土壤栽培條件下根系分泌物收集方法研究

土壤栽培條件下根系分泌物收集方法研究

根系分泌物是指植物正常生長(zhǎng)過(guò)程中釋放的一系列化學(xué)品，如質(zhì)子、低分子量脂肪酸、氨基酸、酚酸、可溶性蛋白質(zhì)、可溶性糖、共聚合材料、細(xì)胞分離等。根系分泌物對(duì)于植物緩解外界脅迫、促進(jìn)養(yǎng)分有效性以及土壤與植物之間的物質(zhì)交流等具有重要作用。然而,要了解根系分泌物的功能,必須先得到根系分泌物。關(guān)于根系分泌物的溶液收集法,已有大量研究工作進(jìn)行了報(bào)道,即將根系浸在水溶液或營(yíng)養(yǎng)液中培養(yǎng)一段時(shí)間,收集根系培養(yǎng)液,即為根系分泌物。Tang和Young設(shè)計(jì)了一種循環(huán)水根系分泌物收集系統(tǒng),讓植物根系生長(zhǎng)在營(yíng)養(yǎng)液中,定期循環(huán)營(yíng)養(yǎng)液,洗脫根系,分泌物隨水流動(dòng),在XAD樹(shù)脂中連續(xù)富集,然后收集樹(shù)脂,洗脫樹(shù)脂,即得根系分泌物。以此裝置為基礎(chǔ),廖繼佩等和賈黎明等設(shè)計(jì)了一種新型連續(xù)根系分泌物收集裝置,其原理與Tang和Young設(shè)計(jì)的裝置相同。不同之處,后者是植物根系生長(zhǎng)在河砂、石英砂和鵝卵石混合基質(zhì)中,定期用水循環(huán)洗脫根系,根系淋洗液循環(huán),并在樹(shù)脂管中富集,洗脫樹(shù)脂,得到根系分泌物。這些方法能對(duì)根系分泌物進(jìn)行快速連續(xù)收集,且簡(jiǎn)單方便,具有一定的實(shí)用性。然而,根系分泌物在收集過(guò)程中,植物根系處于淹水條件下,根系生長(zhǎng)阻力小,這與土壤栽培條件下根系分泌真實(shí)情況相差較大。Dessureault-Rompre等設(shè)計(jì)了一種帶有真空微吸管的根管,用于原位抽提根際土壤溶液,與吳龍華等介紹的一種新型原位土壤溶液采集裝置相似,可以收集根際土壤溶液,該方法取樣方便,采樣空間小;但存在取樣易損傷根系、重復(fù)性不好等缺點(diǎn)。申建波探討了土培條件下根系分泌物的濾紙收集法,將根系生長(zhǎng)的一個(gè)側(cè)面用活動(dòng)有機(jī)玻璃板遮住,根系可緊靠有機(jī)玻璃板壁生長(zhǎng)。定期打開(kāi)有機(jī)玻璃板,可觀察到根系生長(zhǎng)。根據(jù)根系生長(zhǎng)部位,蓋上層析吸附濾紙,根系分泌物被濾紙吸附,定期收獲,并洗脫濾紙,即可得到根系分泌物。該方法可以提取到根系分泌物,取樣部位靈活、且不損傷根系。但該操作過(guò)程要頻繁地打開(kāi)根箱,對(duì)根系生長(zhǎng)存在擾動(dòng)。張玉鳳等和田中民等嘗試了瓊脂膜法和層析法收集根系分泌物的方法。通過(guò)研究發(fā)現(xiàn):瓊脂膜對(duì)根系分泌物吸附能力大;與溶液收集方法相比,該方法更能反映植物根系的自然分泌狀況,但存在瓊脂膜或?qū)游鰹V紙?jiān)诟当砻嫒菀资?、瓊脂膜或?yàn)V紙吸附容量小等缺點(diǎn)?？傮w而言,植物根系分泌物的收集方法還不成熟,很多方面值得進(jìn)一步研究。在前人工作的基礎(chǔ)上,我們?cè)O(shè)計(jì)了一套土壤栽培條件下植物根系分泌物的收集裝置及其收集方法。該裝置已經(jīng)申請(qǐng)國(guó)家發(fā)明專(zhuān)利,專(zhuān)利授權(quán)號(hào)為ZL200610123460.9,下面加以詳細(xì)介紹。1材料和方法1.1根系混合物的組成下面以收集大豆有機(jī)酸分泌為例,說(shuō)明根系分泌物收集裝置的操作方法。一種新型根系分泌物收集裝置由植物根系生長(zhǎng)箱、分泌物收集箱、樹(shù)脂富集管及導(dǎo)管吹氣系統(tǒng)四部分組成,如圖1。其原理是:植物先在根系生長(zhǎng)箱的土壤中生長(zhǎng),借助重力作用和斜面有機(jī)玻璃板壁對(duì)根系的定向引導(dǎo),根系將穿越瓊脂,進(jìn)入根系分泌物收集箱。