第二章+動物細胞培養(yǎng)

第二章動物細胞培養(yǎng)動物細胞培養(yǎng)概述培養(yǎng)細胞生物學動物細胞培養(yǎng)實驗室的設置及設備動物細胞培養(yǎng)用液及細胞培養(yǎng)液動物細胞培養(yǎng)的準備工作動物細胞培養(yǎng)的基本技術培養(yǎng)細胞的凍存、復蘇及運輸?shù)谝还?jié)動物細胞培養(yǎng)概述一、動物細胞培養(yǎng)簡史1885年，德國動物學家Roux使雞胚髓板在溫熱的鹽水中存活了數(shù)天。這是首次對動物外植塊進行體外培養(yǎng)的報道。1887年，Arnold觀察到青蛙的白細胞可以在鹽水中存活并運動。1903年，Jolly使蠑螈的白細胞在體外存活了一個月。1907年，美國實驗胚胎學家RossHarrison將蛙胚神經(jīng)管區(qū)的小片組織植入蛙的淋巴液凝塊中。這片組織不但存活了數(shù)周之久，而且從培養(yǎng)的組織塊中長出了軸突。（這一實驗被公認為是動物組織體外培養(yǎng)技術建立的標志，Harrison也被尊稱為“組織培養(yǎng)之父”）隨后，Burrows對Harrison的方法進行了改進，以血漿凝塊代替淋巴液凝塊對動物組織塊進行體外培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)這一方法更適合于溫血動物細胞的體外生長。1912年，作為外科醫(yī)生的Carrel首次將嚴格的無菌操作技術應用到動物組織的培養(yǎng)技術中。1916年，Rous和Jones首次采用胰蛋白酶對組織塊中的細胞外基質進行消化，以獲取分離開來的細胞。上世紀40年代，青霉素、鏈霉素這兩種抗生素被添加于細胞培養(yǎng)液中，極大地降低了細胞被污染的幾率。此外，層流技術的發(fā)展使過濾空氣中的微生物成為可能。這兩項技術的發(fā)展，使動物細胞培養(yǎng)技術迅速成為一種被廣泛應用的實驗技術。1955年，Eagle研究了體外培養(yǎng)細胞所需的營養(yǎng)成分，并開發(fā)了第一種被廣泛應用的人工合成培養(yǎng)基(EagleMedium)。上世紀50年代，采用大規(guī)模動物細胞體外培養(yǎng)技術生產(chǎn)出第一種商業(yè)化的疫苗-脊髓灰質炎疫苗。此后，麻疹疫苗、流行性腮腺炎疫苗、狂犬病疫苗、風疹疫苗等也相繼問世。1975年，Kohler和Milstein將動物細胞培養(yǎng)技術與細胞融合技術相結合，創(chuàng)立了雜交瘤技術。20世紀80年代初，基因重組技術進一步推動了動物細胞培養(yǎng)技術在制藥工業(yè)中的廣泛應用（組織纖溶酶原激活劑（tissue-typeplasminogenactivator）、紅細胞生成素、重組凝血因子VIII等）。20世紀末到本世紀初，動物細胞培養(yǎng)技術與其它生物技術的結合更加緊密，并因此建立了多種生物學新技術，被廣泛應用于醫(yī)療、農業(yè)等領域。（哺乳動物體細胞核移植技術；構建人體組織、器官，轉基因動物等）轉基因技術得到了快速的發(fā)展。表2-1動物細胞培養(yǎng)簡史年代事件1885Roux將雞胚髓板保存在鹽水中1897Loeb觀察到從動物血液及結締組織中分離出的細胞可以在血清和血漿中存活1903Jolly蠑螈的白細胞在體外可以分裂1907Harrison采用懸滴培養(yǎng)法將蛙胚神經(jīng)組織培養(yǎng)于淋巴液凝塊中數(shù)周之久，并觀察到從培養(yǎng)的組織塊中長出了軸突1910Burrows成功地將雞胚細胞長期培養(yǎng)于血漿凝快中，并對有絲分裂現(xiàn)象進行了細致的觀察1911Lewis和Lewis發(fā)明了第一種液體培養(yǎng)基，這種液體培養(yǎng)基由海水、血清、胚胎浸出液、鹽及蛋白胨所組成。他們觀察到細胞部分的單層生長現(xiàn)象。1913Carrel將外科手術中嚴格的無菌操作技術應用到動物細胞的體外培養(yǎng)技術中，使細胞在體外能夠長期生長。1916Rous和Jones將胰蛋白酶用于消化貼壁的細胞，以進行傳代培養(yǎng)。1923Carrel和Baker發(fā)明了第一種專門用于細胞培養(yǎng)的容器-Carrel瓶或T瓶，他們應用顯微鏡對培養(yǎng)的細胞進行觀察。1927Carrel和Rivera開發(fā)出第一種病毒疫苗-牛痘疫苗。20世紀40年代青霉素和鏈霉素應用于細胞培養(yǎng)基中，降低了培養(yǎng)細胞被污染的幾率。1948Earle分離了小鼠的L成纖維細胞系，該細胞系的單個細胞可形成克隆。Fischer發(fā)明一種化學成分確定的培養(yǎng)基-CMRL1066.1949Enders報道，脊髓灰質炎病毒可以在體外培養(yǎng)的人胚胎細胞中生長。1952Gey建立了第一個人宮頸癌連續(xù)傳代細胞系-HeLa細胞系，Dulbecco以匯合的單層細胞為實驗材料，發(fā)明了用于檢測動物病毒的蝕斑法。1954Abercrombie觀察到體外培養(yǎng)的動物細胞具有接觸抑制現(xiàn)象。1955Eagle研究了體外培養(yǎng)細胞所需的營養(yǎng)物質，發(fā)明了第一種被廣泛應用的人工合成培養(yǎng)基-EagleMedium。1961Hayflick和Moorhead分離到人成纖維細胞(WI-38)，并且觀察到這些成纖維細胞在體外培養(yǎng)過程中不能無限增值。1965Ham發(fā)明了第一種無血清培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基可使一些種類的細胞體外生長。Harris和Watkins采用一種病毒介導人-鼠細胞融合。1975Kohler和Milstein發(fā)明了雜交瘤技術，用于生產(chǎn)單克隆抗體。1987通過體外培養(yǎng)重組的動物細胞生產(chǎn)的組織纖溶酶原激活劑進入商業(yè)化應用階段。1990通過體外培養(yǎng)重組的動物細胞生產(chǎn)的多種藥用蛋白進入臨床試驗階段（凝血因子VIII、白細胞介素2、表皮生長因子等）。1997英國Roslin研究所的Wilmut領導的研究小組通過體細胞核移植技術獲得體細胞克隆綿羊“Dolly”。2006日本Kyoto大學Yamanaka領導的研究小組將四種轉錄因子基因（Oct3/4、Sox2、c-Myc及Klf4）的cDNA序列通過病毒載體攜帶導入體外培養(yǎng)的小鼠胚胎及成體成纖維細胞中，誘導后者再程序化為可誘導的多潛能干細胞（inducedpluripotentstemcells）。2009美國食品藥品管理局批準了胚胎干細胞的臨床試驗總之，動物細胞培養(yǎng)技術已成為當今生物技術領域的一種基礎技術及基本技能，必將在未來生命科學發(fā)展的進程中扮演著越來越重要的角色。二、動物細胞培養(yǎng)的概念動物細胞培養(yǎng)（animalcellculture）：是指從動物機體中取出相關的組織，將它分散成單個細胞后，模擬動物體內的生理條件，在體外無菌、適當?shù)臏囟?、濕度、酸堿度、氣體環(huán)境及一定營養(yǎng)條件下，使其不斷地生長、增殖并維持其正常的結構和功能的一種技術。

動物器官培養(yǎng)（organculture）：是指對離體的整個器官、器官芽基或器官的一部分進行體外培養(yǎng)，構成器官的不同組織仍保持著它們原來的結構與功能，因而培養(yǎng)的器官在結構、功能上與體內相應的器官非常相近。

