第三章 基因操作的主要技術(shù)原理

第三章基因操作的主要技術(shù)原理第一節(jié)核酸的分離與純化核酸包括DNA、RNA兩種分子，在細(xì)胞中都是以與蛋白質(zhì)結(jié)合的方式存在的真核生物95%DNA存在于細(xì)胞核內(nèi)，5%在細(xì)胞器75%的RNA存在于細(xì)胞質(zhì)，10%在核內(nèi)，15%在細(xì)胞器rRNA（80～85%），tRNA及核內(nèi)小分子RNA（10～15%），mRNA（1～5%）一、核酸分離提取的原則1.保證核酸一級結(jié)構(gòu)的完整性

2.排除其它分子的污染

核酸樣品中不應(yīng)存在對酶有抑制作用的有機(jī)溶劑和過高濃度的金屬離子將其它生物大分子如蛋白質(zhì)、多糖和脂類分子的污染降到最低排除其它核酸分子的污染

核酸提取的基本要求

盡量簡化操作步驟，縮短提取過程，以減少各種有害因素對核酸的破壞

減少化學(xué)因素對核酸的降解（過酸、過堿）

減少物理因素對核酸的降解（機(jī)械剪切力、高溫）

防止核酸的生物降解

提取核酸的一般程序:破碎細(xì)胞去除與核酸結(jié)合的蛋白質(zhì)及多糖等去除其它核酸分子沉淀核酸，去除鹽類、有機(jī)溶劑等雜質(zhì)純化核酸核酸的質(zhì)量評估（電泳、D260/OD280，酶切）二、質(zhì)粒載體的分離與純化

關(guān)鍵：如何使質(zhì)粒DNA與宿主染色體DNA分開依據(jù)：質(zhì)粒DNA比染色體DNA小得多，在DNA提取過程中，染色體DNA斷裂成片段(線狀)，而質(zhì)粒DNA仍保持超螺旋構(gòu)型變性法提取質(zhì)粒DNA的原理

在變性條件（堿性或高溫)下，線狀染色體DNA變性成為單鏈而完全分開，而cccDNA雖然互補(bǔ)鏈之間的氫鍵斷裂，但雙螺旋主鏈骨架仍彼此纏繞在一起。當(dāng)變性條件恢復(fù)時(shí)，質(zhì)粒DNA迅速復(fù)性恢復(fù)天然構(gòu)型，染色體DNA難以復(fù)性，交聯(lián)形成不溶性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，與變性的蛋白質(zhì)和RNA纏繞在一起，通過離心沉淀下來，而質(zhì)粒DNA存在于上清液中。堿變性法提取質(zhì)粒DNA的步驟收集細(xì)胞沉淀加入溶液I(50mM葡萄糖,25mMTris-HCl,10mMEDTA,4~5mg/mL溶菌酶）加入溶液II(0.2MNaOH,1%SDS)加入溶液III(3MNaAcpH4.8)離心除去沉淀，得含質(zhì)粒DNA的上清液苯酚抽提去除蛋白質(zhì)乙醇沉淀收集質(zhì)粒DNA在強(qiáng)堿性環(huán)境中暴露時(shí)間過長，cccDNA可發(fā)生不可逆變性關(guān)鍵：盡可能地保持其高分子量細(xì)菌3300~4200kb酵母15,000kb果蠅1.65x105kb人3x106kb植物2x105~1x108kb天花病毒288kb痘病毒196kb三、染色體DNA的分離純化CsCl密度梯度離心原理：CsCl介質(zhì)密度為1.7g/cm3，超速離心后形成1～1.9052g/cm3的密度梯度EB（溴化乙錠）可嵌入DNA兩條鏈的堿基對之間，并因此導(dǎo)致雙螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)生解旋反應(yīng)線性或開環(huán)DNA分子，因其具有游離的末端而易于解旋，故可結(jié)合相當(dāng)大量的EB直到達(dá)到飽和具有ccc結(jié)構(gòu)的質(zhì)粒DNA由于負(fù)超螺旋的存在阻止DNA解鏈，因而只能結(jié)合很少的EBDNA分子中結(jié)合EB越多，其浮力密度越小，因而形成不同的浮力密度得以區(qū)分

