幾種保護氨基酸和賴氨酸的合成及性能研究

幾種保護氨基酸和賴氨酸的合成及性能研究

對于高產(chǎn)牛來說，微生物蛋白和非分解蛋白的氨基酸是不夠的。灌注試驗證明,大多數(shù)情況下,奶牛第一、二限制性氨基酸為蛋氨酸和賴氨酸,需要補充能夠在小腸吸收的滿足奶牛代謝需要的蛋氨酸和賴氨酸,但日糧中直接補充游離蛋氨酸和賴氨酸大部分會在瘤胃中被降解,導(dǎo)致進入小腸的蛋氨酸和賴氨酸減少;通過真胃和十二指腸灌注,給奶牛帶來很大的負擔(dān)和應(yīng)激,并且也不適合于生產(chǎn)。研制過瘤胃保護蛋氨酸和賴氨酸產(chǎn)品對奶牛氨基酸營養(yǎng)深入研究有重要意義。本研究利用4種材料包被蛋氨酸和賴氨酸,并對其穩(wěn)定性進行了體外和尼龍袋兩種方法的檢驗,篩選出穩(wěn)定性好的瘤胃保護蛋氨酸和賴氨酸各一種,并觀測體外法與尼龍袋法測定結(jié)果的差異及分析體外法代替體內(nèi)法的可能性。1材料和方法1.1日糧營養(yǎng)水平選用4頭裝有永久性瘤胃和十二指腸瘺管的荷斯坦干乳牛。日喂兩次(08:00和20:00),日糧組成:玉米10.60%,豆粕3.64%,麥麩3.00%,棉粕2.00%,石粉0.20%,磷酸氫鈣0.20%,食鹽0.16%,預(yù)混料0.20%,羊草60%,苜蓿干草20%。日糧營養(yǎng)水平:NEL5.1757MJ/kg,CP13.12%,鈣0.8127%,磷0.3293%。每次飼喂精料2kg,羊草6kg,苜蓿草2kg,自由飲水。1.2化學(xué)試劑及試劑DL-蛋氨酸由日本住友化學(xué)株式會社提供(含量99%),L-賴氨酸鹽酸鹽由泰國味之素有限公司提供(含量98.5%),丙烯酸樹脂Ⅳ號由上海浦力膜制劑輔料科技合作公司提供,乙基纖維素由國藥集團化學(xué)試劑有限公司提供,氫化植物油由上海赫力斯特化工有限公司提供,羥丙基甲基纖維素由山東聊城阿華制藥有限公司提供。保護蛋氨酸由丙烯酸樹脂Ⅳ號,丙烯酸樹脂Ⅳ號和乙基纖維素,丙烯酸樹脂Ⅳ號和乙基纖維素及羥丙基甲基纖維素,乙基纖維素,丙烯酸樹脂Ⅳ號和氫化植物油,氫化植物油分別包被,形成產(chǎn)品M1、M2、M3、M4、M5、M6。保護賴氨酸由丙烯酸樹脂Ⅳ號和乙基纖維素,丙烯酸樹脂Ⅳ號和羥丙基甲基纖維素,丙烯酸樹脂Ⅳ號和氫化植物油,乙基纖維素和氫化植物油包被形成產(chǎn)品L1、L2、L3、L4。1.3測試方法1.3.1緩沖液對氮的釋放率測定體外試驗方法根據(jù)Papas等提供的方法進行,準(zhǔn)確稱取1.0g產(chǎn)品放入50mL具塞試管底部,分別加入20mLpH6.6、pH2.4的緩沖液,蓋緊試管塞,在39℃恒溫水浴鍋內(nèi)消化0、4、8、24、48h,過濾,凱氏定氮法測定溶液中氮含量,以氮的消失率計算釋放率。1.3.2瘤胃投入量準(zhǔn)確稱取3g產(chǎn)品放入12cm×8cm尼龍袋中(孔徑為35～50μm),于晨飼時投入瘤胃,每頭牛12個袋。放置后于4、8、24、48h取出尼龍袋,每一種保護性氨基酸每個時間點4個重復(fù),取出尼龍袋后用中等流速的自來水沖洗干凈,烘干,稱重,用凱氏定氮法測定尼龍袋中殘留的氮含量,以氮的消失率計算釋放率。1.3.3剩余樣品的釋放率測定真胃和小腸釋放率根據(jù)Rossi等采用的移動尼龍袋法進行,將1g樣本放入6cm×2.5cm小尼龍袋,放入39℃、pH為2的0.2%的HCl-胃蛋白酶溶液中2.5h,然后放入十二指腸瘺管內(nèi),從糞中回收,沖洗,干燥,每一種保護氨基酸4個重復(fù),用凱氏定氮法測定剩余樣品氮含量,以氮的消失率計算釋放率。