第四章 遺傳標記連鎖基因的分子診斷

第四章遺傳標記連鎖基因的分子診斷

第一節(jié)分子標記與連鎖圖譜

連鎖圖譜:又稱遺傳圖譜，通過遺傳重組信息得到的基因在染色體上的線性排列圖，顯示所知的基因和/或遺傳標記的相對位置，而不是在每條染色體上特殊的物理位置。

它是通過計算連鎖的遺傳標志之間的重組頻率，確定他們的相對距離，一般用厘摩(cM，即每次減數(shù)分裂的重組頻率為1%)來表示。繪制遺傳連鎖圖的方法有很多，但是在DNA多態(tài)性技術(shù)未開發(fā)時，鑒定的連鎖圖很少，隨著DNA多態(tài)性的開發(fā)，使得可利用的遺傳標志數(shù)目迅速擴增。如果同一條染色體上的兩個基因相對距離越長，那么他們減數(shù)分裂發(fā)生重組的概率將越大，共同遺傳的概率也就越小。因此可以根據(jù)他們后代性狀的分離可以判斷他們的交換率，也就可以判斷他們在遺傳圖譜上的相對距離。第一節(jié)分子標記與連鎖圖譜

分子標記（MolecularMarkers）：是以個體間遺傳物質(zhì)內(nèi)核苷酸序列變異為基礎(chǔ)的遺傳標記，是DNA水平遺傳多態(tài)性的直接的反映。

與其他幾種遺傳標記—形態(tài)學標記、生物化學標記、細胞學標記相比，DNA分子標記具有的優(yōu)越性有:1)大多數(shù)分子標記為共顯性，對隱性的性狀的選擇十分便利；2)基因組變異極其豐富，分子標記的數(shù)量幾乎是無限的；3)在生物發(fā)育的不同階段，不同組織的DNA都可用于標記分析；4)分子標記揭示來自DNA的變異；5)表現(xiàn)為中性，不影響目標性狀的表達，與不良性狀無連鎖；6)檢測手段簡單、迅速。

隨著分子生物學技術(shù)的發(fā)展，DNA分子標記技術(shù)已有數(shù)十種，廣泛應用于遺傳育種、基因組作圖、基因定位、物種親緣關(guān)系鑒別、基因庫構(gòu)建、基因克隆等方面。第一節(jié)分子標記與連鎖圖譜一、分子標記（一）可變數(shù)目串聯(lián)重復序列(VNTR)（二）短串聯(lián)重復序列(STR)（三）單核苷酸多態(tài)(SNP)（四）拷貝數(shù)變異(CNV)第一節(jié)分子標記與連鎖圖譜（一）可變數(shù)目串聯(lián)重復序列(VNTR)VNTR又稱小衛(wèi)星DNA(MinisatelliteDNA)，是一種重復DNA小序列，為10到幾百核苷酸，拷貝數(shù)10-1000不等。VNTR檢測方法主要依托RFLP技術(shù)，只是對限制性內(nèi)切酶和DNA探針有特殊要求：(1)限制性內(nèi)切酶的酶切位點必須不在重復序列中，以保證小衛(wèi)星或微衛(wèi)星序列的完整性。(2)內(nèi)切酶在基因組的其他部位有較多酶切位點，則可使衛(wèi)星序列所在片段含有較少無關(guān)序列，通過電泳可充分顯示不同長度重復序列片段的多態(tài)性。(3)分子雜交所用DNA探針核苷酸序列必須是小衛(wèi)星序列或微衛(wèi)星序列，通過分子雜交和放射自顯影后，就可一次性檢測到眾多小衛(wèi)星或微衛(wèi)星位點，得到個體特異性的DNA指紋圖譜。

缺點是數(shù)量有限，而且在基因組上分布不均勻，主要集中分布在染色體著絲點和端粒附近，極大限制其在基因定位中的應用。VNTR也存在實驗操作繁瑣、檢測時間長、成本高的缺點。VNTR標記分布在染色體著絲點和端粒附近第一節(jié)分子標記與連鎖圖譜一、分子標記（一）可變數(shù)目串聯(lián)重復序列(VNTR)（二）短串聯(lián)重復序列(STR)（三）單核苷酸多態(tài)(SNP)（四）拷貝數(shù)變異(CNV)第一節(jié)分子標記與連鎖圖譜（二）短串聯(lián)重復序列(STR)