質(zhì)粒質(zhì)粒DNA的分離純化氯化銫密度梯度離心法：用含有EDTA的緩沖液懸浮菌體加溶菌酶裂解細(xì)菌細(xì)胞壁加CsCl和溴乙錠超速離心過夜在紫外燈下吸取cccDNA稀釋沉淀cccDNAproteinsocDNAL-DNAcccDNARNAs

關(guān)鍵：防止內(nèi)外源RNase的作用

四、RNA的分離與純化RNase的特點(diǎn)：抗酸抗堿,具很廣pH作用范圍抗高溫嚴(yán)寒(0~65℃均具活性，100℃也不能使之完全失活）抗變性劑（變性劑只能使之暫時(shí)失活，去除變性劑后又可恢復(fù)活性）酶活性不需要輔助因子存在范圍廣

解決辦法：外源RNase：高溫（干熱180℃，4hrs），焦碳酸二乙酯(DEPC)處理所有溶液（Tris·HCl除外）和器皿，操作者帶手套

內(nèi)源RNase：高溫抽提，強(qiáng)蛋白質(zhì)變性劑，RNase抑制劑，蛋白酶K等五、核酸的濃縮與貯存

沉淀是核酸濃縮最常用的方法，其最大的優(yōu)點(diǎn)是通過核酸沉淀來改變核酸的溶解緩沖液及重新調(diào)節(jié)核酸在溶液中的濃度，可去除溶液中某些可溶性的鹽離子與雜質(zhì)，在一定程度上純化核酸沉淀DNA的最常用方法是在DNA溶液中加入1/10體積的3MNaAc（或KAc）和2倍體積的乙醇，放置15～30min，離心收集DNA沉淀，倒去上清液，加入70%的乙醇洗滌沉淀，去除殘余的鹽，再離心收集沉淀。

貯存DNA：溶于TE中，放置于4℃、-20℃、-70℃RNA：溶于0.3MNaAc(pH5.2)或ddH2O中，-70℃長期保存可以沉淀形式貯存于乙醇中，-20℃六、核酸的質(zhì)量評估方法

核酸濃度的測定

ds-DNA：1OD260≈50μg/ml

ss-DNA&RNA：1OD260≈40μg/ml單鏈寡核苷酸：1OD260≈20μg/ml

核酸純度的測定

DNA：A260/A280=1.8

若＞1.8，說明RNA未除盡＜1.6，蛋白質(zhì)或酚未除盡RNA：A260/A280=2.0

＜2.0，蛋白質(zhì)或酚未除盡第二節(jié)凝膠電泳一、核酸電泳的基本原理

核酸分子中的磷酸基團(tuán)帶負(fù)電荷，在電場中將向正極移動(dòng)，通過凝膠的分子篩作用可以將不同大小和構(gòu)型的核酸分子分離，分子量小的DNA，具有較緊密的構(gòu)型，在凝膠中移動(dòng)快；反之，分子量大的DNA移動(dòng)慢

瓊脂糖及聚丙烯酰胺凝膠分辨DNA片段的能力

凝膠類型及濃度分辨DNA片段的大小范圍（bp）0.3%瓊脂糖50000~10000.7%瓊脂糖20000~10001.4%瓊脂糖6000~3004.0%聚丙烯酰胺1000~10010.0%聚丙烯酰胺500~2520.0%聚丙烯酰胺50~1

DNARNADNA蛋白質(zhì)核酸電泳的染色劑和指示劑

指示劑

在電泳過程中，常使用一種有顏色的標(biāo)記物以指示樣品的遷移過程

瓊脂糖凝膠濃度0.6%1%1.4%2%溴酚藍(lán)1kb0.6kb0.2kb0.15kb二甲苯青藍(lán)2kb1.6kb

染色劑

溴化乙錠（EB）：嵌入核酸雙鏈的配對堿基之間，在紫外光下呈現(xiàn)橙色熒光由于單鏈DNA、RNA中常存在自身配對的雙鏈區(qū)，也可嵌入EB分子

EB是一種誘變劑，見光易分解在常規(guī)電泳中，DNA移動(dòng)距離與分子量有關(guān)：分子量小的移動(dòng)快，反之則慢大于20kb的DNA大分子，其移動(dòng)距離與分子量無關(guān)。因?yàn)檫@些DNA分子要通過膠孔時(shí)必須發(fā)生變形，并沿分子長軸運(yùn)動(dòng)經(jīng)過膠孔，它們都以相同速度前進(jìn)，分辨率也就消失了。