動物組織培養(yǎng)（tissueculture）：是指取自動物體的某種組織，不經(jīng)細胞分散處理，對組織團塊直接進行體外培養(yǎng)，組織中的細胞與其鄰近的細胞、細胞外基質仍然保持著原本的聯(lián)系，且細胞一直保持原本已分化的特征，組織的結構和功能在培養(yǎng)過程中無明顯的變化。

三、動物細胞培養(yǎng)常用術語

外植快（explant）：用于初始體外培養(yǎng)而切下的一小塊組織或器官。原代培養(yǎng)（primaryculture）：從有機體取得的材料（細胞、組織或器官）在培養(yǎng)容器培養(yǎng)到第一次傳代前，即為原代培養(yǎng)或初代培養(yǎng)。匯合（confluent）：指在培養(yǎng)容器中培養(yǎng)的細胞彼此匯合形成單層。接觸抑制(contactinhibition)：體外培養(yǎng)的正常動物細胞，在生長過程中達到相互接觸時停止分裂和運動的現(xiàn)象。傳代（passage）：將細胞從一個培養(yǎng)容器移植到另一個培養(yǎng)容器中，也稱為傳代培養(yǎng)或再培養(yǎng)（subculture）。細胞系（cellline）：原代培養(yǎng)物經(jīng)首次傳代成功后即為細胞系。如果細胞系不能繼續(xù)傳代或傳代次數(shù)有限，稱為有限細胞系（finitecellline)。如果細胞系可以連續(xù)傳代培養(yǎng)，稱為連續(xù)細胞系（continuouscellline）或無限細胞系（infinitecellline）。由原細胞系分離出的具有與原細胞系不同性狀的細胞系稱為亞系（subline）細胞株（cellstrain）：通過選擇法或克隆形成法從原代培養(yǎng)物或細胞系中獲得的具有特殊性質或標志的培養(yǎng)物稱為細胞株。如果細胞株不能繼續(xù)傳代或傳代次數(shù)有限，稱為有限細胞株（finitecellstrain)。如果細胞株可以連續(xù)傳代培養(yǎng)，稱為連續(xù)細胞株（continiouscellstrain）。由原細胞株分離出的具有原株性狀不同的細胞株稱為亞株（substrain）。克?。╟lone）：由單個細胞通過有絲分裂形成的細胞群體?？寺⌒纬陕剩╟loningefficiency）：向細胞培養(yǎng)容器內接種單細胞懸液后所形成的克隆數(shù)占接種細胞總數(shù)的百分比?？寺⌒纬陕剩?）=克隆數(shù)/接種細胞總數(shù)×100%集落形成率（platingefficiency）：細胞接種到培養(yǎng)容器內所形成的集落數(shù)占接種細胞總數(shù)的百分比。如果能夠肯定每個集落均起源于單個細胞，則可使用另一專業(yè)術語-克隆形成率。集落形成率（%）=集落數(shù)/接種細胞總數(shù)×100%細胞一代時間（cellgenerationtime）：單個細胞兩次連續(xù)分裂的時間間隔。群體倍增時間（populationdoublingtime）：處于對數(shù)生長期（logarithmicphaseofgrowth）的細胞，其數(shù)目增加一倍所需的時間。例如：在此期間，細胞從1x106個細胞增加到2x106個細胞的時間間隔。貼壁依賴性（anchorage-dependent）：細胞需貼附于底物或支持物上才能生長的性質。貼壁依賴性細胞（anchorage-dependentcell）：某些種類的動物細胞在進行體外培養(yǎng)時，只有貼附于不起化學作用的惰性物體（如玻璃、塑料等）表面時，才能生存、生長并維持其功能，這種類型的細胞被稱為貼壁依賴性細胞。大多數(shù)的動物細胞均屬于此類細胞。非貼壁性（anchorage-independent）：細胞不需貼附于底物或支持物上才能生長的性質。非貼壁依賴性細胞（anchorage-independentcell）：某些種類的動物細胞在進行體外培養(yǎng)時，其生存、生長并不需要貼壁，可在培養(yǎng)液中懸浮生長，這種類型的細胞被稱為非貼壁依賴性細胞。血液、淋巴組織細胞、腫瘤細胞、雜交瘤細胞、轉化細胞系等都屬于此類細胞。貼壁率（seedingefficiency，attachmentefficiency）：一定數(shù)量的細胞接種到培養(yǎng)容器內，在一定時間內，貼壁細胞數(shù)占接種細胞總數(shù)的百分率。飽和密度（saturationdensity）：在特定培養(yǎng)條件下，每平方厘米（單層培養(yǎng)）或每毫升培養(yǎng)基（懸浮培養(yǎng)）可達到的最大細胞數(shù)。體外轉化（invitrotransformation）：細胞在體外培養(yǎng)過程中，如果在形態(tài)、抗原、增殖或其它特性方面發(fā)生了與原細胞不同的、可遺傳的變化，這種現(xiàn)象稱為體外轉化。體外惡性轉化（invitromalignanttransformation）：細胞在體外培養(yǎng)過程中獲得了致瘤性，當把這種細胞接種于適當?shù)膭游矬w內時，可產(chǎn)生腫瘤，這種現(xiàn)象稱為體外惡性轉化。四、動物細胞培養(yǎng)技術的應用

1、生產(chǎn)人畜疫苗2、新型藥物的檢測3、生產(chǎn)藥用活性蛋白4、生產(chǎn)單克隆抗體5、應用于再生醫(yī)學領域第二節(jié)培養(yǎng)細胞生物學

一、貼壁依賴性體外培養(yǎng)的動物細胞有兩種類型：貼壁依賴性細胞和非貼壁依賴性細胞。貼壁依賴性細胞①只有附著于適當?shù)墓腆w（其它細胞、膠原、玻璃或塑料）表面上才能生存、生長和增殖。一旦尚失貼壁性，表明這種細胞已發(fā)生了轉化，可能具有致瘤性（tumorogenicity）和侵襲性（invasiveness）。②一些特殊的貼壁因子及擴展因子參與細胞的貼壁過程。這些貼壁因子及擴展因子均為蛋白質，存在于細胞膜表面、培養(yǎng)基及血清之中。

③細胞的貼壁依賴性可能與位于細胞膜表面的生長因子受體（growthfactorreceptors）有關。非貼壁依賴性細胞少數(shù)動物細胞屬于非貼壁依賴性細胞，它們的生長不依賴于固體支持物表面，可在培養(yǎng)液中懸浮生長，所以也被稱為懸浮細胞。血液細胞、淋巴細胞、腫瘤細胞（包括雜交瘤細胞）和某些轉化細胞屬于此類。有些細胞對固體支持物的依賴性不嚴格，可以貼壁生長，但在一定條件下，也可以懸浮生長。如CHO細胞、小鼠L929細胞、BHK細胞等。

二、接觸抑制性①接觸抑制是體外培養(yǎng)的某些貼壁依賴性細胞的生長特征之一。②體外培養(yǎng)的貼壁依賴性細胞并不是靜止不動的，而是處于不停的活動和移動中。當兩個細胞移動到互相接觸時，雙方的運動都停止下來，繼而向其它方向移動，從而不會發(fā)生一方覆蓋于另一方之上的現(xiàn)象，這也是體外培養(yǎng)的接觸依賴性細胞只能進行單層生長的原因。③一般認為接觸抑制是細胞間的一種識別作用，與細胞膜表面的糖蛋白有關。④體外培養(yǎng)的轉化細胞或腫瘤細胞不具有接觸抑制現(xiàn)象，因而在形成單層時不會停止生長，而是相互堆積形成多層生長的聚集體。

