進(jìn)化過程縮短到幾年甚至幾個(gè)月。

3、重要工業(yè)微生物的代謝工程

通過基因重組技術(shù)改變微生物的代謝途徑，生產(chǎn)出傳統(tǒng)發(fā)酵工業(yè)無法獲得的新產(chǎn)品。例如美國(guó)利用基因工程手段，將五碳糖產(chǎn)乙醇和六碳糖產(chǎn)乙醇的代謝途徑整合到一個(gè)微生物中，能同時(shí)發(fā)酵利用五碳糖和六碳糖產(chǎn)乙醇。

9第二節(jié)優(yōu)良菌種的選育發(fā)酵工程產(chǎn)品開發(fā)的關(guān)鍵是篩選新的有用物質(zhì)的產(chǎn)生菌。從自然界分離得到的野生型菌種不論產(chǎn)量上或質(zhì)量上均不適合工業(yè)生產(chǎn)要求，因此必須通過人工育種。優(yōu)良菌種的選育不僅為發(fā)酵工業(yè)提供高產(chǎn)菌株，還可以各種類型的突變菌株。菌種選育包括自然選育、誘變育種、雜交育種等經(jīng)驗(yàn)育種方法，還包括控制雜交育種、原生質(zhì)體融合、基因工程等定向育種等方法。10一、菌種選育的物質(zhì)基礎(chǔ)微生物的一切性狀包括形態(tài)和生理都決定于菌體內(nèi)的各種酶。而DNA是支配著這許許多多酶有條不紊地行使其功能，使同一種微生物的上下代酶的種類、功能都一樣。決定遺傳性狀的DNA主要集中在染色體上，只有少數(shù)游離在外。DNA分子結(jié)構(gòu)的改變是誘變育種的工作依據(jù)，染色體搭配的變化交換是雜交育種的依據(jù)。對(duì)DNA分子結(jié)構(gòu)和它復(fù)制過程的了解將更有利于充實(shí)誘變育種的理論根據(jù)。另外，質(zhì)粒也是遺產(chǎn)物質(zhì)，它是染色體外的遺產(chǎn)結(jié)構(gòu)。許多質(zhì)粒攜帶一些能影響宿主細(xì)胞類型的基因，例如用來控制抗生素的形成。11二、自然選育

不經(jīng)人工處理利用微生物的自然突變進(jìn)行菌種選育的過程為自然選育。自發(fā)突變的變異率很低。由于微生物可以發(fā)生自發(fā)突變，所以菌種在群體培養(yǎng)過程中會(huì)產(chǎn)生變異個(gè)體。正變菌株：變異個(gè)體中是一種是生長(zhǎng)良好，生產(chǎn)水平提高，對(duì)生產(chǎn)有利，這類菌株稱為正變菌株。負(fù)變菌株：是生產(chǎn)能力下降，形態(tài)出現(xiàn)異性，生產(chǎn)水平那下降，導(dǎo)致菌種退化，這類菌株稱為負(fù)變菌株。自然選育就是將正變菌株挑選出來，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。自然選育可以達(dá)到純化菌種、防止菌種衰退、穩(wěn)定生產(chǎn)水平、提高產(chǎn)物產(chǎn)量的目的。但是自然選育存在效率低和進(jìn)展慢的缺點(diǎn)，將自然選育和誘變育種交替使用，才容易收到良好的效果。12三、誘變育種（1）用人工方法來誘發(fā)突變是加速基因突變的重要手段，它的突變率比自然突變提高成百上千倍。突變發(fā)生部位一般在DNA上，因此突變后形狀能穩(wěn)定遺傳。（一）誘變育種的方法和原理變異：微生物在生理和形態(tài)上的變化只要是可遺傳的都稱為變異。變異和由環(huán)境變化而出現(xiàn)的變化有本質(zhì)上的區(qū)別。微生物誘變育種的目的是要使它向符合人們需要的方向變異。通常用物理、化學(xué)、生物等因素進(jìn)行對(duì)微生物誘變，導(dǎo)致DNA結(jié)構(gòu)上的變化。13三、誘變育種(2)1、誘變機(jī)制由誘變導(dǎo)致微生物DNA的微細(xì)結(jié)構(gòu)發(fā)生的變化，主要分為微小損傷變化、染色體畸變即大損傷突變、染色體組突變?nèi)N類型。（1）微小損傷突變微小損傷突變有堿基的置換和碼組移動(dòng)突變兩種。堿基的置換是一種真正的點(diǎn)突變，根據(jù)置換方式的不同可分為轉(zhuǎn)換和顛換兩種。轉(zhuǎn)換：是DNA鏈上一個(gè)嘌呤被另一個(gè)嘌呤或一個(gè)嘧啶被另一個(gè)嘧啶置換，這是常見的基因突變。顛換：是指DNA鏈上一個(gè)嘌呤被另一個(gè)嘧啶或一個(gè)嘧啶被另一個(gè)嘌呤所置換。14三、誘變育種(3)1、誘變機(jī)制（2）染色體畸變?nèi)旧w畸變是遺傳物質(zhì)的缺失重復(fù)或重排而造成的染色體異常突變。染色體畸變主要包括一條染色體內(nèi)部所發(fā)生的畸變和非同源染色體之間所發(fā)生的畸變，它有下列幾種情況：①易位②到位③缺失④重復(fù)（3）染色體組突變這類突變主要是指細(xì)胞核內(nèi)染色體數(shù)目改變。15三、誘變育種(4)2、誘變劑及其作用方式誘變劑：能誘發(fā)基因突變并使突變率提高到超過自發(fā)突變水平的物理化學(xué)因子都稱為誘變劑。誘變劑的種類很多，可分為物理、化學(xué)，生物三大類。（1）物理誘變劑主要有紫外線、x射線、γ射線、快中子、α射線、β射線和超聲波等。其中以紫外線應(yīng)用最廣。（2）化學(xué)誘變劑在篩選工作中，人們發(fā)現(xiàn)從最簡(jiǎn)單的無機(jī)物到最復(fù)雜的有機(jī)物中都可找到能引起誘變的物質(zhì)，包括金屬離子、一般化學(xué)試劑、生物堿、抗代謝物、生長(zhǎng)激素、抗生素及高分子化合物、殺菌劑、染料等。16三、誘變育種(5)（二）誘變和篩選誘變育種主要有誘變和篩選兩步。實(shí)用意義較大的初篩方法有一下幾種：①自身耐藥突變株②結(jié)構(gòu)類似物或前體類似物的耐受突變株③營(yíng)養(yǎng)缺陷型及其回復(fù)突變株17四、原生質(zhì)體融合原生質(zhì)體融合就是把兩個(gè)親株分別通過酶解去除細(xì)胞壁，使菌體細(xì)胞在高滲環(huán)境中釋放出由原生質(zhì)膜包被著的球狀體，在高滲條件下混合兩個(gè)親株的原生質(zhì)體，由PEG作為助融劑使它們相互凝集發(fā)生細(xì)胞融合，接著兩親株細(xì)胞基因組由接觸到交換，從而實(shí)現(xiàn)遺傳重組，在再生細(xì)胞中就有可能挑選到較理想的重組子。1、原生質(zhì)體融合的一般程序2、影響融合的因素⑴菌齡⑵培養(yǎng)基的成分⑶PEG⑷外界因素3原生質(zhì)體融合育種18第三節(jié)發(fā)酵的基本過程