STR：又稱為微衛(wèi)星DNA，重復單位為2-6bp，重復次數(shù)15~30次。STR遺傳符合孟得爾遺傳定律。這一技術(shù)廣泛應用于基因定位及克隆、遺傳圖譜構(gòu)建、數(shù)量性狀位點(QTL)定位、遺傳質(zhì)量監(jiān)測等領(lǐng)域

由核心序列和兩側(cè)保守的側(cè)翼序列構(gòu)成，核心序列重復數(shù)的差異形成了微衛(wèi)星的高度多態(tài)性，由于重復單位簡單，故又稱為簡單重復序列或簡單序列長度多態(tài)性。STR的構(gòu)成STR的類型根據(jù)核心序列重復單元的構(gòu)成與分布，微衛(wèi)星DNA可分為三種類型：STR的分布STR的產(chǎn)生機制STR的優(yōu)點用微衛(wèi)星作為遺傳標記與其他分子標記(包括和小衛(wèi)星DNA等)相比具有如下優(yōu)點:1)分布廣泛:微衛(wèi)星廣泛分布于真核生物基因組中,不僅存在于內(nèi)含子或非編碼區(qū),也存在于編碼區(qū)及染色體上的其它任一區(qū)域,大約每隔10～50kb就存在一個微衛(wèi)星。例如,豬基因組中存在著相對分子質(zhì)量約(65～100)×103拷貝的二核苷酸重復單位ACΠTG,平均每隔(30～50)kb就有一個。它的這一特點為在整個基因組中定位更多的基因提供了極大的方便。這是其他方法所遠遠不及的。

STR的優(yōu)點2)

多態(tài)性豐富:微衛(wèi)星DNA本身重復單位數(shù)的變異是形成微衛(wèi)星位點多態(tài)性的基礎(chǔ)。這一特點也是RFLP和RAPD不能相比的。對于RFLP來說,它主要是由于堿基突變導致限制性酶切位點的丟失或獲得,所以大多數(shù)RFLP表現(xiàn)為二態(tài)性,雜合率低于50%,所提供的信息含量低,多態(tài)信息含量僅為0.2左右。而RAPD僅表現(xiàn)出顯性遺傳,故不能直接區(qū)分雜合子和純合子。而微衛(wèi)星標記遵循孟德爾遺傳法則,呈共顯性遺傳,因此能很好地區(qū)分純合子與雜合子。就多態(tài)性的豐富程度來說,只有小衛(wèi)星DNA可與微衛(wèi)星DNA相比,這兩者互相補充,將可滿足基因連鎖分析中對高多態(tài)性遺傳標記的需要。STR的優(yōu)點3)

檢測方法簡便:一個高度多態(tài)序列的等位基因小于500bp并且變動范圍窄,則可以用PCR結(jié)合凝膠電泳法檢測,因而微衛(wèi)星序列就很好地符合了上述標準。微衛(wèi)星PCR擴增所需樣本量極少,并且由于微衛(wèi)星序列較短,即使降解的DNA也可能包含足夠用來擴增的微衛(wèi)星序列。隨著高效精確的基因分型自動化技術(shù)的發(fā)展,微衛(wèi)星基因型檢測將會更加快捷方便。目前,微衛(wèi)星位點的檢測一般采用以互補于兩個側(cè)翼序列的寡核苷酸(約20nt)作為引物通過PCR擴增,然后再用測序凝膠分離檢測其結(jié)果。一個位點的檢測一般可在24h完成,且可同時進行多位點的檢測。4)中性標記:在多數(shù)情況下,微衛(wèi)星標記沒有任何表型效應,因而不存在對動物個體的有害或次級效應。STR的不足由于在不同物種中微衛(wèi)星側(cè)翼序列有所不同,針對不同物種,尤其是一些珍稀物種,往往需要進行費時費力的特異性引物設(shè)計。