根系在收集箱中累積一定生物量后,通過(guò)淋洗收集箱中的收集介質(zhì),根系分泌物將在樹(shù)脂管中富積,定期洗脫樹(shù)脂,從而實(shí)現(xiàn)根系分泌物的收集。由圖1可見(jiàn),植物根系生長(zhǎng)箱由以下部件組成:1.供試植物;2.供試土壤;3.瓊脂;4.斜面有機(jī)玻璃板;5.出水孔;6.開(kāi)關(guān)。根系生長(zhǎng)箱體積為3L。植物種子可以直接播種于生長(zhǎng)箱的土壤中,也可以將植物幼苗移栽至生長(zhǎng)箱的土壤中。根系分泌物收集箱主要由以下部件組成:8.海綿條;9.玻璃珠/石英砂混合物;10.孔徑為100目的尼龍網(wǎng);11.帶孔橡皮瓶塞。石英砂/玻璃珠混合物是根系分泌物的吸附介質(zhì),為惰性材料,其體積比為1∶1。因石英砂/玻璃珠混合物吸附作用遠(yuǎn)小于土壤,可用于本文的根系分泌物收集。收集箱與生長(zhǎng)箱之間設(shè)置有瓊脂層,用來(lái)分隔土壤與石英砂/玻璃珠混合物,可以避免土壤顆粒、土壤溶液進(jìn)入收集箱,污染收集介質(zhì)與根系分泌物。帶孔尼龍網(wǎng)主要用于防止石英砂泄漏。帶孔橡皮瓶塞用于不同部件的有效連接,密封,不能漏水。樹(shù)脂富集管是化學(xué)性質(zhì)惰性的硬質(zhì)玻璃管,其體積為120ml,內(nèi)部裝有XAD-4吸附樹(shù)脂,重量為60g,能吸附100株植物(根系干重小于1g株-1)24h分泌的化合物。注意不同型號(hào)的樹(shù)脂,其吸附容量有明顯差異。導(dǎo)管吹氣系統(tǒng)由硬質(zhì)玻璃細(xì)管(部件12)組成,部件13為導(dǎo)管吹氣口,導(dǎo)管吹氣口外接一個(gè)吹氣泵,其功率為120W。吹氣泵工作時(shí)間,一般以每小時(shí)工作10min為宜。收集根系分泌物時(shí),通過(guò)吹氣系統(tǒng)推動(dòng)液體循環(huán)流動(dòng),不斷洗脫收集箱內(nèi)的根系分泌物,使根系分泌物在樹(shù)脂中富集。1.2處理石英砂與玻璃珠混合物試驗(yàn)用土先曬干,后研磨,過(guò)2mm篩,即可用于裝入根系分泌物收集裝置的生長(zhǎng)箱中。石英砂/玻璃珠先用自來(lái)水、稀鹽酸溶液(0.1%)清洗,然后用去離子水清洗,待淋洗液pH為6時(shí),將石英砂/玻璃珠混合物滅菌、烘干備用。將準(zhǔn)備好的石英砂/玻璃珠混合物填充于收集箱中,稱(chēng)為處理1;將準(zhǔn)備好的石英砂/玻璃珠混合物用檸檬酸溶液浸泡,然后用去離子水清洗,至淋洗物檸檬酸含量忽略不計(jì),然后填充于收集箱中,稱(chēng)為處理2。待各種材料準(zhǔn)備后,開(kāi)始裝入生長(zhǎng)箱或收集箱中。保持裝置正立,取洗凈消毒的石英砂和玻璃珠混合物(石英砂4kg,玻璃珠4kg,各稱(chēng)取兩份,共4份,分別裝入左、右兩側(cè)根系分泌物收集箱中。當(dāng)裝入高度與生長(zhǎng)箱底部打孔處接近時(shí),用塑料隔板擋住生長(zhǎng)箱和收集箱之間的小孔。在生長(zhǎng)箱一側(cè),灌入半凝固態(tài)的瓊脂膠,用于堵塞兩箱之間的小孔。待瓊脂膠凝固后,取已處理土壤2kg,稱(chēng)取2份,緩慢裝入左右兩側(cè)的生長(zhǎng)箱,然后分別用水潤(rùn)濕1d,待幼苗移植。1.3幼苗的覆蓋將供試植物種子用3%的H2O2消毒后,清水洗凈,直接播種于河砂中萌發(fā)。對(duì)于大豆來(lái)說(shuō),萌發(fā)3d后可得到幼苗。選取大小一致的幼苗,轉(zhuǎn)移到生長(zhǎng)箱內(nèi)土壤中生長(zhǎng),種植2行,每行5~6棵。采用常規(guī)土壤盆栽方法管理,整體裝置水分含量,用稱(chēng)重法控制。由于剛移栽幼苗,最初一周內(nèi),每天向土壤灌水500ml,隨后換成1/2Hoagland營(yíng)養(yǎng)液。在收集箱上層,用吸水海綿覆蓋石英砂與玻璃珠混合物,保證收集箱內(nèi)的濕度不變,整體裝置采用錫箔紙包被折光。植物根系生長(zhǎng)狀況通過(guò)裝置內(nèi)側(cè)壁的觀察,可以看到根系的生長(zhǎng)情況。