發(fā)酵的基本過程為：菌種→種子制備→發(fā)酵→發(fā)酵液預(yù)處理→提取精制19一、菌種

發(fā)酵水平的高低與菌種的性能質(zhì)量有直接關(guān)系，菌種的生產(chǎn)能力、生長(zhǎng)繁殖的情況和代謝特性是決定發(fā)酵水平的內(nèi)在因素。這要求用于生產(chǎn)的菌種產(chǎn)量高、生長(zhǎng)快、性能穩(wěn)定、容易培養(yǎng)。目前國(guó)內(nèi)外發(fā)酵工業(yè)中所采用的菌種絕大多數(shù)是經(jīng)過人工選育的優(yōu)良菌種。為了菌種衰退，生產(chǎn)菌種必須以休眠狀態(tài)保存在砂土管或冷凍干燥管中，并且置于0～4℃恒溫冰箱（庫(kù)）內(nèi)。使用時(shí)可臨時(shí)取出，接種后仍需冷藏。生產(chǎn)菌種一般都安格規(guī)定其使用期，一般砂土管為1～2年。生產(chǎn)菌種應(yīng)不斷純化，淘汰變異菌落，防止衰退。20二、種子的制備

種子是發(fā)酵工程開始的重要環(huán)節(jié)。這一過程是使菌種繁殖、以獲得足夠數(shù)量的菌體，一邊接種到發(fā)酵罐中。種子發(fā)酵可以在搖瓶中或小罐內(nèi)進(jìn)行，大型發(fā)酵罐的種子要經(jīng)過兩次擴(kuò)大培養(yǎng)才能接入發(fā)酵罐。搖瓶培養(yǎng)是在錐形瓶?jī)?nèi)裝入一定量的液體培養(yǎng)基，滅菌后接入菌種，然后放在回轉(zhuǎn)式或往復(fù)式搖床上恒溫培養(yǎng)。種子罐一般用鋼或不銹鋼制成，結(jié)構(gòu)相當(dāng)于小型發(fā)酵罐，種子罐接種前有關(guān)設(shè)備及培養(yǎng)基要經(jīng)過嚴(yán)格的滅菌。種子罐可用微孔壓差法或打開接種閥在火焰的菌絲形態(tài)觀察和生化分析，以確保種子質(zhì)量。21三、發(fā)酵發(fā)酵的目的是使微生物產(chǎn)生大量的目的產(chǎn)物，是發(fā)酵工序的關(guān)鍵階段。發(fā)酵一般是在鋼或不銹鋼的罐內(nèi)進(jìn)行，有關(guān)設(shè)備和培養(yǎng)基應(yīng)事先經(jīng)過嚴(yán)格滅菌，然后將長(zhǎng)好的種子接入，接種量一般為5％～20％.在整個(gè)發(fā)酵過程中要不斷地通氣，攪拌，維持一定的罐溫，罐壓，并定時(shí)取樣分析和無菌試驗(yàn)，觀察代謝和產(chǎn)物含量情況，有無污染。在發(fā)酵過程中會(huì)產(chǎn)生大量泡沫，所以往往要加入消沫劑來控制泡沫。加入酸堿控制發(fā)酵液的pH值，多數(shù)品種的發(fā)酵還需要間歇或連續(xù)加入葡萄糖及銨鹽化合物，或補(bǔ)進(jìn)其他料液和前體以促進(jìn)產(chǎn)物的產(chǎn)生。發(fā)酵中可供分析的參數(shù)：通氣量、攪拌轉(zhuǎn)速、罐溫、罐壓、培養(yǎng)基總體積、粘度、泡沫情況、菌絲形態(tài)、pH、溶解氧、排氣中CO2含量以及培養(yǎng)基中的總糖、還原糖、總氮、氨基氮、磷和產(chǎn)物含量等。一般根據(jù)品種的需要與可能，測(cè)定其中若干項(xiàng)目。發(fā)酵周期因品種不同而異，大多數(shù)微生物發(fā)酵周期約為2～8d，但也有少于24h或長(zhǎng)達(dá)兩周以上的。22四、產(chǎn)物提取

