金錢草對草酸鈣腎石模型大鼠的抑制

金錢草對草酸鈣腎石模型大鼠的抑制

為了研究其預(yù)防尿液障礙的機制，我們進(jìn)行了實驗研究。報告如下。材料和方法一、急性毒性實驗廣金錢草1kg,水醇法處理后調(diào)節(jié)pH為6.5～7.0,熱處理冷卻,按含生藥0.5g/ml制成每支20ml靜脈注射液,經(jīng)致熱源、澄清度、pH等檢查合格。急性毒性實驗:小鼠靜脈給藥后LD50為4808mg/kg,95%平均可信限為(4808±543)mg/kg,99%平均可信限為(4808±714)mg/kg。另取廣金錢草1kg經(jīng)沸蒸餾水煎煮二次,合并濾液,濃縮成含生藥1g/ml的提取液冷藏備用。二、實驗方法1.組日灌胃金錢草的配制健康Wistar雄性大鼠40只,體重250～300g,隨機分成對照組(A組)、成石組(B組)、金錢草提取液組(C組)和金錢草注射液組(D組),每組10只。對照組標(biāo)準(zhǔn)飲食,其余三組均飲含0.75%乙二醇和0.75%氯化銨的自來水,喂標(biāo)準(zhǔn)飼料。提取液組日灌胃金錢草提取液4ml(含生藥4g);注射液組每只按日取金錢草注射液1.25ml(含生藥0.625g),用5%葡萄糖溶液稀釋至4ml,尾靜脈緩慢注射。各組均飼養(yǎng)2周。2.腎組織病理學(xué)檢查(1)腎組織透射電鏡觀察:2周末斷髓法處死大鼠后立即低溫下取左腎,于腎皮髓質(zhì)交界處取1mm×1mm×1mm腎組織制片,JEM1200-EX透射電鏡觀察腎組織超微結(jié)構(gòu)變化。(2)腎臟草酸和鈣含量測定:將取電鏡標(biāo)本后剩余左腎稱重,加入1mmol/L鹽酸定容至10ml,4小時后勻漿,3000r/min離心20分鐘,上清液用變色酸比色法測草酸含量,EncoreⅢ型自動分析儀比色法測鈣含量,雙管測定取均值,計算每克腎組織中草酸和鈣含量。(3)腎組織學(xué)檢查:取右腎冠狀面切開,先用解剖顯微鏡觀察結(jié)石形成情況;隨后常規(guī)組織切片,HE染色,偏光顯微鏡觀察腎臟病理改變及草酸鈣結(jié)晶情況,按0～5級結(jié)晶判定標(biāo)準(zhǔn)作統(tǒng)計。應(yīng)用SAS軟件進(jìn)行F檢驗及q檢驗作組間顯著性檢驗。結(jié)果一、腎超微結(jié)構(gòu)改變對照組腎超微結(jié)構(gòu)正常。成石組腎小管細(xì)胞核形不整、核固縮、核仁邊移,胞漿內(nèi)線粒體減少,出現(xiàn)明顯空泡和破裂;溶酶體增多,其內(nèi)可見晶體;細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)無結(jié)構(gòu)壞死區(qū),管腔內(nèi)有較多由細(xì)胞碎片等物構(gòu)成的不定形物質(zhì)和結(jié)晶體,并有較多空泡狀膜性囊和致密小體呈團(tuán)狀分布。金錢草提取液組和注射液組腎超微結(jié)構(gòu)改變輕微,胞漿內(nèi)線粒體基本正常,少數(shù)有溶酶體增多現(xiàn)象,腎小管腔內(nèi)滲出物少且分散;提取液組少部分管腔內(nèi)可見一些空泡囊和致密小體,呈不密集分布,無成堆現(xiàn)象。二、腎組織中的甘草和鈣含量各組鼠腎組織草酸和鈣含量如表1所示。三、腎組織病理學(xué)檢查結(jié)果1.腎私家車草形成率對照組腎臟無結(jié)石形成。成石組腎結(jié)石形成率為100%(10/10),腎表面及腎剖面可見不同程度鈣化斑,腎乳頭周圍有多量晶體沉淀物,4只鼠腎盂內(nèi)有肉眼可見的微結(jié)石;1只鼠腎盂結(jié)石較大,伴腎內(nèi)2枚結(jié)石;3只鼠有腎盂積水。