三、培養(yǎng)細胞的形態(tài)成纖維樣細胞（fibroblast-likecell）與體內成纖維細胞形態(tài)相似，細胞體呈梭形或不規(guī)則三角形，中央有圓形核，胞質向外伸出2～3個長短不同的突起，細胞群常借原生質突連接成網(wǎng)，生長時呈放射狀、漩渦或火焰狀走行。除真正的纖維細胞外，凡由中胚層間充質來源的其它組織細胞，如血管內皮、心肌、平滑肌、成骨細胞等，也多呈成纖維細胞形態(tài)。實際上很多所謂成纖維細胞并無產(chǎn)生纖維的能力，只是一種習慣上概括的稱法。上皮樣細胞（epithelioidcell）細胞呈扁平的不規(guī)則三角形，中央有圓形核，生長時常彼此緊密連接形成單層細胞片。起源于外胚層和內胚層組織的細胞，如皮膚表皮及其衍生物（汗腺、皮脂腺等）、腸管上皮、肝、胰和肺泡上皮細胞，培養(yǎng)時皆呈上皮樣細胞。游走細胞（wonderingcell）細胞在培養(yǎng)時需要在支持物上生長，一般不連接成片，細胞胞質經(jīng)常出現(xiàn)偽足或突起，呈活躍的游走和變形運動，速度快而且方向不規(guī)則。此種類型的細胞不很穩(wěn)定，有時也難和其它型細胞相區(qū)別，在一定條件下（如培養(yǎng)基改變等），它們也可能變?yōu)槌衫w維樣細胞。

懸浮型細胞這類細胞常呈圓形，不貼附在支持物上，呈現(xiàn)懸浮狀態(tài)生長，如血液細胞、淋巴組織細胞及腫瘤細胞等。圖2-1動物細胞形態(tài)(a)成纖維樣細胞；(b)上皮樣細胞型；(c)游走細胞圖2-2牛胎兒成纖維細胞圖2-3上皮樣細胞四、培養(yǎng)細胞的生長和增殖過程1.培養(yǎng)細胞的生命期（lifespanofculturecells）培養(yǎng)細胞的生命期，是指細胞在體外培養(yǎng)過程中持續(xù)增殖和生長的時間，其長短與細胞的種類、性狀和原供體的年齡等因素有關。人胚二倍體成纖維細胞：可以傳30-50代相當于150-300個細胞增殖周期能維持一年左右的生存時間肝細胞或腎細胞：僅能傳幾代或十幾代惡性轉化細胞：可以長時間體外生長，甚至具有無限的生命期

正常的細胞在進行體外培養(yǎng)時，大致都經(jīng)歷以下三個階段：（1）原代培養(yǎng)期這一時期是指從體內取出組織接種培養(yǎng)直至第一次傳代，一般為1-4周。細胞呈活躍的移動，可見細胞分裂，但不旺盛。細胞群是異質的（Heterogeneous），即各細胞的遺傳性狀互不相同，細胞相互依存性強。如把這種細胞群稀釋分散成單細胞，在軟瓊脂培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)時，細胞克隆形成率很低，即細胞獨立生存性差。原代培養(yǎng)的細胞多呈二倍體核型。由于原代培養(yǎng)的細胞與體內原組織在形態(tài)結構和功能活動上相似性大，是檢測藥物很好的實驗對象。（2）傳代期原代培養(yǎng)細胞一經(jīng)傳代后便改稱細胞系（cellline）。在整個生命周期中，這一時期持續(xù)的時間最長。在培養(yǎng)條件較好的情況下，細胞增殖旺盛，并能維持二倍體核型，又稱二倍體細胞系（diploidcellline）。為保持二倍體細胞性質，細胞應在原代培養(yǎng)期或傳代后早期凍存。目前，常用細胞系均在十代內凍存。如不凍存，則需反復傳代以維持細胞的適宜密度，以利于生存，但可能導致細胞失掉二倍體性質或發(fā)生轉化。一般情況下，當細胞傳代30-50次后，細胞增殖逐漸緩慢，以至完全停止，細胞進入衰退期。

（3）衰退期

此期細胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖，最后衰退凋亡。

圖2-1培養(yǎng)細胞的生命期圖2-4培養(yǎng)細胞的生命期2.培養(yǎng)細胞一代的生存期所有體外培養(yǎng)細胞，包括原代培養(yǎng)細胞及各種細胞系，當生長達到一定密度后，都需做傳代處理。傳代的頻率或間隔與培養(yǎng)液的性質、接種細胞的類型、數(shù)量和細胞增殖速度等因素有關。在每一代中，細胞能倍增3-6次，其生長一般要經(jīng)歷潛伏期（latentphase）、指數(shù)增殖期（logarithmicgrowthphase）和停滯期（stagnatephase）三個階段。（1）潛伏期細胞剛接種后，呈懸浮狀態(tài)，胞體呈圓球形。接著細胞貼壁于支持物表面上。細胞的貼壁速度與細胞種類、培養(yǎng)基成分和底物的理化性質等密切相關。貼壁后的細胞經(jīng)過一個潛伏期后，才進入指數(shù)增殖期。潛伏期長短不同（與細胞代數(shù)、接種細胞密度等有關）。當細胞分裂相開始出現(xiàn)并逐漸增多時，標志著細胞已進入指數(shù)增殖期。（2）指數(shù)增值期

指數(shù)增殖期是細胞增殖最旺盛的階段。這一時期的細胞分裂相數(shù)量可作為判定細胞生長旺盛與否的一個重要標志，以細胞分裂指數(shù)（mitoticindex，MI）表示，即細胞群中每1000個細胞中的分裂相數(shù)（一般為0.1%-0.5%）。分裂指數(shù)=（處于分裂相細胞數(shù)/1000個細胞）×100%體外培養(yǎng)細胞分裂指數(shù)受細胞種類、培養(yǎng)液成分、pH值、培養(yǎng)箱溫度等多種因素的影響。這一時期一般維持3-5天，以后便會發(fā)生接觸抑制現(xiàn)象，細胞停止增殖。對于腫瘤細胞，由于接觸抑制消失，細胞可向三維空間擴展，形成多層重疊；直道培養(yǎng)液中的營養(yǎng)成分被消耗殆盡，細胞代謝產(chǎn)物不斷積累，細胞因營養(yǎng)的枯竭和代謝物的影響，發(fā)生密度抑制（densityinhibition），最終導致細胞停止增殖。（3）停滯期此時細胞數(shù)量持平，故也稱平頂期（plateauphase）。停滯期細胞雖不增殖，但仍有代謝活動，培養(yǎng)液中的營養(yǎng)成分漸趨耗盡，代謝產(chǎn)物不斷積累、pH降低。此時應進行傳代，否則細胞會因環(huán)境的惡化發(fā)生中毒、形態(tài)改變，重則細胞從底物脫落并死亡。圖2-5每代細胞的生長過程五、培養(yǎng)細胞的核型

培養(yǎng)細胞的核型一般不會發(fā)生改變，尤其是原代培養(yǎng)的細胞和早期傳代的細胞，其核型一直保持二倍體狀態(tài)。但長期的傳代可能使細胞核型發(fā)生改變。當細胞轉化成腫瘤細胞后，大多失去二倍體核型，成為多倍體或異倍體。此外，在各類培養(yǎng)細胞中，有時會見到異常的染色體，如雙著絲粒、環(huán)形染色體、長臂或短臂部分缺失等。

六、培養(yǎng)細胞的性別

體外培養(yǎng)的動物細胞，其性別一般不會發(fā)生改變。雌性動物細胞中有一條隨機失活的X染色，由這一細胞增殖產(chǎn)生的子代細胞中，對應的X染色體也會失活。七、培養(yǎng)細胞的端粒

端粒是真核細胞染色體末端特有的保護性結構，它能維持染色體末端的完整性。端粒酶是一種逆轉錄酶，它能合成端粒并連接到染色體末端，補充由于DNA復制造成的端?？s短，從而維持端粒的長度。端粒酶在正常的動物體細胞中并不表達，只在生殖細胞、干細胞和腫瘤細胞中表達。對體外培養(yǎng)的動物體細胞的研究表明，隨著傳代次數(shù)的增加，細胞的端粒長度逐漸縮短，直到一個臨界水平。此后，細胞進入衰老期，停止繼續(xù)增殖并最終衰老、凋亡腫瘤細胞之所以可以無限傳代，具有不死性，就是因為腫瘤細胞具有高端粒酶活性，保證了腫瘤細胞產(chǎn)生的子代細胞的端粒不會縮短，從而使腫瘤細胞經(jīng)長期傳代后不會出現(xiàn)衰老和凋亡現(xiàn)象。第三節(jié)細胞培養(yǎng)實驗室