發(fā)酵完成后得到的發(fā)酵液是一種混合物，其中含有表達(dá)的目的產(chǎn)物外，還有殘余的培養(yǎng)基、微生物代謝產(chǎn)物的各種雜質(zhì)和微生物的菌體等。提取過程包括以下三個(gè)方面：①發(fā)酵液的預(yù)處理和過濾;②提取;③精制.23第四節(jié)發(fā)酵方式

在制備大量微生物菌體或其代謝產(chǎn)物時(shí)，可采用不同的發(fā)酵方式。微生物的發(fā)酵方式可分為分批發(fā)酵、補(bǔ)料分批發(fā)酵和連續(xù)發(fā)酵。一、分批發(fā)酵二、補(bǔ)料分批發(fā)酵三、連續(xù)發(fā)酵24第五節(jié)發(fā)酵工藝控制（1）一、培養(yǎng)基的影響及其控制1、碳源2、氮源3、無機(jī)鹽和微量元素4、水二、溫度的影響及其控制1、影響發(fā)酵溫度變化的因素⑴生物熱⑵攪拌熱⑶蒸發(fā)熱⑷輻射熱2、溫度的選擇也控制⑴最適溫度的選擇⑵溫度的控制25第五節(jié)發(fā)酵工藝控制（2）三、溶解氧的控制1、溶氧的影響2、發(fā)酵過程的溶氧的變化3、溶氧濃度的控制四、pH的影響極其控制1、pH對(duì)發(fā)酵的影響2、pH的變化3、發(fā)酵pH的確定和控制⑴發(fā)酵pH的確定⑵pH的控制26第六節(jié)發(fā)酵產(chǎn)物的提取提取過程是指將發(fā)酵液中的微生物代謝產(chǎn)物初步抽提、濃縮和純化。提取方法一般有吸附法、沉淀法、溶劑萃取法、離子交換法4種。一、吸附法利用適當(dāng)?shù)奈絼ㄈ缁钚蕴堪淄裂趸X等），在一定的pH條件下，使發(fā)酵液中的抗生素被吸附劑吸附，然后改變pH，以適當(dāng)?shù)南疵搫ㄒ话銥橛袡C(jī)溶劑）把抗生素從吸附劑上解吸下來，以達(dá)到濃縮和提純的目的，這樣的提取法稱為吸附法。如早期提取青霉素、鏈霉素、維生素B12等都曾用過吸附法。吸附法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單，原料易解決，成本較低。27二、沉淀法

沉淀法是指利用某些抗生素具有兩性的性質(zhì)，使其在等電點(diǎn)時(shí)從溶液中游離沉淀出來或在一定PH條件下，能與某些酸、堿或金屬離子形成不溶性或溶解度很小的復(fù)鹽，使抗生素從發(fā)酵濾液中沉淀析出，以及改變pH值等條件時(shí)，此種復(fù)鹽又易分解或重新溶解的特性，來提取抗生素的一種方法。

三、溶劑萃取法利用抗生素在不同的PH條件下以不同的化學(xué)狀態(tài)（游離酸、堿或成鹽狀態(tài)）存在，以及它們?cè)谒芭c水不互溶的溶劑中溶解度不同的特征，使抗生素從一種液體轉(zhuǎn)移到另一種液體中去，以達(dá)到濃縮和提純的目的。

四、離子交換法利用某些抗生素能解離為陽(yáng)離子或陰離子的特性，使其與離子交換樹脂進(jìn)行選擇性交換作用，再用洗脫劑（一般為酸、堿或有機(jī)溶劑）從樹脂上將抗生素洗脫下來，已達(dá)到濃縮和提純的目的。28第七節(jié)發(fā)酵設(shè)備

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第八節(jié)主要的發(fā)酵產(chǎn)品的研發(fā)、生產(chǎn)及發(fā)展情況

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