1.4根系處理和鹽堿洗脫物的處理工藝--固沙系當(dāng)大豆植株在生長(zhǎng)箱中生長(zhǎng)3周后,可以從收集箱內(nèi)側(cè)底部觀察到根系從生長(zhǎng)箱穿插瓊脂膜,進(jìn)入收集箱。原則上,從這時(shí)起,即可進(jìn)行根系分泌物的收集。收集分泌物時(shí),先用去離子水清洗收集箱內(nèi)的石英砂和玻璃珠混合物,并檢測(cè)洗脫物成分,直至洗脫物各種養(yǎng)分離子(如:K+、NO?33-、Cl-、SO2?442-等)含量很低,或忽略不計(jì)時(shí),可進(jìn)行根系處理,如進(jìn)行缺磷、鋁毒、鹽害等。處理完畢后,開(kāi)始收集根系分泌物。收集時(shí),通過(guò)吹氣系統(tǒng)推動(dòng)液體循環(huán)流動(dòng),使根系分泌物在樹(shù)脂中富集,取出樹(shù)脂進(jìn)行洗脫,即得到根系分泌物。根系分泌物的測(cè)定用DX-120型號(hào)的離子色譜儀,測(cè)定低分子量有機(jī)酸的有效條件如下:AS11-HC分析柱,ASRS電導(dǎo)抑制器,CDM-3電導(dǎo)檢測(cè)器,淋洗液流量1.20mlmin-1,柱溫是室溫,淋洗液采用15mmolL-1NaOH,系統(tǒng)柱壓3000psi,基線電導(dǎo)率3.0mV為宜。2結(jié)果2.1根系在生箱及收集箱的面分布情況圖2A和圖2B為生長(zhǎng)3周的大豆根系在生長(zhǎng)箱和收集箱內(nèi)的分布;圖2C為收獲時(shí)將收集箱內(nèi)的砂子用水沖洗掉后,根系在生長(zhǎng)箱及收集箱的側(cè)面分布情況。研究發(fā)現(xiàn),生長(zhǎng)3周后,大豆根系總干重的30%分布在收集箱內(nèi),70%分布在生長(zhǎng)箱內(nèi)。大豆總根尖數(shù)的90%分布在收集箱內(nèi)。由于根系分泌物主要由根尖分泌,因此,收集箱內(nèi)收集的分泌物可以代表整個(gè)植株的分泌情況。2.2收集介質(zhì)劑對(duì)酸質(zhì)原料的吸附為明確土壤栽培條件下,根系有機(jī)酸分泌的實(shí)際數(shù)量,必須了解收集箱內(nèi)收集介質(zhì)(石英砂/玻璃珠混合物)對(duì)有機(jī)酸的吸附。石英砂/玻璃珠混合物經(jīng)過(guò)處理1、處理2后,用于根系分泌物的收集。圖3為土壤栽培條件下,收集介質(zhì)對(duì)外源加入有機(jī)酸吸收情況。發(fā)現(xiàn),處理1(未經(jīng)檸檬酸浸泡)時(shí),收集介質(zhì)對(duì)有機(jī)酸有明顯的吸附作用。有機(jī)酸回收率較低,其中檸檬酸回收率為29%,蘋(píng)果酸的回收率為37.5%。當(dāng)收集介質(zhì)經(jīng)過(guò)檸檬酸處理,即處理2后,有機(jī)酸回收率顯著提高,檸檬酸和蘋(píng)果酸的回收率分別達(dá)到72.5%和81%。盡管有機(jī)酸加樣回收率未達(dá)到90%以上,由于石英砂/玻璃珠混合物化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定,而且取材方便、易于清洗等,本試驗(yàn)采用該混合物質(zhì)作為收集介質(zhì)。選擇合適的基質(zhì)作為收集介質(zhì)仍需要進(jìn)一步研究。2.3大豆含糖液培養(yǎng)對(duì)大豆有機(jī)質(zhì)分泌量的影響利用根系分泌物收集裝置,研究了大豆在土壤栽培條件下根系蘋(píng)果酸和檸檬酸的分泌(圖4)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),土壤栽培條件下,大豆根系檸檬酸和蘋(píng)果酸分泌量隨生長(zhǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加,蘋(píng)果酸分泌量明顯高于檸檬酸,至生長(zhǎng)第35天時(shí),有機(jī)酸分泌量達(dá)到最大值(圖4A)。圖4B比較了土壤栽培與溶液培養(yǎng)條件下,大豆有機(jī)酸分泌。