一、細胞培養(yǎng)實驗室的設置

細胞培養(yǎng)實驗室與其它一般實驗室的主要區(qū)別在于要求保持無菌，避免環(huán)境中的微生物及其它有害因素對培養(yǎng)細胞的影響。一個最簡單的細胞培養(yǎng)實驗室應該劃分為三個工作區(qū)間，分別是無菌操作室、緩沖室和準備室。這三個空間要位于同一區(qū)域，彼此之間以墻或隔板隔離開來，中間僅留一個可關閉的門供實驗人員出入。不同區(qū)域對潔凈度的要求不同，配備的儀器、設備不同，其間所進行的實驗操作內容也不相同。（1）無菌操作室無菌操作室是一個細胞培養(yǎng)實驗室最核心、最重要的區(qū)域，只限于進行細胞培養(yǎng)及其它無菌操作。整體布局：①大小要適當，一般整個面積約10m2；②要求完全封閉，以防外部污濁氣體和昆蟲進入室內；③頂部不宜過高（不超過2.5m），以保證紫外線的有效滅菌效果；④地面、墻壁光滑無死角，以便清潔和消毒；⑤工作臺要求表面光滑、易于清洗，液體不易滲漏，并能抗實驗室常用的各種消毒劑的腐蝕；⑥與外界應有傳遞物品的小窗。高潔凈度：空氣的高潔凈度是一個無菌操作室最基本的要求。為此，①外界的空氣最好采用先進的層流凈化系統(tǒng)凈化后，再通入無菌操作室?？諝鉂崈舳确譃椴煌募墑e（見表2-2）。當無菌操作室的空氣潔凈度達到100級時，可在工作臺上直接進行無菌操作；當潔凈度達不到100級時，需在超凈工作臺內進行無菌操作，因為大多數(shù)的超凈工作臺只可達到100級潔凈度。②無菌操作室還應配備紫外燈。③臭氧消毒設備：臭氧發(fā)生器通過光化學、電化學等作用可將空氣中的氧氣變成臭氧。④無菌操作室還需定期采用液體消毒劑（如75%的乙醇、0.25%的新潔爾等）對儀器、設備、工作臺表面、地面等進行消毒。最基本儀器：CO2培養(yǎng)箱及其附屬設備CO2鋼瓶、超凈工作臺（如果無菌操作室的空氣潔凈度達到100級時，則不需此設備）、顯微鏡（如：普通倒置顯微鏡、帶有熒光系統(tǒng)的倒置顯微鏡、實體顯微鏡等）、恒溫水浴鍋、離心機、移液槍等。此外，無菌操作室中還應放置一定數(shù)量的細胞培養(yǎng)所需耗材（如：各種類型已銷毒的培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、培養(yǎng)板、塑料槍頭、封口膜等）。

表2-2空氣潔凈度標準與級別潔凈度級別塵埃最大允許數(shù)/立方米微生物最大允許數(shù)≥0.5μm≥5μm浮游菌/立方米沉降菌/皿10035000511000035000020001003100000350000020000500103000001050000060000NA15圖2-6無菌室（2）緩沖室緩沖室位于更衣室與無菌操作室之間，如整個細胞培養(yǎng)室的面積較小，可將緩沖室的前端作為更衣室。緩沖室的主要作用是對由外界進入無菌操作室的空氣進行緩沖，防止外界空氣中的塵埃粒子、微生物等隨著實驗人員的出入而直接進入無菌操作室，保證無菌操作室的潔凈度。進入無菌操作室的所有人員都須在更衣室內更換無菌操作室專用的實驗服、拖鞋、實驗帽和口罩。實驗室應對上述物品定期進行消毒，并嚴禁實驗人員穿著上述服裝離開無菌區(qū)。有條件的實驗室可在更衣室與緩沖室之間設立風淋室。準備進入無菌操作室的實驗人員，其體表的灰塵可被風淋室的強風吹落。緩沖室和更衣室也應該安裝層流凈化系統(tǒng)、紫外燈或臭氧消毒設備，并定期采用上述設備及液體消毒劑進行消毒。（3）準備室準備室主要用于細胞培養(yǎng)的各種準備工作，如：培養(yǎng)器皿的清洗、包裝、滅菌、干燥，超純水的制備，試劑的稱量，溶液的配制等?？傊恍锜o菌條件下進行的其它操作都應在準備室內進行。準備室可以是一個大間，上述的所有操作可在同一室內進行；如有條件，最好分隔成若干個小間，不同性質的操作分別在不同的小間內進行，如：試劑的稱量、溶液的配置專門置于一室，器皿的洗滌、包裝等置于另一室。除無菌操作室的儀器、設備外，細胞培養(yǎng)所需的其它儀器、設備都放置在準備室，包括：水純化裝置、干燥箱、烘箱、冰箱、液氮罐、天平、高壓滅菌鍋、濾器等。準備室應寬敞、通風、采光良好，但無需高潔凈度，因而也不需安裝層流凈化系統(tǒng)、紫外燈等消毒設備。二、細胞培養(yǎng)實驗室的設備與儀器

（1）CO2培養(yǎng)箱CO2培養(yǎng)箱可為體外培養(yǎng)的動物細胞提供一個適宜的溫度、濕度，防止細胞培養(yǎng)過程中培養(yǎng)液水分的蒸發(fā)及pH值的變化。溫度、濕度及CO2濃度是CO2培養(yǎng)箱控制的三個參數(shù)。

溫度體外培養(yǎng)的動物細胞，其溫度要與動物的體溫一致，大多數(shù)哺乳動物的體溫都在37℃左右。培養(yǎng)細胞對溫度的變化非常敏感，相對來說，它們耐受低溫的能力較耐受高溫的能力強。

CO2培養(yǎng)箱的加熱系統(tǒng)可分為兩種，分別是氣套式（加溫速度快，保溫性差）加熱和水套式（加溫速度慢，保溫性好）加熱。濕度培養(yǎng)箱內的高濕度可防止培養(yǎng)液水分的大量蒸發(fā)，避免因此造成培養(yǎng)液中各成分濃度的上升。目前，大多數(shù)二氧化碳培養(yǎng)箱通過增濕盤的蒸發(fā)作用產(chǎn)生濕氣，其產(chǎn)生的相對濕度可達95%左右。增濕盤中應加添加超純水，并經(jīng)常檢查水位，防止蒸干；此外，增濕盤中的超純水應定期徹底更換，防止一些微生物在其中滋生。CO2濃度CO2培養(yǎng)箱可控制箱體內CO2的濃度。大多數(shù)動物細胞培養(yǎng)需要的氣體環(huán)境為95%的空氣和5%的CO2。這是因為大多數(shù)動物細胞培養(yǎng)液中含有NaHCO2，通過HCO3-/CO2緩沖系統(tǒng)維持其pH值（一般為pH7.2～7.4）的恒定。該緩沖系統(tǒng)必須在含有5％CO2的氣體環(huán)境中才能補償外溢的CO2，以防止培養(yǎng)液的堿化。大多數(shù)的CO2培養(yǎng)箱配備有濾菌或殺菌裝置，如：通過空氣過濾器濾掉進入箱體空氣中的微生物、通過紫外燈照射滅菌、采用高溫干熱或高溫濕熱方式滅菌等。須定期采用上述滅菌方式對CO2培養(yǎng)箱進行徹底滅菌，防止微生物的污染。圖2-7CO2培養(yǎng)箱圖2-7CO2培養(yǎng)箱（2）顯微鏡細胞培養(yǎng)實驗室應至少配備兩臺顯微鏡，一臺連續(xù)變倍實體顯微鏡，用于顯微鏡觀察下的一些細微操作，如：一些微小組織的采集、分離等；一臺放大倍數(shù)較大的倒置顯微鏡，用于對培養(yǎng)的細胞進行細致的觀察。有條件的實驗室還可配備一些其它類型的顯微鏡，如：相差顯微鏡，可以直接觀察到細胞的輪廓和形狀；熒光顯微鏡，用于觀察經(jīng)熒光染料染色后的細胞。此外，還應配備一些照相或攝像系統(tǒng)，以便對細胞進行拍攝、記錄。