目前針對微衛(wèi)星的研究普遍是基于等位基因之間只存在重復單位數(shù)目差異的假設(shè),通過使用與重復序列兩端的側(cè)翼序列配對的引物進行PCR擴增,再經(jīng)電泳分離不同等位基因。但是,該方法沒有真實反映出微衛(wèi)星位點在DNA序列上的變異。一些研究顯示微衛(wèi)星位點在序列上也存在許多變異。STR的不足一些研究顯示微衛(wèi)星位點在序列上也存在許多變異。例如Clisson等發(fā)現(xiàn)在不同靈長類物種之間,微衛(wèi)星重復序列兩端的側(cè)翼序列可以發(fā)生插入或缺失,而且多為幾個相鄰堿基同時發(fā)生。而Garza等也發(fā)現(xiàn)微衛(wèi)星的重復單位序列存在不足。這些結(jié)果反映出微衛(wèi)星進化的復雜性,從而可能出現(xiàn)同源異型(微衛(wèi)星重復序列相同,但PCR產(chǎn)物長度不同)或者是異源同型(微衛(wèi)星重復序列不同.但PCR產(chǎn)物長度相同)。因此,單純使用PCR產(chǎn)物片段進行研究可能得出錯誤結(jié)果。STR的不足此外,PCR擴增受到許多因素的影響,使一些等位基因無法被擴增出來。比如發(fā)生在引物3’端配對堿基的突變可以嚴重影響PCR效率。這些沒有被擴增的等位基因稱為“無效基因”(nullallele)。無效基因的存在會影響結(jié)果的正確性。第一節(jié)分子標記與連鎖圖譜一、分子標記（一）可變數(shù)目串聯(lián)重復序列(VNTR)（二）短串聯(lián)重復序列(STR)（三）單核苷酸多態(tài)(SNP)（四）拷貝數(shù)變異(CNV)SNPSNP，singlenucleotidepolymorphism，單核苷酸多態(tài)性。是指基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性,在群體中的發(fā)生頻率不小于1%。包括單個堿基的轉(zhuǎn)換、顛換、插入和缺失等轉(zhuǎn)換是指同型堿基之間G-A,T-C顛換是指發(fā)生在嘌呤與嘧啶之間A-T、A-C、C-G、G-TSinglenucleotidepolymorphismSNP依據(jù)排列組合原理一共可以有6種替換情況A/G、A/T、A/C、C/G、C/T和G/T但事實上,轉(zhuǎn)換的發(fā)生頻率占多數(shù),而且是C-T轉(zhuǎn)換為主，具有轉(zhuǎn)換型變異的SNP約占SNP總量的2／3左右。其原因是CpG的C是甲基化的,容易自發(fā)脫氨基形成T。SNP大都表現(xiàn)為二等位基因（bialletic)多態(tài)性,即在該位置只存在兩種不同的堿基。位于染色體上某一區(qū)域的一組相關(guān)聯(lián)的SNP等位位點被稱作單倍型(haplotype)，相鄰SNPs的等位位點傾向于以一個整體遺傳給后代.SNPSNPSNP發(fā)生頻率在動物基因組中分布廣泛如果隨即抽取兩個人的基因組對比,大概1000個堿基就會出現(xiàn)1個SNP如果樣本數(shù)增加,SNP會繼續(xù)增加300-600bp即會出現(xiàn)1個SNP根據(jù)SNP在基因組中的分布位置可分為:

基因編碼區(qū)SNP(cSNP)

基因調(diào)控區(qū)SNP(pSNP)

基因間隨機編碼區(qū)SNP(rSNP)

因為編碼區(qū)內(nèi)的變異率占周圍序列的1/5，cSNP的總量顯著少于其他兩類SNPs。cSNP又可分為2種：同義cSNP(synonymouscSNP)和非同義cSNP(non-synonymouscSNP)SNP的分類同義cSNP：

SNP所導致的編碼序列改變并不影響其所翻譯的蛋白質(zhì)的氨基酸序列，突變堿基與未突變堿基的含義相同；非同義cSNP：指堿基序列的改變可使以其為藍本翻譯的蛋白質(zhì)序列發(fā)生改變，從而影響蛋白質(zhì)的功能。這種改變常常是導致生物性狀改變的直接原因。位于基因調(diào)控區(qū)的SNP則會影響基因表達量的多少，因此，這兩類SNP在功能和疾病發(fā)生發(fā)展方面具有更重要的意義。SNPSNP的應用（宏觀意義）基因組制圖中的應用在種族遺傳學和連鎖不平衡性分析中的應用醫(yī)學中疾病易感性研究中的應用藥物基因組學研究中的應用臨床耐藥研究中的應用遺傳育種的應用SNP的特點在遺傳學分析中,SNP作為一類遺傳標記得以廣泛應用,主要源于這幾個特點:（1）密度高:SNP在人類基因組的平均密度估計為1\1000bp,在整個基因組的分布達3×106個,遺傳距離為2～3cM,密度比微衛(wèi)星標記更高,可以在任何一個待研究基因的內(nèi)部或附近提供一系列標記。（2）富有代表性:某些位于基因內(nèi)部的SNP有可能直接影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)或表達水平,因此,它們可能代表疾病遺傳機理中的某些作用因素。SNP的特點（3）遺傳穩(wěn)定性:

與微衛(wèi)星等重復序列多態(tài)性標記相比,SNP具有更高的遺傳穩(wěn)定性。（4）易實現(xiàn)分析的自動化:SNP標記在人群中只有兩種等位型(allele)。這樣在檢測時只需一個“+\-”或“全\無”的方式，而無須象檢測限制性片段長度多態(tài)性，微衛(wèi)星那樣對片段的長度作出測量，這使得基于SNP的檢測分析方法易實現(xiàn)自動化。SNPs經(jīng)典檢測方法一大類是以凝膠電泳為基礎(chǔ)的傳統(tǒng)經(jīng)典的檢測方法,如:1.限制性片段長度多態(tài)性法PCR-RFLP;2.單鏈構(gòu)象多態(tài)性法PCR-SSCP;3.變性梯度凝膠電泳(DGGE);4.等位基因特異性PCR(allelespecificPCR,ASPCR)等等SNPs高通量的檢測方法

另一大類檢測方法是近些年來發(fā)展起來的,高通量、自動化程度較高的檢測SNPs的方法,較為常用的有:1.DNA測序法;2.DNA芯片檢測;3.飛行質(zhì)譜儀(MALDI-TOFMS)檢測;4.變性高效液相色譜(DHPLC)法等等第一節(jié)分子標記與連鎖圖譜一、分子標記（一）可變數(shù)目串聯(lián)重復序列(VNTR)（二）短串聯(lián)重復序列(STR)（三）單核苷酸多態(tài)(SNP)（四）拷貝數(shù)變異(CNV)

拷貝數(shù)變異(CNVs)CNVs是人類基因組內(nèi)從1kb到幾個Mb的DNA片段拷貝數(shù)的不同，包括DNA片段的刪除、插入、復制和復合多位點的變異等類型。以往一直認為DNA的SNPs是遺傳變異最常見的形式，而當前的研究表明CNVs不僅廣泛存在于正常個體，且在整個基因組中覆蓋的核苷酸總數(shù)至少是SNPs的3倍，可見CNVs可能在遺傳變異和物種進化方面比SNPs起著更為重要的作用，是今后研究包括眼病在內(nèi)的人類疾病的熱點。CNVs定義

目前發(fā)現(xiàn)的人類基因組中CNVs的個數(shù)遠遠低于～1200萬的SNPs，但是，它們覆蓋的染色體長度至少達到150Mb，這也是目前任何一種遺傳標志都不能比擬的。另外，CNVs在染色體上的分布具有非隨機性，它與其他的基因組特征，如外顯子、可移動元件(如Alu重復序列)等密切相關(guān)，而這些基因組特征通常是導致疾病發(fā)生的遺傳學基礎(chǔ)之。此外，它們的分布還具有明顯的富集區(qū)和稀有區(qū)，例如人類染色體上有250Mb的區(qū)域超過50%的序列發(fā)生CNVs，而有60Mb的區(qū)域90%以上的序列位于CNV中．這些富集區(qū)主要集中在近著絲粒和亞端粒區(qū)等具有高度多態(tài)和進化不穩(wěn)定的區(qū)域。CNVs特點CNVs特點CNVs除了具有上面提到的覆蓋范圍廣、組成形式多樣的特點以外，還具有其作為疾病易感標志的三個重要特點--可遺傳性、相對穩(wěn)定性和高度異質(zhì)性．利用父母-子女三人同胞對(Trios)樣本分析時發(fā)現(xiàn)，子女中絕大多數(shù)的CNVs遺傳自父母，這些位點成為遺傳性CNVs(inheritedCNVs)，而新發(fā)生的與父母染色體同源序列重合率<50%的CNV，稱為新的CNV或新的拷貝數(shù)突變(DenovoCNVs）