三、脈沖場凝膠電泳在脈沖場凝膠電泳中，加在凝膠上至少有兩個(gè)電場方向，使得DNA分子要不斷地調(diào)整泳動(dòng)方向，不同分子量大小的DNA分子用于改變泳動(dòng)方向的時(shí)間不同，則可以得到分離脈沖場凝膠電泳

Pulsed-FieldGelElectrophoresis，PFGE

PFGE工作原理DNA松弛時(shí)間：大分子DNA改變形狀和重新定向所需的時(shí)間。這個(gè)時(shí)間與DNA分子量呈正相關(guān)（Tr）

DNA移動(dòng)時(shí)間：DNA分子向前移動(dòng)的時(shí)間（Tm）

電場脈沖時(shí)間：其電場方向所持續(xù)的時(shí)間（Tp）

分子量大的DNA分子所需的松弛時(shí)間長，分子量小的則短。由于脈沖時(shí)間是一個(gè)人為的固定值，那么用于向前移動(dòng)的時(shí)間則隨分子量大小而變化。分子量大的用于向前運(yùn)動(dòng)的時(shí)間少，移動(dòng)距離就短，分子量小的用于向前運(yùn)動(dòng)的時(shí)間多，移動(dòng)距離就長。Tp小=Tm小+Tr小

Tp大=Tm大+Tr大

Tp小=Tp大

Tr小<Tp小

，故Tm小>Tm大

，所以，S小>S大

顯然，要使一個(gè)DNA樣品中不同大小的DNA分子分離，脈沖時(shí)間應(yīng)選在最大DNA分子所需的上限。

第三節(jié)DNA序列分析

1.雙脫氧核苷酸鏈終止法Dideoxy-terminationsequencing

Sanger法基本原理：雙脫氧（2'，3'）-核苷酸可以象2'-脫氧核苷酸那樣直接摻入新合成的DNA鏈中，但因3’端不具OH基，DNA鏈合成至此中斷。由于雙脫氧核苷酸在每個(gè)DNA分子中摻入的位置不同，故可根據(jù)不同長度的DNA片段測定出核苷酸序列過程：制備ss-DNA→與引物退火→分為4個(gè)反應(yīng)系統(tǒng)→每個(gè)系統(tǒng)中加入dNTP（其中dATP常帶同位素標(biāo)記）和一種雙脫氧核苷酸→DNA聚合酶定序反應(yīng)→反應(yīng)產(chǎn)物變性后電泳→凝膠干燥→放射自顯影

DNASequencingReactionsTheDNAsequencingrunissimilartothePCRrun.TherunmixincludesthetemplateDNA,Taqpolymerase,dNTPs,ddNTPs,andaprimer:asmallpieceofsingle-strandedDNA20-30ntlongthathybridizestoonestrandofthetemplateDNA.TherunisintitiatedbyheatinguntilthetwostrandsofDNAseparate,thentheprimersannealstothecomplementarytemplatestrand,andDNApolymeraseelongatestheprimer.

4differentDNAsynthesisreactionsarerunbeginsynthesisfromspecificprimingpointaddcomponentsforDNAsynthesis+specificddNTPforeachofthefourreactions…e.g.ddATPNo3’OH...ddCTPACCCTTGGMethodfromSaenger

ManualsequencingusesradiolabeleddATP(35-Sor33-P)tolabeltheDNA.

Thesampleisthensplitintofourtubes

eachwithanindividualddNTPpresent.