圖2-8連續(xù)變倍實體顯微鏡圖2-9倒置熒光顯微鏡（3）超凈工作臺超凈工作臺（flowcleanbench）是一種局部凈化設備，利用空氣潔凈技術使一定操作區(qū)內的空間達到相對的無塵、無菌狀態(tài)。超凈工作臺根據(jù)氣流的方向可分為垂直流超凈工作臺和水平流超凈工作臺，根據(jù)操作結構和大小可分為單人單面、單人雙面、雙人單面及雙人雙面四種形式，按其用途又可分為普通超凈工作臺和生物（醫(yī)藥）超凈工作臺。當無菌操作室達不到百級潔凈度時，所有的無菌操作都應在超凈工作臺內進行。此外，在配液室也應該放置一臺超凈工作臺，以便在無菌條件下配制各種細胞培養(yǎng)用液。圖2-10超凈工作臺圖2-10超凈工作臺（4）消毒滅菌設備細胞培養(yǎng)用的所有液體和器具在使用前都須滅菌。根據(jù)液體的不同成分、器具的不同質地，可采用不同的設備、方法對其進行消毒、滅菌。

干燥箱干燥箱既可用于對一些金屬、玻璃器具等進行干熱滅菌，也可用于對濕熱滅菌后的器具進行烘干。

使用干燥箱對玻璃器具進行滅菌時，需要注意的一點是：高溫滅菌后不能立即打開箱門，以免玻璃器具突然遇冷而爆裂，應等溫度下降到100℃時方可打開箱門。

圖2-11電熱鼓風干燥箱高壓滅菌鍋

高壓滅菌鍋是通過將水加熱至沸騰后產(chǎn)生的高溫、高壓水蒸氣對一些液體、器具等進行濕熱滅菌。目前所用的高壓滅菌鍋大多是全自動高壓滅菌鍋，可以預先設定滅菌溫度、滅菌壓力和滅菌時間三個參數(shù)。三個參數(shù)一般設定為：120℃、0.1MPa、30min。滅菌之前，需檢查滅菌鍋中的水位是否合適，以沒過筒底為宜。如果水位過低，則需加入適量的去離子水（可以防止過多水垢的形成）；但水位不能過高，否則待滅菌器具會被水浸沒，難以烘干。放入待滅菌器具后，須將滅菌鍋蓋子擰緊，否則，壓力上升后會漏氣，并造成一定的危險。隨后，打開電源開關和排氣閥，使鍋內的冷空氣排出；當溫度上升到90℃以上時，關閉排氣閥，溫度和壓力會迅速上升；當腔內壓力超過個額定壓力（一般為0.15Mpa）時，安全閥會自動打開，釋放過高的壓力，當壓力下降到額定壓力以下后，排氣閥自動關閉；如此反復，直到整個滅菌過程結束。

滅菌結束后，切記不能馬上打開滅菌鍋蓋子，因為腔內壓力很高，此時打開會有一定的危險，只有等腔內沒有正壓時，方可打開。此外，滅菌剛結束后，不能為了快速釋放腔內壓力而將排氣閥打開，尤其腔內有滅菌的液體時，壓力的快速下降會使液體從容器內噴出。只有當滅菌鍋的溫度低于100℃時，才可打開排氣閥放氣。圖2-12高壓鍋濾器濾器主要用于對含有蛋白質、維生素、激素等生物活性成份的液體進行滅菌。目前，常用的濾器有Zeiss濾器、玻璃漏斗式濾器和微孔濾膜濾器等。各種類型濾器的工作原理相同，即通過正壓或負壓使液體通過不同孔徑的濾膜，從而使液體中的微生物被過濾掉。在過濾前，須將濾膜安裝到濾器上，然后，將安裝有濾膜的濾器采用高壓滅菌鍋進行滅菌，隨后，將濾器烘干，即可對液體進行過濾滅菌。市售的濾膜分為不同的直徑和不同的孔徑，如：濾膜直徑可為13mm、25mm、33mm等，孔徑可為0.45μm、0.22μm等。細胞培養(yǎng)用液須經(jīng)0.22μm孔徑的濾膜過濾后方可使用，因為這一孔徑的濾膜可以將幾乎所有類型的微生物（不能除去支原體）都過濾掉。濾膜直徑的選擇要根據(jù)濾器的大小決定。在采用濾器進行滅菌時，首先要檢查滅菌后的濾膜是否破損。以微孔濾膜濾器為例，先用微量液體將濾膜浸濕，然后將一個吸有一定量空氣的注射器安裝到濾器上，輕輕推壓注射器活塞到某一刻度，松手后，注射器活塞可以回到原刻度，則表明濾膜完好無損；否則，濾膜已破損，不能用于過濾滅菌。圖2-13針孔式濾器（5）水純化設備必須采用超純水配制細胞培養(yǎng)用的各種液體，因為普通自來水中含有各種無機鹽離子及一些有機分子，配制的溶液中各種成分的濃度會發(fā)生變化，不利于細胞的生長和增值。不同的水純化設備制備的水的質量不同，主要分為去離子水、雙蒸水和超純水。去離子水裝置去離子水裝置采用離子交換樹脂吸附水中的陰陽離子，制備出的水為無離子水。但水中有機分子等無法去處，不能用于配制細胞培養(yǎng)用液，須進一步處理成雙蒸水或超純水后才能用于配置細胞培養(yǎng)用液。蒸餾裝置目前，細胞培養(yǎng)實驗室較常用的蒸餾裝置是自動雙重純水蒸餾器。此裝置是通過石英加熱管使水蒸發(fā)，產(chǎn)生的水蒸氣經(jīng)冷卻管冷卻后形成一蒸水；一蒸水經(jīng)另一加熱管再次加熱，冷卻管冷卻后形成二蒸水。

超純水裝置

超純水裝置一般可以將水的純化過程分為四大步驟，分別是預處理（初級凈化）、反滲透（生產(chǎn)出純水）、離子交換（可生產(chǎn)出電阻率為18.2MΩ.cm的超純水）和終端處理（生產(chǎn)出符合特殊要求的超純水）。采用超純水裝置處理的水最好是雙蒸水，這樣可以避免經(jīng)常更換耗材，特別是超純化柱。此外，預處理耗材（價格相對低很多）的及時更換對超純純水裝置的長期穩(wěn)定運行，保護核心部件相當重要。圖2-14雙蒸水裝置圖2-15超純水儀（6）

冷藏及冷凍設備細胞培養(yǎng)實驗室的許多試劑、溶液都需在4℃或-20℃條件下保存，如一些固態(tài)的蛋白、酶、激素、培養(yǎng)基等，液態(tài)的細胞培養(yǎng)液、各種緩沖液等，都須在4℃條件下存放；各種酶溶液、血清等則須在-20℃條件下存放。此外，短期冷凍保存的細胞須在-70℃條件下保存，而長期冷凍保存的細胞則需在-196℃的液氮中保存。因此，細胞培養(yǎng)實驗室應配備不同類型的冷藏或冷凍設備，供不同溫度下試劑、溶液及細胞的冷藏或冷凍。普通冰箱