1.4試驗結(jié)果分析所有數(shù)據(jù)經(jīng)Excell處理后,采用SAS統(tǒng)計軟件GLM程序?qū)υ囼灲Y(jié)果進行方差分析和Duncan’s多重比較,回歸分析采用SAS統(tǒng)計軟件REC過程進行。2結(jié)果與分析2.1下表同屬性refindsoin標(biāo)準(zhǔn)體外法測定結(jié)果見表1。隨著培養(yǎng)時間的延長,6種保護蛋氨酸在pH6.6緩沖液中的釋放率增加,穩(wěn)定性降低,其中產(chǎn)品M2穩(wěn)定性最好,除培養(yǎng)48h與產(chǎn)品M5差異不顯著外(P>0.05),其他時間點及與其他保護產(chǎn)品之間差異極顯著(P<0.01);其次為產(chǎn)品M5,其在pH6.6緩沖溶液中培養(yǎng)4～48h的釋放率極顯著低于產(chǎn)品M1、M3、M4和M6(P<0.01)。表中同一列同一培養(yǎng)時間點肩標(biāo)小寫字母不同者差異顯著(P<0.05),大寫字母不同者差異極顯著(P<0.01)。下表同Valuesinthesamecolumnandsameincubationtimewithdifferentsuperscriptssmalllettersaresignificantlydifferent(P<0.05);Valueswithdifferentcapitallettersareextremelydifferent(P<0.01).Thesameasbelow4種保護賴氨酸在pH6.6緩沖液中的釋放率,隨著培養(yǎng)時間的延長而提高,但釋放率由高到低的順序發(fā)生改變,培養(yǎng)4h時,產(chǎn)品L1極顯著低于產(chǎn)品L2、L3和L4(P<0.01);培養(yǎng)8h時,產(chǎn)品L1和L3之間差異不顯著(P>0.05),但產(chǎn)品L1和L3極顯著低于產(chǎn)品L4和L2(P<0.01);培養(yǎng)24h時,產(chǎn)品L2和L4之間差異不顯著(P>0.05),但產(chǎn)品L2和L4極顯著低于L1和L3(P<0.01);培養(yǎng)48h時,產(chǎn)品L4極顯著低于其它產(chǎn)品(P<0.01)。6種保護蛋氨酸和4種保護賴氨酸在pH2.4緩沖液中釋放率的測定結(jié)果為:產(chǎn)品M1、M2、M3和M5的釋放率均為100%,極顯著高于產(chǎn)品M4和M6,產(chǎn)品M4在pH2.4緩沖液中培養(yǎng)4、8、24和48h的釋放率分別為81.40%、81.40%、82.03%、100.00%;產(chǎn)品M6相應(yīng)的釋放率分別為:73.56%、76.61%、77.20%、100.00%;培養(yǎng)4～24h,產(chǎn)品M4的釋放率極顯著高于產(chǎn)品M6(P<0.01)。保護賴氨酸產(chǎn)品的釋放率均為100%。2.2保護氨基酸產(chǎn)品在真胃和尼龍袋法中的釋放率保護蛋氨酸和賴氨酸在瘤胃中的釋放率測定結(jié)果見表2,蛋氨酸和賴氨酸在瘤胃中培養(yǎng)4～48h的釋放率均為100%,與其他保護產(chǎn)品存在極顯著差異(P<0.01),說明6種保護蛋氨酸產(chǎn)品和4種保護賴氨酸產(chǎn)品對于減少蛋氨酸和賴氨酸的釋放均有一定效果。M5在瘤胃培養(yǎng)4～8h,其釋放率與M2差異不顯著,但極顯著低于其它產(chǎn)品(P<0.01);培養(yǎng)24～48h,釋放率極顯著低于除M1以外的其它產(chǎn)品(P<0.01),與M1差異不顯著(P>0.05)。