Thesamplesarethensubjectedtoacrylamidegelelectrophoresisfollowedbyautoradiography.DNA全自動(dòng)測序PuttingItAllTogetherUsinggelelectrophoresistoseparateeachDNAfragmentthatdiffersbyasinglenucleotidewillbandeachfluorescentlytaggedterminatingddNTPproducingasequencingread.Thegelisreadfromthebottomup,from5’to3’,fromsmallesttolargestDNAfragment.屏幕顯示的膠圖RawAutomatedSequencingDataA5laneexampleofrawautomatedsequencingdata. Green: ddATP Red: ddTTP Yellow: ddGTP Blue: ddCTPSanger：熒光檢測

377測序儀人類基因組計(jì)劃測序的主力機(jī)型測序的主要設(shè)備上樣走電泳編寫樣品清單全自動(dòng)的測序儀器：MegaBace

華大基因研究中心(北京)

承擔(dān)了人類3號染色體短臂上的約3000萬對堿基的測序任務(wù)，使中國成為繼美、英、日、德、法之后第六個(gè)加入"國際測序俱樂部"的國家。中心已建成了基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、生物信息學(xué)研究及產(chǎn)業(yè)化平臺，擁有ABI377-96平板測序儀11臺，MegaBACE1000毛細(xì)管測序儀70臺。

TADA!!2001

TheHGPconsortiumpublishesitsworkingdraftinNature(15February),andCelerapublishesitsdraftinScience(16February).2.Maxam-Gilbert化學(xué)法

原理：DNA鏈上的不同堿基可以和堿基修飾劑發(fā)生反應(yīng)，然后發(fā)生1~2個(gè)堿基的脫落或取代，最后發(fā)生鏈斷裂，不同位置斷裂的DNA分子經(jīng)凝膠電泳就可確定其核苷酸序列

4種反應(yīng)體系中，化學(xué)試劑特異斷裂DNA機(jī)制G反應(yīng)：硫酸二甲脂使鳥嘌呤N7甲基化A＋G反應(yīng)：甲酸使嘌呤環(huán)上的氮質(zhì)子化導(dǎo)致糖苷鍵被削弱，使嘌呤環(huán)被吡啶取代C+T反應(yīng)：肼能裂解嘧啶環(huán)，進(jìn)而導(dǎo)致其脫落C反應(yīng)：在一定濃度的NaCl條件下，肼只對胞嘧啶起作用化學(xué)法測序的一大優(yōu)點(diǎn)是不需要模板，引物和DNA聚合酶。待測DNA鏈的檢測用32P末端標(biāo)記

作業(yè)Asolutioncontainsdouble-strandedDNAfragmentsofsize3kb,6kb,9kb,and12kb.Theyareseparatedinanelectrophoresisgel.Inthediagramofthegelattheright,matchthefragmentsizeswiththecorrectbands.

AclonedfragmentofDNAwassequencedbyusingthedideoxymethod.ApartoftheautoradiogramofthesequencinggelisrepresentedhereDeducethenucleotidesequenceoftheDNAnucleotidechainsynthesizedfromtheprimer.Labelthe5′and3′endsDeducethenucleotidesequenceoftheDNAnucleotidechainusedasthetemplatestrand.Labelthe5′and3′endsWritethenucleotidesequenceoftheDNAdoublehelix(labelthe5′and3′ends)第四節(jié)

分子雜交技術(shù)核酸雜交Southern印跡雜交（Southernblotting）Northern印跡雜交（Northernblotting）Western印跡雜交（Westernblotting

）

Southern雜交Southern雜交是指以Southern名字命名的DNA轉(zhuǎn)移雜交技術(shù)，用于特定DNA序列的檢測，包括基因組特定DNA序列的定位，相關(guān)片段的同源性測定、從cDNA庫、基因組文庫中篩選目的基因等。用一種或多種限制性內(nèi)切酶對基因組DNA加以切割，通過瓊脂糖凝膠電泳分離酶切片段，隨后，使DNA在原位變性，并從凝膠轉(zhuǎn)移至固相膜，用已知核苷酸片段加以標(biāo)記作為探針，通過分子雜交來檢測待測樣品中是否存在互補(bǔ)的核酸序列。該技術(shù)已成為分子生物學(xué)中一類重要的檢測手段。Southern印跡雜交的用途確定在克隆片段中基因編碼區(qū)的大小和位置確定克隆片段在基因組中的拷貝數(shù)SouthernblottingSouthernblottingNorthernBlotting相對Southernblotting命名的，與Southernblotting不同的是，它檢測的對象是RNA分子。

WesternBlotting雜交的對象是蛋白質(zhì)，先將蛋白質(zhì)從SDS中轉(zhuǎn)移到一固相支持物上，通過與附著于固相支持物上的靶蛋白所呈現(xiàn)的抗原抗體特異反應(yīng)進(jìn)行檢測

