第1章 緒論 云南大學 崔清華

云南大學2016春季必修課基因工程云南大學崔清華

cuiqinghua@

TA考試

學生情況BenefitsofRecombinantBacteria1.Bacteriacanmakehumaninsulinorhumangrowthhormone.2.Bacteriacanbeengineeredto“eat”oilspills.TransgenicorganismsWhenanorganismcontainsgenesfromotherorganisms.Example:AtobaccoplantthatcontaindDNAfromafirefly.TheDNAofplantsandanimals

canalsobealtered.

PLANTSdisease-resistantandinsect-resistantcrops2.Hardierfruit3.70-75%offoodinsupermarketis

geneticallymodified.TransgenicorganismsGenefromArcticcharfishinsertedintotomato=Frost-resistanttomatoTransgenicplantsUsuallycashcropssuchascotton,corn,wheat,soybeans,etc.OftenincorporatesbacterialDNAtomakethecropresistanttodisease,pests,orchemicals.Ex:Btcorn蘇云金芽孢桿菌

HowtoCreateaGenetically

ModifiedPlant1.Createrecombinantbacteriawithdesiredgene.2.Allowthebacteriato“infect"theplantcells.3.Desiredgeneisinsertedintoplantchromosomes.SelectiveBreedingBreedonlythoseplantsoranimalswithdesirabletraitsPeoplehavebeenusingselectivebreedingfor1000’sofyearswithfarmcropsanddomesticatedanimals.GeneticallymodifiedorganismsarecalledGMOTRANSGENICANIMALSMice–usedtostudyhumanimmunesystemChickens–moreresistanttoinfectionsCows–increasemilksupplyandleanermeat

4.Goats,sheepandpigs–producehumanproteinsintheirmilk

HumanDNAinaGoatCellThisgoatcontainsahumangenethatcodesforabloodclottingagent.Thebloodclottingagentcanbeharvestedinthegoat’smilk..TransgenicGoatCloningClone:amemberofapopulationofgeneticallyidenticalcellsproducedfromasinglecell.1997:firstmammalcloned.Dolly,thesheep.體細胞vs生殖細胞子代vs自己2003Canadianclaimsuccessfulcloningattemptofahuman.HowtoCreateTransgenicAnimals中國克隆豬中心500/年華大基因C基因工程的基本形式1基因工程的基本概念B

重組DNA技術(shù)與基因工程的基本用途A

基因工程的基本定義D

基因工程的發(fā)展基因工程的概念基因（gene）

基因從化學上來說，指的是一段DNA或RNA順序，該順序可以產(chǎn)生或影響某種表型（genotype，phenotype），可以由于突變生成等位基因變異體（體細胞父源和母源；正常和突變基因）；從遺傳學上來說，基因代表一個遺傳單位，一個功能單位，一個突變單位。Expressiontheappearanceofatraitdirectedbyagenetraitacharacteristicresultingfromgeneexpression基因工程的基本操作

基因工程

在體外通過人工剪、接，將不同來源的DNA分子組成一個雜合DNA分子(DNA分子重組體)，然后導入宿主細胞去復(fù)制擴增或表達。因為通過人工設(shè)計,得到一定的設(shè)計方案，故稱為基因工程。由于整個操作在分子水平上進行，所以也稱分子克隆。

基因工程的基本特點是，分子水平操作，細胞水平表達。

基因工程(geneticengineering)常和以下名稱混用基因克隆(genecloning);分子克隆(molecularcloning);基因操作(genemanipulation);重組DNA技術(shù)(recombinationDNAtechnique)A重組DNA技術(shù)的基本定義1基因工程的基本概念