此外，目前的研究認為，CNVs具有與SNPs相似程度的人種差異，即不同人群之間可能共享大部分相同的CNVs，而部分CNVs在不同人群中以不同頻率分離并有顯著性差異．CNVs具有的上述人群遺傳學特點，其多態(tài)性成為一種新的遺傳標記，可以用于鑒定疾病易感基因位點的關(guān)聯(lián)分析．CNVs特點CNV的組成形式CNVs既可以是簡單的DNA結(jié)構(gòu)變化(如單一片段的擴增、缺失、插入)，也可以是復雜的染色體擴增、缺失和插入的各種組合形式．Redon等根據(jù)CNVs的遺傳和組成形式，將CNVs分為5類： a．缺失， b．擴增， c．同一位點并發(fā)的缺失與擴增， d．多等位基因位點， e．復雜難以描述的位點．

通常擴增比缺失更為常見，并覆蓋更大的范圍，這主要是因為染色體大片段缺失通常會引起更為嚴重的表型后果，難以在進化中保留下來.CNVS的幾種組成形式圖解CNV的組成形式另外一個與CNVs相關(guān)的概念是重復片段倍增(segmentalduplication，SDs)，它是指參考基因組序列中出現(xiàn)DNA片段長度>1kb的兩個或兩個以上拷貝，不同拷貝之間的序列同源性>90%．全基因組中SDs的密度約是4%～5%，而CNVs富集區(qū)的SDs平均密度約25%，CNVs稀有區(qū)的平均密度近2%～3%．因此，CNVs和SDs的發(fā)生具有高度相關(guān)性，表明兩者可能具有相似的發(fā)生學基礎(chǔ)．目前認為SDs也是CNVs的一種組成形式．CNVs潛在的形成機制

CNV的發(fā)生,或者說絕大多數(shù)CNV的發(fā)生是非等位基因同源重組(non-allelichomologousrecombination,NAHR)的結(jié)果(Shaffer&

Lupski,2000;Cooperetal.,2007;Kiddetal.,2008)。也有許多學者認為,NAHR只能解釋少量的CNV,其產(chǎn)生的機制更有可能是非同源末端連接(non-homologousendjoining,NHEJ）。轉(zhuǎn)座和反轉(zhuǎn)座也被認為是產(chǎn)生CNV變異的重要因素之一。

CNVs影響基因表達機制

有關(guān)CNV對表型的調(diào)控作用,Beckmann等(2007)認為可能主要通過以下幾種機制來實現(xiàn):(1)重復/缺失數(shù)目本身的劑量效應(dosageeffect);(2)CNV改變了基因的結(jié)構(gòu),對基因的表達產(chǎn)物產(chǎn)生影響;(3)CNV的多態(tài)影響到基因的表達水平,進而影響到基因的外顯率;(4)CNV具有長距離的調(diào)控作用,只要和基因同線,就可能對多個基因的表達產(chǎn)生影響。

盡管在人類基因組中已發(fā)現(xiàn)的CNV的數(shù)量超過6,000個,但只有少數(shù)的CNV覆蓋了功能基因及基因的調(diào)控因子,絕大多數(shù)CNV和表型可能無關(guān)或?qū)Ρ硇偷呢暙I率很低。最直接的證據(jù)是絕大多數(shù)CNV的發(fā)現(xiàn)均是源于大樣本中正常表型個體的檢測而發(fā)現(xiàn)的。CNVs影響基因表達機制

CNVS的檢測方法

a.比較基因組雜交芯片是目前檢測CNV多態(tài)性最常用的方法。b.SNP芯片是另一種有效檢測CNV的技術(shù)。c.定量PCR也可用于CNV的檢測。d.基于不同個體的DNA序列比對是檢測CNV的最直接的方法,這種方法的最大優(yōu)勢是圖譜的清晰度可以達到單核苷酸水平。但由于測序費用的昂貴,要對一個群體的多個個體進行基因組測序還不現(xiàn)實。CNVS與疾病CNVs通過擾亂基因活性和改變基因劑量來影響基因表達、表型差異和表型適應,從而引起疾病?；蚩截悢?shù)變異是個體之間在基因組序列差異上的一個重要源泉，是研究基因組進化和表型差異的一個重要因素。許多關(guān)于基因拷貝數(shù)變異的研究結(jié)果表明，拷貝數(shù)變異可導致不同程度的基因表達差異，對正常表型的構(gòu)成及疾病的發(fā)生發(fā)展具有一定作用。