保護賴氨酸產(chǎn)品中,L3在瘤胃中培養(yǎng)4h的釋放率與L4差異不顯著(P>0.05),但極顯著低于L1和L2(P<0.01);瘤胃中培養(yǎng)8h,L3的釋放率極顯著低于L1和L4(P<0.01);瘤胃中培養(yǎng)24～48h,L3極顯著低于L1(P<0.01)。綜合評價6種保護蛋氨酸產(chǎn)品和4種保護賴氨酸產(chǎn)品,M5和L3產(chǎn)品在瘤胃中的穩(wěn)定性最好。移動尼龍袋法測定保護蛋氨酸和賴氨酸在真胃及小腸的釋放率結(jié)果見表3,6種保護蛋氨酸產(chǎn)品在真胃及小腸的釋放率為97.67%～100%,產(chǎn)品之間差異不顯著(P>0.05),4種過瘤胃保護賴氨酸產(chǎn)品釋放率均為100%。對產(chǎn)品M5和L3的體外和尼龍袋法的測定結(jié)果進行回歸分析,以Y代表尼龍袋法測定出的M5和L3產(chǎn)品在瘤胃的釋放率,以X代表2種產(chǎn)品在pH6.6緩沖液中的釋放率,結(jié)果表明,二者回歸關(guān)系極顯著(P<0.01),M5和L3的回歸方程分別為:YM=-3.3876+1.2283XM和YL=1.8111+0.9499XL;相關(guān)系數(shù)分別為:RM2=0.8675和RL2=0.9630。3瘤胃保護氨基酸體外法和尼龍袋法的比較直接補充蛋氨酸和賴氨酸會在瘤胃迅速降解,蛋氨酸在瘤胃的降解率為78%,賴氨酸在瘤胃的降解率為76%～90%,而本研究證明蛋氨酸和賴氨酸在瘤胃培養(yǎng)4h的降解率為100%,Robinson等報道,奶牛補充L-lysine·HCl,其在瘤胃的降解率為96.5%,與本試驗結(jié)果相近(100%)。由此可知蛋氨酸和賴氨酸在瘤胃具有高的降解率,對蛋氨酸和賴氨酸進行保護是減少其降解的一個有效途徑。通過體外法測定結(jié)果表明,6種產(chǎn)品中用丙烯酸樹脂Ⅳ號和乙基纖維素包被的M2及用氫化植物油和丙烯酸樹脂Ⅳ號包被的M5在pH6.6緩沖液中釋放率最低,在pH2.4緩沖液中釋放率均為100%。6種產(chǎn)品的尼龍袋法測定結(jié)果表明,M5在瘤胃中培養(yǎng)0～48h的釋放率最低,Rossi等研究證明用pH敏感聚合體包被的蛋氨酸在瘤胃的釋放率低于用脂肪酸鈣和氫化脂肪酸包被的蛋氨酸,本試驗中用pH敏感聚合體以及用氫化植物油包被的蛋氨酸在瘤胃的釋放率高于二者混合包被的蛋氨酸,這可能與保護方法有關(guān);Robert等報道,pH敏感聚合體包被的蛋氨酸在增加血液氨基酸濃度方面優(yōu)于用乙基纖維素包被的蛋氨酸,本試驗結(jié)果也表明用丙烯酸樹脂Ⅳ號包被的蛋氨酸在瘤胃釋放率低于用乙基纖維素包被的蛋氨酸,也低于用丙烯酸樹脂Ⅳ號和氫化植物油包被的蛋氨酸。有試驗證明丙烯酸樹脂Ⅳ號包被蛋氨酸在小腸的釋放率為60.9%,用乙基纖維素包被的蛋氨酸為81.7%,本試驗用丙烯酸樹脂Ⅳ號保護的蛋氨酸在小腸的釋放率為97.67%,而乙基纖維素保護的蛋氨酸為100%。據(jù)張樹金的資料,將瘤胃保護蛋氨酸在瘤胃培育3～96h,瘤胃內(nèi)蛋氨酸平均消失量分別為6%～87%,此保護蛋氨酸產(chǎn)品在瘤胃的穩(wěn)定性高于本試驗用瘤胃保護蛋氨酸產(chǎn)品。保護賴氨酸體外法試驗結(jié)果表明,4種產(chǎn)品在不同緩沖液中的釋放率沒有明顯的規(guī)律,這可能與賴氨酸的高溶解性有關(guān),但尼龍袋法測定結(jié)果表明,L3在瘤胃培養(yǎng)不同時間的釋放率均最低,其原因有待于進一步研究。研究證明,蛋氨酸在瘤胃內(nèi)和體外的降解率是不同的,在瘤胃內(nèi)的降解率是體外降解率的1.5倍,但兩者存在顯著的線性相關(guān),說明體內(nèi)、外的降解途徑是一致的,與本試驗結(jié)果相似。Rossi等試驗結(jié)果表明,體外法和尼龍袋