重組DNA技術(shù)是指將一種生物體（供體）的基因與載體在體外進行拼接重組，然后轉(zhuǎn)入另一種生物體（受體）內(nèi)，使之按照人們的意愿穩(wěn)定遺傳并表達出新產(chǎn)物或新性狀的DNA體外操作程序。因此，供體、受體、載體是重組DNA技術(shù)的三大基本元件。RecombinantDNATheabilitytocombinetheDNAofoneorganismwiththeDNAofanotherorganism.RecombinantDNAtechnologywasfirstusedinthe1970’swithbacteria.第一個實現(xiàn)DNA重組的人－Berg1972年，Berg用E.coRⅠ切割SV40DNA和λphageDNA，經(jīng)過連接組成重組的DNA分子。Berg是第一個實現(xiàn)DNA重組的人。*基因型（genetype）相同的細胞或生物體的一個群體*帶有相同插入順序的重組DNA分子的1個群體。*最常用的是描述一個微生物的一個菌落，這些微生物帶有插入了特定DNA片斷的載體分子。B分子克隆的基本定義clonesorganismsorcellsofnearlyidenticalgeneticmakeupderivedfromasinglesource根據(jù)目的及產(chǎn)物的不同，基因工程分為：基因克?。涸诨蛩缴?，根據(jù)人們的需要以人工的方法取得特定基因，在體外重組于載體DNA分子上，并將重組DNA轉(zhuǎn)入受體細胞進行無性繁殖?；虮磉_：在基因水平上，根據(jù)人們的需要以人工的方法取得特定基因，在體外重組于載體DNA分子上，并將重組DNA轉(zhuǎn)入受體細胞表達目的蛋白并行使正常功能。C重組DNA技術(shù)與基因工程的基本用途分離、擴增、鑒定、研究、整理生物信息資源大規(guī)模生產(chǎn)生物活性物質(zhì)設(shè)計、構(gòu)建生物的新性狀甚至新物種大規(guī)模生產(chǎn)生物活性物質(zhì)工程細胞基因工程蛋白質(zhì)工程途徑工程發(fā)酵工程細胞工程分離工程酶酶工程分離工程天然細胞天然細胞生物活性物質(zhì)

基因工程geneticengineering指重組DNA技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化設(shè)計與應(yīng)用，包括上游技術(shù)和下游技術(shù)兩大組成部分。上游技術(shù)指的是基因重組、克隆和表達的設(shè)計與構(gòu)建（即重組DNA技術(shù)）；而下游技術(shù)則涉及到基因工程菌或細胞的大規(guī)模培養(yǎng)以及基因產(chǎn)物的分離純化過程。1、基因工程理論基礎(chǔ)—三大理論發(fā)現(xiàn)（1）20世紀40年代：證明了遺傳物質(zhì)是DNA

1865年G.J.Mendel的豌豆雜交試驗20世紀20-30年代確認自然界有DNA和RNA兩類核酸，并闡明了核苷酸的組成1944年O.T.Avery肺炎球菌轉(zhuǎn)化實驗1952年A.D.Hershey和M.Cha-se用DNA35S和32P分別標記T2噬菌體的蛋白質(zhì)和核酸，感染大腸桿菌（一）基因工程的誕生

肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實驗有莢膜（S型）無莢膜（R型）非致病基因工程理論基礎(chǔ)-2（2）1953年Watson和Crick：DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)（3）1958～1971年：先后確立中心法則,破譯64種密碼子，揭示了遺傳信息的流向和表達確定了遺傳信息的傳遞方式

B技術(shù)上的3大發(fā)明：

1．“基因剪刀”－限制性內(nèi)切酶的發(fā)明

（1）20世紀40－60年代，科學家們就為基因工程設(shè)計了美好的藍圖，但是面對龐大的dsDNA（104，2.2*1011公里）束手無策，無從下手把它切成單個基因片斷。（2）當時的酶學知識已有相當?shù)陌l(fā)展，但是沒有一個已發(fā)現(xiàn)的酶能完成這樣的使命。（3）1970年，Smith和Wilcox在流感嗜血桿菌（Haemophilusinffuenzae）分離純化了HindⅡ，取得了突破，打破了基因工程的禁錮，迎來了改造生物的春天，為基因工程奠定了最為重要的技術(shù)基礎(chǔ)。RestrictionenzymerestrictionendonucleaseenzymethatcutsDNAstrandsatspecificsitesLigaseenzymeusedtojointwopiecesofDNA