金錢草提取液組和注射液組腎石形成率分別為30%(3/10)、20%(2/10),明顯低于成石組(P<0.001)。晶體多散在分布于髓質(zhì),個別出現(xiàn)在腎乳頭,腎盂內(nèi)無游離晶體。2.腎組織病理特征對照組腎組織結(jié)構(gòu)正常,未見草酸鈣結(jié)晶。成石組腎小管上皮腫脹、變性,管腔內(nèi)可見嗜伊紅染色壞死物質(zhì)及部分脫落上皮細(xì)胞,腎小球部分呈玻璃樣變;遠(yuǎn)曲小管、集合管和腎盂內(nèi)均可見較多草酸鈣晶體,部分近曲小管、腎小管上皮細(xì)胞和間質(zhì)內(nèi)亦可見晶體,多數(shù)腎臟結(jié)晶成堆分布相互連接,甚至連接成片,少數(shù)散在不連接。金錢草提取液組和注射液組與成石組相比,腎臟組織病理改變輕微,大多數(shù)腎臟有散在的結(jié)晶亮點,部分呈廣泛的不成堆分布或形成局限結(jié)晶,個別腎臟有散在不連接的成堆結(jié)晶(表2)。經(jīng)Ridit分析統(tǒng)計表明,金錢草提取液組或注射液組大鼠腎臟草酸鈣結(jié)晶程度比成石組明顯減輕。ds可有效地保護(hù)腎組織細(xì)胞本實驗所用廣金錢草(Ds)為豆科山螞蟥屬植物的枝葉,全草含生物堿、黃酮甙、酚類和鞣質(zhì)等成分。Ds是防治尿石癥的一種常用中藥,其作用機制至今仍不十分清楚。Kubo等從Ds中提取主要成分三萜醇配糖體(Ds-t),動物試驗表明,Ds-t通過增加尿量和尿枸櫞酸鹽的排泌、減少尿鈣和尿草酸的排泄,能有效地抑制大鼠草酸鈣尿石形成。本組實驗觀察發(fā)現(xiàn)Ds提取液及注射液能明顯降低實驗性高草酸尿癥大鼠腎組織中草酸和鈣含量,減少乙二醇誘導(dǎo)的草酸鈣結(jié)晶在腎中的形成、沉積,從而顯著抑制大鼠草酸鈣腎石形成。乙二醇誘石過程引起的代謝紊亂可導(dǎo)致腎臟發(fā)生一系列超微結(jié)構(gòu)和病理學(xué)改變,表現(xiàn)為誘石初期近曲小管細(xì)胞大量細(xì)胞器脫落、崩解,伴隨一些膜性囊狀小體和電子致密小體排入管腔。隨著誘石時間延長,腎小管細(xì)胞發(fā)生變性壞死,管腔內(nèi)出現(xiàn)晶體及微結(jié)石。本組觀察結(jié)果與此一致。本組實驗結(jié)果表明,Ds可有效地抑制乙二醇誘石過程所引起的腎損害,表現(xiàn)為其提取液組和注射液組腎組織細(xì)胞器結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,腎小管腔內(nèi)滲出物少,腎中草酸鈣結(jié)晶程度輕,說明Ds在體內(nèi)有保護(hù)腎組織細(xì)胞的作用。動物實驗發(fā)現(xiàn),代謝紊亂引起腎臟超微結(jié)構(gòu)的變化早于晶體的形成,這種變化則可通過腎小管上皮細(xì)胞碎片直接脫入管腔及細(xì)胞向管腔內(nèi)排出一些膜性小囊或電子致密小體的途徑增加尿中的固形顆粒,而尿中大量增加這些顆粒提供了結(jié)晶異質(zhì)成核的條件及晶體集聚的“固體橋”。Ds對腎臟的保護(hù)作用抑制和減輕了上述過程,推測這種保護(hù)作用的機理可能是Ds通過其有效成分抑制羥乙酸和乙醛酸向草酸的轉(zhuǎn)化,從而使草酸的形成減少。本實驗結(jié)果顯示,Ds注射液組與提取液組相比,前組用藥劑量小、腎石形成率相對低、腎中草酸和鈣含量顯著低于后組(P<0.05),而偏光鏡和電鏡觀察結(jié)果也表明注射液組在晶體形成程度、病理和超微結(jié)構(gòu)變化方面比提取液組改變輕微的傾向。推測這可能與Ds注射液靜脈給藥消除