魚(yú)腥草注射液對(duì)膜性腎病大鼠的影響及作用機(jī)制

魚(yú)腥草注射液對(duì)膜性腎病大鼠的影響及作用機(jī)制

膜性腎衰竭常表現(xiàn)為腎衰竭綜合征。病變特征是腎衰竭的底膜增厚，腎細(xì)胞表面上有沉積物，免疫熒光可以顯示igg和c3?，F(xiàn)在許多科學(xué)家認(rèn)為，這是由原免疫化合物形成的。國(guó)內(nèi)10594腎活檢病理資料分析顯示,原發(fā)性腎小球疾病中膜性腎病占第3位(9.54%),且近10年來(lái)明顯增多,臨床表現(xiàn)幾乎都有蛋白尿,70%～85%表現(xiàn)為腎病綜合征型蛋白尿。膜性腎病是一種復(fù)雜的自身免疫性疾病,目前治療主要是通過(guò)激素或免疫抑制劑調(diào)節(jié)體液和細(xì)胞免疫功能。但激素對(duì)細(xì)胞免疫有顯著的抑制作用,長(zhǎng)期大劑量激素治療可導(dǎo)致許多不良反應(yīng)及并發(fā)癥,成為疾病復(fù)發(fā)療效不佳的主要原因和死亡最危險(xiǎn)的因素。目前許多醫(yī)家認(rèn)為中西醫(yī)結(jié)合治療是較為理想的方法,中藥在消除蛋白尿,防止復(fù)發(fā)及減輕西藥副作用等方面起著越來(lái)越重要的作用。通過(guò)臨床觀察和實(shí)驗(yàn)研究,尋找到對(duì)膜性腎病具有積極治療意義的中藥,了解其對(duì)膜性腎病的作用機(jī)制,具有高度的臨床和科研價(jià)值。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討魚(yú)腥草注射液對(duì)腎病綜合征的作用機(jī)制,以膜性腎病大鼠模型為研究對(duì)象,觀察魚(yú)腥草注射液對(duì)其臨床癥狀、病理組織及細(xì)胞因子的影響,以期獲得魚(yú)腥草注射液對(duì)腎病綜合征療效的一些初步認(rèn)識(shí)。1材料和方法1.1動(dòng)物分組及給藥SD雄性大鼠(四川大學(xué)華西醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供),體重142～182g,尿蛋白測(cè)試2次全部為陰性,分為4組即模型對(duì)照組、魚(yú)腥草注射液20mL/Kg組、魚(yú)腥草注射液10mL/Kg組、地塞米松磷酸鈉注射液0.1mg/Kg組,連同原有正常對(duì)照組,共5個(gè)組。每組為10只動(dòng)物。地塞米松磷酸鈉注射液(西南藥業(yè)股份有限公司出品),魚(yú)腥草注射液(六枝二礦集團(tuán)大華藥業(yè)有限公司生產(chǎn),原濃度藥液供大劑量使用,用NS稀釋(1:1)后供小劑量使用),陽(yáng)離子化牛血清白蛋白(由四川大學(xué)華西醫(yī)學(xué)院提供),TGF-β1試劑(武漢博士德生物工程有限公司)。1.2各組大鼠免疫注射ip-1.2mg的給藥方案取C-BSAlmg,加入0.5mLPBS中,與等量的弗氏不完全佐劑混勻成乳白色懸液,在大鼠雙側(cè)腋下,腹股溝作多點(diǎn)皮下注射。預(yù)免疫l周后,每只大鼠尾靜脈注射C-BSA2.5mg,每周3次,共3周。免疫注射9次后開(kāi)始給藥,每組均采用ip給藥,正常對(duì)照組與模型對(duì)照組ipNS,給藥容積均為20mL/Kg,每日給藥1次,連續(xù)給藥28d。每7日稱體重1次,根據(jù)體重變化,調(diào)整給藥量。魚(yú)腥草注射液20mL/Kg組,基本達(dá)到ip給藥的最大容積,即2mL/100g體重。該組劑量約為臨床最大用量的10～12倍。魚(yú)腥草注射液10mL/Kg組,約為臨床最大用量的5～6倍。地塞米松磷酸鈉注射液組0.2mg/Kg,約為臨床最低用量的6倍。1.3腎組織病理學(xué)檢測(cè)(1)24h尿蛋白定量測(cè)定:采用苦味酸法,治療前后各測(cè)定1次,共2次。(2)腎臟光鏡觀察:給藥治療4周后,將大鼠斷頭處死,立即分離腎臟,觀察腎臟外觀形態(tài)、稱取腎臟重量,隨機(jī)間隔固定,取1腎臟經(jīng)腎門均勻縱切。隨機(jī)取樣2塊置于Bouins液中固定,逐級(jí)乙醇脫水,浸蠟,石蠟包埋,常規(guī)切片5μm2張,經(jīng)PAS染色,常規(guī)光鏡觀察。(3)光鏡圖象的立體學(xué)形態(tài)定量分析:腎小球直徑、面積分?jǐn)?shù)、總表面積、體積分?jǐn)?shù)、體積:每張切片投影至體視學(xué)圖象分析系統(tǒng),規(guī)定測(cè)格,采用點(diǎn)計(jì)數(shù)法讀取腎臟組織全部視野的總點(diǎn)數(shù)(P),及落入于腎小球內(nèi)的點(diǎn)數(shù)(P0),測(cè)量每個(gè)腎小球的直徑,采用禁線法記錄分葉腎小球個(gè)數(shù)。(4)采用武漢博士德生物工程有限公司的TGF-β1試劑,產(chǎn)品編號(hào)為BA0290,稀釋濃度為1:100,操作步驟同SABC單抗免疫組化染色。