2．載體(“交通工具車子”)－基因工程技術(shù)誕生的第二個技術(shù)準備

（1）

有了切割與縫合（ligase）基因DNA的工具，還得有一個載體將重組DNA送到宿主細胞中去。（2）1946年起，Lederberg就研究細菌性因子（F因子）.50-60年代相繼發(fā)現(xiàn)了R因子（抗藥因子），CoE(大腸桿菌因子)等質(zhì)粒。（3）1972年Berg首次實現(xiàn)基因重組(將SV40病毒DNA與噬菌體P22DNA在體外重組成功)----第一個重組DNA分子，1980年諾貝爾化學獎1973年Cohen才能將質(zhì)粒作為基因工程載體使用（至今一直是基因工程最重要最廣泛使用的載體）。這是基因工程的第二個技術(shù)準備。vectoranagentsuchasaplasmidusedtotransferDNAintoahostcellImportanceofE.coliThe“l(fā)aboratorymouse”ofbacteriaUsedingeneticengineeringPlasmidsAsmallcircularmoleculeofDNAItoftenhasaDNAsequencethatservesasanoriginofreplication.Containgeneticmarkers.

3．逆轉(zhuǎn)錄酶－1970年Baltimove和Temin等同時各自發(fā)現(xiàn)了逆轉(zhuǎn)錄酶，打破了遺傳學（生物學）中心法則，使真核基因的制備成為可能。（原因如下）(1)真核基因組龐大而復(fù)雜，不易制得基因圖譜。HGP2005年完成，2.8萬個基因，1－3kb/基因，104，2.2*1011公里。（2）即使有了基因圖譜，因為真核基因有內(nèi)含子，不能在原核表達系統(tǒng)剪接出mRNA，沒有成熟的mRNA就不能得到相應(yīng)得產(chǎn)物。（3）經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄mRNA→cDNA(complementoryDNA)文庫要比基因組文庫小得多，所以篩選陽性克隆就方便得多。

1973年，Cohen等獲得了抗四環(huán)素和新霉素的重組菌落TcrNer----標志著基因工程的誕生。NerNerNer第一個轉(zhuǎn)化成功的重組DNAE基因工程的發(fā)展E基因工程的發(fā)展1976年等首先將人工合成的生長激素釋放抑制因子somatostatin14肽的基因重組入質(zhì)粒，成功地在大腸桿菌中表達1977年美國南舊金山由Boyer和斯旺森建立世界上第一家遺傳工程公司，專門應(yīng)用重組DNA技術(shù)制造醫(yī)學上重要的藥物。1978年Itakura（板倉）等使人生長激素191肽在大腸桿菌中表達成功1979年美國基因技術(shù)公司用人工合成的人胰島素基因（HGH）重組轉(zhuǎn)入大腸桿菌中合成人胰島素1980年，美國/瑞士人，a干擾素－基因；1984年，日本人，白細胞介素2（IL-2）；（三）基因工程的騰飛1980年：顯微注射培育出第一個轉(zhuǎn)基因動物—轉(zhuǎn)基因小鼠，1982年，美國，大鼠生長激素基因轉(zhuǎn)入小鼠----巨鼠1983年，美國，農(nóng)桿菌介導培育出第一例轉(zhuǎn)基因植物—轉(zhuǎn)基因煙草1990年，美國，腺苷脫氨酶（ADA）基因治療，重度聯(lián)合免疫缺陷癥（SDID）1991年，美國倡導，人類基因組計劃109bp，15年時間30億USD；1997年，美國人，威爾英特克隆多利綿羊基因編輯技術(shù)新突破ZFNTALENCRISPR-Cas9TALEN-MediatedGeneMutagenesisinRhesusandCynomolgusMonkeys.CellStemCell,13February2014;GenerationofGene-ModifiedCynomolgusMonkeyviaCas9/RNA-MediatedGeneTargetinginOne-CellEmbryos.Cell,30January2014;基因診斷與治療CyclinA2InducesCardiacRegenerationAfterMyocardialInfarctionThroughCytokinesisofAdultCardiomyocytes.SciTranslMed,19February2014ManipulatingSomaticCellsGenetically

Commonly,morethan100diseasescanbedetectedthroughtesting,including…HemophiliaAMuscularDystrophyTay-SachsDiseaseCysticFibrosisDownSyndromeRemovalofonecellfortesting基因