當(dāng)大豆生長(zhǎng)3周時(shí),土壤栽培條件下,大豆檸檬酸和蘋(píng)果酸分泌量分別是溶液培養(yǎng)時(shí)的11.4倍和6.7倍(圖4B),表明土壤栽培條件下根系分泌作用強(qiáng)于溶液栽培。3討論3.1砂層結(jié)構(gòu)方式的選擇收集箱內(nèi)介質(zhì)的填充結(jié)構(gòu),最初設(shè)計(jì)按照vanGenuchten提出的保水模型來(lái)填充。這一保水模型從上至下包括了5層:細(xì)粒砂層(0.32~0.43mm)、細(xì)/中砂層(0.32~0.63mm)、中粒砂層(0.43~0.63mm)、中/粗粒砂層(0.43~0.85mm)和粗粒砂層(0.63~0.85mm)。在這種結(jié)構(gòu)下,整個(gè)砂層的持水能力和透氣性能較好。本研究試著選用這一模式作為收集箱內(nèi)介質(zhì)的填充結(jié)構(gòu),由于石英砂對(duì)根系分泌物有強(qiáng)烈吸附作用,本研究了采用粒徑為0.5~1mm的石英砂與玻璃珠的混合物,二者等體積均勻混合構(gòu)成了收集箱內(nèi)的填充介質(zhì)。通過(guò)適當(dāng)增加灌水次數(shù),保證收集箱內(nèi)的含水量。后續(xù)工作將繼續(xù)研究vanGenuchten保水模型在根系分泌物收集方面的應(yīng)用。3.2生物污染的處理由于根系分泌物極易受微生物的降解,收集過(guò)程中應(yīng)盡量減少微生物干擾。本試驗(yàn)所用土壤、石英砂/玻璃珠均進(jìn)行滅菌處理,其他裝置也用酒精消毒。由于作物生長(zhǎng)系統(tǒng)在開(kāi)放體系中,實(shí)際操作中很難避免細(xì)菌、真菌等微生物的污染。為降低微生物活性,在收集過(guò)程中使用微生物抑制劑,可減少微生物對(duì)根系分泌物的分解作用。3.3低分子量有機(jī)酸的收集由于根系分泌物包括質(zhì)子、低分子量有機(jī)酸、氨基酸、酚酸等多種細(xì)胞次生代謝產(chǎn)物,因此,對(duì)根系分泌物的研究應(yīng)用根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?有選擇地、針對(duì)某一類(lèi)化合物進(jìn)行研究。本根系分泌物收集裝置理論上可以對(duì)溶于水的根系分泌物實(shí)現(xiàn)收集。通過(guò)改變富集管內(nèi)離子交換樹(shù)脂的種類(lèi),收集不同類(lèi)型的分泌物。例如:利用強(qiáng)酸性732型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂分離多種氨基酸;利用陽(yáng)離子交換樹(shù)脂(AmberliteIR-120H+型)分離麥根酸類(lèi)物質(zhì);利用731型陰離子交換樹(shù)脂(Dowex138型)分離低分子量有機(jī)酸如檸檬酸和蘋(píng)果酸等。本收集裝置專(zhuān)注土壤栽培條件下,根系低分子量有機(jī)酸的收集(圖1)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),利用該裝置收集有機(jī)酸,有機(jī)酸加樣回收率達(dá)70%以上,其中,蘋(píng)果酸回收率達(dá)81%。這很可能是檸檬酸浸泡處理將收集介質(zhì)中檸檬酸吸附位點(diǎn)平衡,這樣,外源加入檸檬酸或蘋(píng)果酸被介質(zhì)吸附減少,故有機(jī)酸回收率增加。盡管有機(jī)酸加樣回收率沒(méi)有90%以上,利用該裝置研究土壤栽培條件下根系有機(jī)酸分泌仍具有一定指導(dǎo)作用。相信隨著根系分泌物收集裝置的不斷完善,該裝置在根系分泌物的研究中發(fā)揮越來(lái)越大的作用。3.4原位與溶液栽培條件對(duì)根系認(rèn)識(shí)的影響溶液培養(yǎng)收集條件下,作物根系處于淹水環(huán)境中,通氣狀況明顯不如土壤栽培條件。而且溶液栽培條件下,養(yǎng)分均一供應(yīng),易導(dǎo)致根系分泌作用減弱。土壤栽培條件下,根際范圍十分狹小,根系對(duì)根際養(yǎng)分離子濃度變化非常敏感,而且根系生長(zhǎng)時(shí),受到機(jī)械阻力大,因此,土壤栽培條件下根系分泌作用不同于溶液栽培