細胞培養(yǎng)實驗室必須配備一臺普通冰箱，其中冷藏室（4℃）用于存放一些固體的、具有生物學活性的試劑，如：血清白蛋白、胰蛋白酶、細胞培養(yǎng)基等；大多數(shù)溶液也應在冷藏室中存放，如：細胞培養(yǎng)液、PBS液、Hanks液等。冷凍室（-20℃）主要用于存放一些酶溶液、血清等。冰箱應保持清潔，不得存放易揮發(fā)、易燃物質。超低溫冰箱有條件的實驗室可以配備一臺超低溫冰箱（-70℃～-80℃），用于細胞及一些微生物菌種的短期冷凍保存。液氮罐采用超低溫冰箱只可以短期（一般為幾個月）冷凍保存細胞。長期冷凍保存的細胞必須置于-196℃的液氮中。因而，細胞培養(yǎng)實驗室必須配備一個液氮罐，用于細胞的長期冷凍保存。在向液氮罐中取放細胞時，要防止被液氮凍傷。由于液氮不斷揮發(fā)，應注意觀察存留液氮的情況，及時定期補充液氮，避免因液氮揮發(fā)過多而導致冷凍細胞受損。圖2-16超低溫冰箱圖2-17液氮罐（7）離心機細胞的傳代、洗滌等操作過程都需要離心機。動物細胞的離心一般采用的轉速為1000rpm，離心5min，離心速度過快對細胞具有一定的損傷作用。因此，細胞培養(yǎng)實驗室必須配備一臺轉速可調的低速常溫離心機。可根據(jù)培養(yǎng)細胞的規(guī)模選定離心機的容量及不同型號的轉子。如需在低溫條件下離心細胞，還需配備一臺冷凍（低溫）離心機，可設置離心時的溫度，但在離心之前，需預先開機制冷。在使用離心機時，須注意離心管的平衡，否則可能造成離心機的損壞。有些類型的離心機具有自動平衡功能，使用時不需考慮平衡問題。圖2-18常溫離心機圖2-19冷凍（低溫）離心機（8）天平各種培養(yǎng)液、緩沖液、消化液的配制都離不開天平。細胞培養(yǎng)實驗室的天平需要有很高的精密度，一般應達到萬分之一克。天平的性能及工作狀態(tài)直接關系到細胞培養(yǎng)的成功與否。因此，需注意天平的維護與保養(yǎng)。①最好有一個專門的稱量室用于放置天平和試劑的稱量；②天平應置于穩(wěn)定的工作臺上避免振動、氣流及陽光照射；③使用前，須對天平進行校準，調整水平儀氣泡至中間位置；④稱量易揮發(fā)和具有腐蝕性的物品時，要盛放在密閉的容器中，以免腐蝕和損壞天平；⑤不可過載使用以免損壞天平。⑥此外，還應經(jīng)常對電子天平進行自?；蚨ㄆ谕庑＃ＷC其處于最佳狀態(tài)。圖2-20電子分析天平（9）移液器移液器也被稱為移液槍，主要用于少量或微量液體的轉移，還可用于吹打離心沉淀的細胞，使其懸浮。移液器主要有兩種類型，分別為單道和多道移液器。單道移液器一次只能進行一個孔的加樣工作；而多道移液器一次可進行多孔的加樣工作，因而也被稱為“排槍”。大多數(shù)移液器的量程是可調的，但切忌將量程調節(jié)旋鈕旋出量程，這樣會卡住內部機械裝置而損壞了移液器；如不使用，要把移液器的量程調至最大值的刻度，使彈簧處于松弛狀態(tài)以保護彈簧。

圖2-21移液器（10）細胞培養(yǎng)用耗材培養(yǎng)瓶細胞培養(yǎng)瓶由玻璃或塑料制成。進行細胞培養(yǎng)時培養(yǎng)瓶瓶口加蓋螺旋瓶蓋或膠塞，膠塞多用于密封培養(yǎng)。國產(chǎn)培養(yǎng)瓶的規(guī)格以容量（ml）表示，如250ml、100ml、25ml等；進口培養(yǎng)瓶則多以底面積（cm2）表示。培養(yǎng)瓶的瓶口較小，因而培養(yǎng)細胞不容易被污染，但操作不方便。培養(yǎng)皿培養(yǎng)皿也分為玻璃培養(yǎng)皿和塑料培養(yǎng)皿兩種類型，一般以直徑表示其大小，常用的規(guī)格有100mm、90mm、60mm、35mm等。培養(yǎng)皿的優(yōu)缺點與培養(yǎng)瓶正好相反，由于開口較大，操作較為方便，但操作過程中容易受到污染。培養(yǎng)板培養(yǎng)板為塑料制品。其優(yōu)點是節(jié)約樣本及試劑，可同時測試大量樣本，易于進行無菌操作。培養(yǎng)板分為各種規(guī)格，常用的規(guī)格有：96孔、48孔、24孔、12孔、6孔、4孔等。血清瓶血清瓶主要用于存放各種細胞培養(yǎng)用液體，如培養(yǎng)液、血清、消化液、緩沖液等。血清瓶分為各種不同規(guī)格，如250ml、200ml、100ml、50ml等。離心管離心管分為塑料和玻璃兩種類型，用于對細胞進行離心沉降。要根據(jù)細胞培養(yǎng)液的容量及離心機的轉子選用不同規(guī)格的離心管，常用的規(guī)格有50ml、10ml、5ml等。細胞凍存管細胞凍存管能耐受超低溫，用于細胞和組織的長期超低溫冷藏。凍存管有多種規(guī)格，常用的有2ml及1.8ml兩種。不同類型的凍存管能夠耐受不同程度的低溫，因根據(jù)凍存設備選用不同類型的凍存管。凍存管一般為平底圓柱形，上有帶有螺絲扣的蓋子，管體一般印有精確的刻度和空白標簽區(qū)，方便實驗過程的記錄。移液槍吸頭移液槍吸頭為移液器配套耗材，均為一次性塑料制品。要根據(jù)吸取溶液的多少及移液槍的型號選用不同規(guī)格的移液槍吸頭，常用的有100～1000

l、10～200

l、0.1～10

l。圖2-22細胞培養(yǎng)用耗材培養(yǎng)瓶培養(yǎng)板培養(yǎng)皿圖2-22細胞培養(yǎng)用耗材血清瓶圖2-22細胞培養(yǎng)用耗材圖2-22細胞培養(yǎng)用耗材各種規(guī)格離心管細胞凍存管圖2-22細胞培養(yǎng)用耗材（11）其它器具細胞培養(yǎng)實驗室還應配備一些常規(guī)實驗器具，如不同規(guī)格的注射器、燒杯、量筒以及漏斗，用于存放小件培養(yǎng)物品便于高壓消毒的鋁制飯盒，存放酸液的酸缸，超凈工作臺使用的酒精燈，供實驗人員操作前清潔消毒手使用的盛有酒精或其他消毒液的微型噴壺等。第四節(jié)動物細胞培養(yǎng)用液

對動物細胞進行體外培養(yǎng)，需要用到多種類型的液體。其中最主要的一種液體是為細胞的生長、增值提供必需營養(yǎng)成分的細胞培養(yǎng)液。在細胞的傳代、冷凍過程中還需用到平衡鹽溶液、消化液及細胞冷凍液。此外，還包括用于調節(jié)溶液酸堿度的pH值調整液；添加于細胞培養(yǎng)液中，防止培養(yǎng)細胞受到微生物污染的抗菌素液。