主要用于基因的表達(dá)產(chǎn)物蛋白質(zhì)的檢測第五節(jié)PCR技術(shù)一、PCR技術(shù)的基本原理

Polymerasechainreaction,PCR

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

AmethodforamplifyingspecificDNAsegmentsthatexploitscertainfeaturesofDNAreplication.一個(gè)DNA經(jīng)n次擴(kuò)增后,一個(gè)DNA分子可變?yōu)?n

理論上經(jīng)過30次循環(huán)，靶DNA得到109倍的擴(kuò)增，實(shí)際是106~7倍的擴(kuò)增DNA擴(kuò)增需要對待擴(kuò)增的DNA序列有所了解，至少要對其兩側(cè)的核苷酸序列為已知，以便合成寡核苷酸引物二、PCR反應(yīng)的各種組份及作用

一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系（50~100μl）

50mmol/LKCl10mmol/LTris-HCl（pH=8.4）1.5mmol/LMgCl2100μg/ml明膠或牛血清白蛋白（BSA）2個(gè)引物，各0.25μmol/LdNTP=dATP+dCTP+dGTP+dTTP）各200μmol/L模板DNA（人基因組DNA）0.1~1μgTaqDNA聚合酶2UDenaturation94℃,0.5minPrimerannealing55℃,1.5mionExtension72℃,1min30cycles變性（模板）－退火（引物與模板）－延伸（新合成DNA鏈）1.模板DNA用于PCR擴(kuò)增的模板DNA通常是從細(xì)胞中提取的染色體DNA，它們并不需要高度純化。待擴(kuò)增的靶DNA的長度在3kb以下是PCR的有效擴(kuò)增范圍，采用經(jīng)改造的TaqDNA聚合酶可擴(kuò)增出40kb的DNA片段。

2.引物PCR引物是與待擴(kuò)增的目的DNA兩端序列互補(bǔ)的人工合成的寡核苷酸片段引物的長度通常為17~30個(gè)核苷酸

引物太短，可能同非靶DNA雜交，得出非預(yù)期的擴(kuò)增產(chǎn)物；引物太長，引物與模板的結(jié)合效率降低，影響擴(kuò)增效率。

如8nt的引物，平均每48=65536bp就會(huì)有一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，在全長為3×109

bp的人類基因組中，大約有43000個(gè)可能的結(jié)合位點(diǎn)，不能得到單一的特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。如為17nt的引物，出現(xiàn)幾率為417=17,179,869,184bp，長度超過人類基因組長度的5倍，故在人類基因組中只可能有一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。但引物不是越長越好，過長的引物同模板DNA的雜交效率反而下降，從而降低PCR反應(yīng)的效率。簡并引物

是一類由多種寡核苷酸組成的混合物，彼此之間只有一個(gè)或數(shù)個(gè)核苷酸的差異。如根據(jù)氨基酸序列推測出的核苷酸序列。引物與復(fù)性溫度

引物與模板結(jié)合的特異性與復(fù)性溫度有密切關(guān)系當(dāng)復(fù)性溫度偏低時(shí)，引物與模板配對出現(xiàn)錯(cuò)配堿基，導(dǎo)致一些不需要的DNA片段被擴(kuò)增復(fù)性溫度過高，引物與模板不能配對復(fù)性溫度常與引物的長度和堿基組成有直接關(guān)系，引物越長或GC含量較高，退火的溫度可以高些，反之則低些Tm=4×(G＋C)＋2×(A＋T)℃1~2℃below引物設(shè)計(jì)的一般原則:

Correspondwiththesequencesflankingthetargetregiononthetemplatemolecule.

引物的長度常為17~30GC含量為40%~60%Tm值高于55℃兩條引物間配對堿基數(shù)小于5個(gè)引物自身配對(特別是在引物的3’端)形成的莖環(huán)結(jié)構(gòu),莖的堿基配對數(shù)不大于3

通常采用計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)3.dNTP

濃度為20~200μmol/L，4種dNTP以等摩爾濃度配制濃度過高，加快反應(yīng)速度，但可增加堿基的錯(cuò)誤摻入率和成本濃度過低，反應(yīng)速度下降，提高實(shí)驗(yàn)的精確性4.TaqDNA聚合酶

基本特點(diǎn):TaqDNA聚合酶是從