2結(jié)果2.1各組大鼠尿蛋白的比較造模各組大鼠經(jīng)注射C-BSA4周后,24h尿蛋白含量在明顯升高,造模各組尿蛋白與正常組比較,均有顯著性差異(P<0.01),顯示造模成功。給藥治療4周后,經(jīng)藥物治療各組尿蛋白均顯著降低,與模型組比較,有明顯差異(P<0.05),尤以魚(yú)腥草大劑量組作用明顯。與地塞米松組比較,魚(yú)腥草各組與之在降低尿蛋白方面無(wú)顯著差異。見(jiàn)表1。2.2各組小鼠光鏡下表現(xiàn)光鏡下正常組腎小球結(jié)構(gòu)無(wú)明顯異常;模型組腎小球體積明顯增大,球內(nèi)細(xì)胞增多,毛細(xì)血管壁明顯增厚,毛細(xì)血管內(nèi)出現(xiàn)較多紅細(xì)胞(出血),腎小球周圍大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn),腎小球分葉明顯,腎小管近曲小管水腫,PAS+蘇木精染色可見(jiàn)GBM增厚;魚(yú)腥草大小劑量組及地塞米松組光鏡下表現(xiàn)與模型組相似,但病變程度明顯減輕,魚(yú)腥草大劑量組腎小球周圍炎性反應(yīng)明顯減輕,血管內(nèi)少量紅細(xì)胞;地塞米松組血管內(nèi)紅細(xì)胞數(shù)量明顯減少,腎小球周圍僅少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn);魚(yú)腥草小劑量組腎小管周圍及血管周圍炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯,但無(wú)明顯出血性改變。2.3改變雞腥草和地塞米松的治療模型對(duì)照組與其余治療各組有顯著性差異,分葉腎小球最多,各治療組都有不同程度的改善,說(shuō)明魚(yú)腥草和地塞米松有防治腎小球纖維化和腎小球硬化的作用。見(jiàn)表2。造模后的大鼠腎小球體積有不同程度的增大,正常對(duì)照組與造模組及治療各組其余各組有顯著性差異。2.4各組小鼠肝腎組織病理學(xué)檢測(cè)EDl022顯色紫藍(lán)色為陽(yáng)性結(jié)果,模型對(duì)照組腎小球囊壁、基底膜及間質(zhì)出現(xiàn)較多紫藍(lán)色陽(yáng)性顆粒,腎小球、血管及周圍組織出現(xiàn)大量紫藍(lán)色陽(yáng)性顆粒;正常對(duì)照組TGF-β1染色不著色(TGF-β1組化染色陰性);魚(yú)腥草大劑量組腎小球及周圍組織著色較淺,免疫反應(yīng)輕;魚(yú)腥草小劑量組腎小球囊壁及基底膜陽(yáng)性反應(yīng)明顯,間質(zhì)也有部分染色;地塞米松組腎小球囊壁陽(yáng)性著色,但間質(zhì)基本無(wú)陽(yáng)性反應(yīng)。各組大鼠腎臟組織TGF-β1組化染色結(jié)果:正常對(duì)照組為陰性,模型對(duì)照組為強(qiáng)陽(yáng)性,魚(yú)腥草大劑量組為弱陽(yáng)性,魚(yú)腥草小劑量組為陽(yáng)性,地塞米松組為陽(yáng)性。3魚(yú)腥草注射液治療冠心病綜合征魚(yú)腥草(Houttuyniacordatathunb)為三白草科植物蕺菜的帶根全草,味辛性微寒,入肝肺兩經(jīng),全草含揮發(fā)油,主要成分為甲基正壬酮(C11H22O)、癸酰乙醛、月桂油、槲皮甙等,具有抗菌、利尿、鎮(zhèn)咳作用,同時(shí)對(duì)免疫功能也有較好的調(diào)節(jié)作用。李紅等采用單味魚(yú)腥草治療腎病綜合征23例療效觀察的研究中,也顯示出魚(yú)腥草在減少尿蛋白、提高血漿白蛋白起明顯的作用。劉先容等(《2003年全國(guó)腎臟病學(xué)術(shù)年會(huì)資料選編》)用魚(yú)腥草注射液治療40例腎病綜合征患者獲得較好療效。?？说仍诙嗄昱R床觀察中,發(fā)現(xiàn)魚(yú)腥草注射液有減輕腎病綜合征蛋白尿癥狀的作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,魚(yú)腥草大小劑量組24h尿蛋白定量明顯小于模型對(duì)照組(P<0.05),結(jié)合后面的光鏡和免疫組化結(jié)果看,魚(yú)腥草注射液可能有減少免疫復(fù)合物沉積的作用,從而減輕由于免疫復(fù)合物沉積而造成的腎小球基底膜結(jié)構(gòu)損傷和電荷性質(zhì)的改變,減少尿蛋白的排出。自DELARCO和TODARO于1978年首先發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF-β1)以來(lái),人們對(duì)其作了大量的研究,發(fā)現(xiàn)它具有調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化,以及免疫抑制、免疫趨化等多種生物學(xué)功能,參與了機(jī)體許多生理和病理過(guò)程,其中尤以在組織器官免