一、平衡鹽溶液

平衡鹽溶液（balancedsaltsolution，BSS）主要是由無機鹽和葡萄糖組成，其中無機離子是細胞生命的必要成分；在維持滲透壓、緩沖和調節(jié)溶液pH方面也起著重要作用。Ca2+、Mg2+能為酶系統(tǒng)的活化提供條件，也是細胞膜的重要組成成分。葡萄糖等可為細胞代謝提供能量。BSS內還含有少量的酚紅，作為pH變化的指示劑，溶液變酸性時呈黃色，變堿性時呈紫紅色，中性時呈桃紅色。目前最常用的BSS是Hanks液、Eagle液和PBS等。在細胞培養(yǎng)中，BSS用途如下：（1）作為配制培養(yǎng)基的基礎溶液（2）配制各種試液：如配“胰酶”消化液（3）用于洗滌組織和細胞表2-3常用平衡鹽溶液配方配制要求（l）要防止鈣的沉淀：應將其中的CaC12單獨配制，并將平衡鹽溶液配成濃縮液，使其在稀釋前不讓Ca2+與PO42-和CO32-接觸，以免產(chǎn)生不溶解的Ca3(PO4)2和CaCO3。避免產(chǎn)生CaCO3的方法是將Na2CO3單獨配制，使用時現(xiàn)加。（2）要有良好的緩沖作用：Hanks液和Earle液都需一定量的CO2平衡。因此應將瓶蓋（橡皮塞）蓋緊，以防瓶中CO2逃逸，使溶液pH增高。pH調整液單獨滅菌時，亦應將瓶蓋塞緊，否則NaHCO3受熱分解為NaCO3和CO2，失去其調節(jié)pH之功能。（3）為了便于保存和減少有關成分的化學反應，平衡鹽溶液可配成20x、10x和5x濃縮液進行儲存。二、細胞培養(yǎng)液

細胞培養(yǎng)基與細胞培養(yǎng)液的含義基本相同，習慣上將固態(tài)粉末狀的稱為培養(yǎng)基，培養(yǎng)基加水配制成溶液后稱為培養(yǎng)液。根據(jù)培養(yǎng)基的來源及成分的明確程度,動物細胞培養(yǎng)基大致可分為三種，分別是天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基及無血清培養(yǎng)基。這三種類型的培養(yǎng)基也代表了培養(yǎng)基發(fā)展的三個階段。1、天然培養(yǎng)基（1）血清血清是由血漿去除纖維蛋白后形成的一種復雜的混合物，其組成成份雖大部分已知，但還有一部分尚不清楚，且血清的組成及含量會隨供血動物的種類、性別、年齡、生理條件和營養(yǎng)條件的不同而不同。血清中含有各種血漿蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生長因子、激素、無機物等。這些物質可以促進細胞的生長。

動物細胞培養(yǎng)所用的血清種類很多，有胎牛血清（fetalbovineserum，F(xiàn)BS；取自剖腹產(chǎn)的胎牛）、新生牛血清（newbornbovineserum，NBS；取自出生24小時之內的新生牛）、小牛血清（bovineserum，BS；取自出生10～30天的小牛）、成年牛血清（adultbovineserum，ABS；取自出生3～6月的青年牛）、馬血清（horseserum）、兔血清（rabbitserum）、雞血清（chickenserum）、羊血清（sheeporgoatserum）及人血清（humanserum）。牛血清適合絕大多數(shù)哺乳動物細胞的體外培養(yǎng)，且制備技術成熟、來源充足、相對于其它動物血清價格較低，因而是動物細胞培養(yǎng)中應用最為廣泛的一種血清。在培養(yǎng)某些特殊細胞時，也使用其它動物的血清。血清在使用前應作滅活處理（在56℃水浴中孵育30min），以去除血清中的補體成分，避免補體對細胞產(chǎn)生毒性作用。

血清一般儲存于-20℃，同時盡量避免反復凍融。為此，購買回來的大瓶血清經(jīng)滅活后，可根據(jù)每次的用量分裝于小的血清瓶中，置于-20℃冰箱中。血清解凍時，最好在4℃條件下使其緩慢融化。融化后的血清在4℃下不宜長時間存放，應盡快使用。

合成培養(yǎng)基中血清成為一種添加成分使用，使用濃度一般為5%-20％，最常用是10％。

圖2-23胎牛血清（2）水解乳蛋白水解乳蛋白（lactalbuminhydrolysate）為乳白蛋白經(jīng)蛋白酶和肽酶水解的產(chǎn)物，含有豐富的氨基酸，是常用的天然培養(yǎng)基。使用時配制成0.5%的的溶液，可以與合成培養(yǎng)基按1:1的比例混合，可用于許多細胞系和原代細胞的培養(yǎng)。（3）胚胎浸出液胚胎浸出液（embryonicextract）是早期動物細胞培養(yǎng)中應用的一種天然培養(yǎng)基，可以明顯地刺激細胞的迅速增殖。隨著合成培養(yǎng)基的不斷改良和普遍應用，現(xiàn)已很少使用。2、合成培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基是根據(jù)天然培養(yǎng)基的成分，將不同的化學物質按一定的比例混合后，人工配制而成的。目前，被廣泛應用的合成培養(yǎng)基達10余種，每一種都有固定的配方，并且均已成為標準化的商品出售，合成培養(yǎng)基雖然包含幾十種成分，但僅能維持細胞短期的體外生存，在使用時，必須添加一定比例的血清。自問世以來，合成培養(yǎng)基經(jīng)歷了幾個階段的發(fā)展，從最初的基本培養(yǎng)基發(fā)展到無血清培養(yǎng)基以及無血清、無蛋白培養(yǎng)基（又稱雙無培養(yǎng)基），并且還在不斷發(fā)展中。（1）基本組分合成培養(yǎng)基主要包括四大類物質，分別是無機鹽、氨基酸、維生素及糖類。某些種類的合成培養(yǎng)基還包括其它成分，如抗氧化劑、核酸降解物等。無機鹽：不同種類的合成培養(yǎng)基中含有的無機鹽種類不同，這些無機鹽主要起著三個方面的作用。①無機鹽可以為細胞的生長、增殖提供必須的無機鹽離子，如Na+、K+、Ca2+、Mg2+等。②無機鹽可以調節(jié)細胞培養(yǎng)液的滲透壓。③某些種類的無機鹽具有緩沖作用，可以調節(jié)并維持細胞培養(yǎng)液的酸堿度，如NaHCO3、NaH2PO4、Na2HPO4、KH2PO4。氨基酸：不同種類的合成培養(yǎng)基中都含有8種必需氨基酸（纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸、蘇氨酸、賴氨酸）以及12種非必需氨基酸中的絕大多數(shù)。這些氨基酸是細胞合成蛋白質的原料。各種合成培養(yǎng)基中都含有谷氨酰胺，這種氨基酸對體外培養(yǎng)的細胞特別重要，細胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白質。谷氨酰胺的缺乏可導致細胞生長不良甚至死亡。值得注意的是：谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定，4℃下放置1周即可分解50%。因此，超過兩周以上的細胞培養(yǎng)液應補加原劑量的谷氨酰胺。最好單獨配制谷氨酰胺濃縮液，置于-20℃冰箱中保存，用前融解，補加到細胞培養(yǎng)液中。維生素：是維持細胞生長的生物活性物質，對細胞的代謝起調控作用。在細胞培養(yǎng)中，盡管血清是維生素的重要來源，但是許多培養(yǎng)基中都添加了各種維生素，尤以添加水溶性的B族維生素最為常見，因為B族維生素是細胞內許多酶的輔酶及輔基。維生素C在細胞培養(yǎng)基中也是不可缺少的，尤其對具有合成膠原能力的細胞更為重要。此外，有些培養(yǎng)基中還添加有脂溶性的維生素A、D、E、K，以適合更多細胞系的生長。糖類：是既細胞的能量來源，又是細胞合成某些氨基酸、脂肪、核酸的原料。幾乎所有的培養(yǎng)基中都以葡萄糖作為必含的能源物質。此外，丙酮酸鈉可作為培養(yǎng)基中的替代能量物質。盡管細胞更傾向于以葡萄糖作為能量物質，但是，在葡萄糖缺乏的情況下，細胞也可以代謝丙酮酸鈉以獲取能量。（2）常用的合成培養(yǎng)基目前，常用的合成培養(yǎng)基包括：Eagle系列培養(yǎng)基（BasalMediumEagle，BME、MinimumEssentialMedium，MEM、Dulbecco‘sModifiedEagle’smedium，DMEM）、M199、Ham’sF-10和Ham’sF-12、RPMI-1640、McCoy’s5A培養(yǎng)基、L-15培養(yǎng)基、DMEM/F12培養(yǎng)基等。在使用合成培養(yǎng)基時需注意：不同生產(chǎn)商生產(chǎn)的同一類型培養(yǎng)基在組成成分、各種成分的含量方面可能有所不同；即使同一生產(chǎn)商生產(chǎn)的同一類型培養(yǎng)基也分為不同的型號，各種型號產(chǎn)品在組成成分及各成分含量方面也會有微小的差異，如Sigma-Alorich

的RPMI1640培養(yǎng)基，有些含有Hepes，有些則不含有該成分。因此，在使用培養(yǎng)基時應詳細閱讀產(chǎn)品說明書，了解該產(chǎn)品的成分。某些類型培養(yǎng)基的特點①Eagle系列培養(yǎng)基Eagle于20世紀50年代設計了BME（BasalMediumEagle，BME），該培養(yǎng)基適用于多種動物細胞的原代培養(yǎng)。對BME的改良使MEM（MinimumEssentialMedium，MEM）及DMEM（Dulbecco'sModifiedEagle'smedium，DMEM）得以產(chǎn)生。MEM中含有更高濃度的氨基酸，與動物蛋白的氨基酸組分接近，適于多種動物細胞的單層生長。

DMEM中的氨基酸及微生素濃度是BME中的四倍，還添加了其它一些成分。目前，商業(yè)化的DMEM培養(yǎng)基分為兩種，分別是低糖型（葡萄糖含量為1000mg/L）和高糖型（葡萄糖含量為4500mg/L）。低糖對于生長速度較快、附著性稍差的腫瘤細胞生長有利；高糖則特別適用于附著性較差但又不希望它脫離原來生長點的克隆培養(yǎng)，效果較好，所以常用于雜交瘤技術中骨髓瘤細胞和DNA轉染的轉化細胞的培養(yǎng)。

②M199M199是由Morgan和它的同事于1950年設計出來的一種合成培養(yǎng)基，特別適用于非轉化細胞的培養(yǎng)，是小鼠胰腺上皮組織、大鼠晶狀體組織原代培養(yǎng)中最常用的一種培養(yǎng)基。此外，它還被廣泛應用于病毒學、疫苗生產(chǎn)等領域。③Ham‘s營養(yǎng)混合物（Ham’sNutrientMixtures）Ham‘sF-10和Ham’sF-12都屬于Ham‘s營養(yǎng)混合物。根據(jù)培養(yǎng)細胞的類型，這兩種培養(yǎng)基既可以單獨使用，也可以添加一定濃度的血清后使用。④RPMI-1640RPMI-1640是Moore等人在20世紀60年代開發(fā)的，RPMI是他們當時工作的研究所（RoswellParkMemorialInstitute）名稱的首字母縮寫。RPMI-1640適合于人正常的或腫瘤性轉化的白細胞的培養(yǎng)；添加不同成分后，可廣泛用于多種細胞的體外培養(yǎng)，包括新鮮分離的人淋巴細胞的培養(yǎng)。⑤McCoy’s5A培養(yǎng)基1959年，McCoy及其合作者研究了體外培養(yǎng)的大鼠肝癌細胞對氨基酸的需求。在這一研究中，McCoy等人采用了一種基礎培養(yǎng)液5A（BasalMedium5A）。這一基礎培養(yǎng)液經(jīng)改良后形成了McCoy’s5A培養(yǎng)基。目前，McCoy’s5A培養(yǎng)基被廣泛應用于包括骨髓、皮膚、視網(wǎng)膜、腎、肺、脾等多種細胞的體外培養(yǎng)。⑥L-15培養(yǎng)基L-15培養(yǎng)基最大的特點在于其不以碳酸氫鈉作為緩沖體系，因而，采用該培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞時不需能夠提供CO2的培養(yǎng)設備（如CO2培養(yǎng)箱）。L-15培養(yǎng)基通過無機鹽成分、攜帶自由基的氨基酸以及半乳糖調節(jié)其pH值。當添加某些成分后，L-15培養(yǎng)基可用于多種細胞的體外培養(yǎng)，如人喉癌細胞系（HEp-2）、恒河猴腎細胞系（LLC-MK2）、胚胎組織以及人成體組織等。此外，L-15培養(yǎng)基可用于多種病毒的培養(yǎng)。⑦DMEM/F-12培養(yǎng)基DMEM/F12培養(yǎng)基是由DMEM和Ham'sF12兩種培養(yǎng)基按1:1比例混合配制而成的。該培養(yǎng)基在使用時既可以添加一定比例的血清，也可以作為無血清培養(yǎng)基的基礎培養(yǎng)基。為了避免血清濃度的降低導致培養(yǎng)液的低緩沖能力，該培養(yǎng)基中一般含有15mMHepes，以增強培養(yǎng)液的緩沖能力。圖2-24合成培養(yǎng)基3、無血清培養(yǎng)基（serumfreemedium，SFM）

在采用上述的合成培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞時，大都需要添加一定劑量的血清。血清對細胞在體外培養(yǎng)時的主要作用是提供生長因子、激素、結合蛋白，并對細胞提供保護作用。但血清的添加也會給實驗或生產(chǎn)帶來諸多的不便。自20世紀5O年代起，細胞生物學家們開始研究血清中的各種成分在細胞培養(yǎng)中的作用，以期尋找合適的補充因子替代培養(yǎng)液中的血清。1976年，Hayashi及其同事首次報道采用無血清培養(yǎng)基成功培養(yǎng)大鼠垂體細胞系GH3。他們使用的培養(yǎng)基中雖然不含有血清，但添加了生理濃度的四種激素（三碘甲狀腺素、促甲狀腺激素釋放激素、甲狀旁腺素及生長調節(jié)素）和轉鐵蛋白（transferrin））。這一成果表明了采用無血清培養(yǎng)基體外培養(yǎng)細胞的可行性。此后，無血清細胞培養(yǎng)技術得到了迅速的發(fā)展，至今已有許多細胞系能夠在無血清培養(yǎng)基中成功生長和增殖，無血清培養(yǎng)基也達幾十種之多。

無血清培養(yǎng)基就是在合成培養(yǎng)基的基礎上，引入成分完全明確的或部分明確的血清替代成分，使培養(yǎng)基能滿足動物細胞培養(yǎng)的要求，又可有效的克服因使用血清所引發(fā)的諸多問題。

無血清培養(yǎng)基=基礎培養(yǎng)基+能替代血清的補加成份基礎培養(yǎng)基：最常用的就是DMEM/F12培養(yǎng)基，許多無血清培養(yǎng)基的研究均以該培養(yǎng)基作為基礎培養(yǎng)基。此外，許多生物試劑公司還開發(fā)出多種類型的適用于無血清培養(yǎng)的基礎培養(yǎng)基，但這些培養(yǎng)基的針對性都很強，一種無血清培養(yǎng)基一般僅適合某一類細胞的培養(yǎng)。補加成份：一般包括激素、生長因子、金屬離子轉移蛋白、細胞黏附因子、細胞結合蛋白、促細胞分裂原、酶抑制劑及微量元素等。

三、其它用液

1、細胞分離液（消化液）常用的細胞分離液有胰蛋白酶（0.25%）和二乙胺四乙酸二鈉（EDTA）（0.02%）的混合液，它們在制備原代細胞時可消化組織、分散細胞，在傳代細胞時使細胞脫離生長表面（瓶壁）和使細胞團離散成單個細胞。在配制消化液時，需要采用D-Hanks（不含Ca2+、Mg2+）配制。2、pH調整液常用的pH調整液是NaHCO3、HEPES等。（1）NaHCO3：常用的濃度有7.4％、5.6％、3.7％。配制時用三蒸水溶解后，濾過除菌，分裝小瓶，蓋緊瓶塞，于4℃或室溫保存。調節(jié)pH時，NaHCO3要逐滴加入，并不時搖動培養(yǎng)液，以防止加入過量。當pH值過高后，可用滅菌的10％醋酸溶液或通入CO2氣體調節(jié)。（2）HEPES：全稱為（N－2－oxyethylpiperazineN’-2-ethanesulfonicacid，N-2-羥乙基哌