遺傳性CNVs通常是某些疾病具有家族聚集性的遺傳學基礎(chǔ)，新的拷貝數(shù)突變可能導致某些散發(fā)性疾病的發(fā)生。長期以來,人們一直關(guān)注比較小的變異,如單核苷酸多態(tài)性(SNPs)。實際上,一些疾病更有可能是由于拷貝數(shù)的變異所引起的。例如,CCL3L1基因的CNVs一定程度上決定著對艾滋病病毒感染的抗性,而CCL3L1基因在SNP圖譜上則找不到變異。CNVS與疾病

通過CNV全基因組關(guān)聯(lián)分析評價新的拷貝數(shù)突變在散發(fā)性疾病中的作用。傳統(tǒng)認為，遺傳性疾病通常是指遺傳性狀與改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、功能或調(diào)節(jié)的突變堿基以孟德爾遺傳方式分離。然而，臨床遺傳學家發(fā)現(xiàn)，至少有97%的疾病是散發(fā)的，而且不涉及任何基因的突變，僅僅源于CNVs。CNVS與疾病

那么散發(fā)性疾病的分子基礎(chǔ)是什么呢？目前認為它通常是由一個染色體異?；螂[性性狀或新的顯性突變引起的．據(jù)估計新的基因組重組位點特異突變率介于10-6到10-4之間，至少比點突變率高2～4個數(shù)量級．因此對于大部分散發(fā)性疾病病例來說(甚至可能包括遺傳性疾病)，新的拷貝數(shù)突變可能是一個主要的遺傳性機制．也有可能部分散發(fā)性疾病源于分布于相同或不同位點的兩個不同(父母)來源的CNVs組合，而僅攜帶其中之一的個體不會發(fā)病．

因此，當前的CNV全基因組關(guān)聯(lián)分析為研究散發(fā)性疾病的分子機制提供了一條有效路徑．CNVS與疾病

對于復雜疾病來講，由于致病性變異可能分布在不同的染色體上，因此以SNPs為基礎(chǔ)的關(guān)聯(lián)分析對疾病易感位點的檢出能力有限，即單一位點的SNPs等位基因無法有效地將受累個體和健康對照區(qū)分開來．然而，對于致病性CNVs來說，則不存在這樣的問題．因為CNVs引起的基因劑量改變足以改變表型．所以拷貝數(shù)變異的全基因組關(guān)聯(lián)分析更容易鑒定到致病突變．目前CNVs與SNPs研究

在與CNVs相關(guān)的病例研究中,利用SNPs卻鑒定不出病因所在的基因組區(qū)域,因為這些區(qū)域中的SNPs達不到所研究樣本中孟德爾遺傳規(guī)律或哈代溫博定律所要求的標準。這種現(xiàn)象在復雜多等位基因的CNVs中尤為突出,原因可能是CNVs在基因組中不斷的擴張或收縮。目前CNVs與SNPs研究

SNP和CNV分別捕獲了基因表達的遺傳變異的83.6%和17.7%,兩種類型的變異很少重疊。目前有學者認為，SNPs、CNVs的組成與拷貝數(shù)以及環(huán)境因子都參與疾病特定表型的產(chǎn)生，因此在進行全基因組關(guān)聯(lián)分析時，應當盡可能結(jié)合SNPs和CNVs基因分型結(jié)果。因為在人類基因組中snp的豐富性，所以,Conradetal.(2006)和McCarrolletal.(2006)推測這些snp也許可用來發(fā)現(xiàn)潛在的CNVS，如果這些CNVS影響了snp基因型分型實驗的結(jié)果。目前CNVs與SNPs研究

第一節(jié)分子標記與連鎖圖譜二、遺傳圖譜構(gòu)建的基本步驟（一）建立參考家系（二）基因型分析（三）通過標記間的連鎖分析，構(gòu)建遺傳連鎖圖譜第一節(jié)分子標記與連鎖圖譜二、遺傳圖譜構(gòu)建的基本步驟（一）建立參考家系要構(gòu)建DNA標記連鎖圖譜，必須建立作圖群體。建立作圖群體需要考慮的重要因素包括親本的選配、分離群體類型的選擇及群體大小的確定等。第一節(jié)分子標記與連鎖圖譜二、遺傳圖譜構(gòu)建的基本步驟（一）建立參考家系(1)親本的選配:首先要考慮親本間的DNA多態(tài)性。選擇親本時應盡量選用純度高的材料，并進一步通過自交進行純化。要考慮雜交后代的可育性。選配親本時還應對親本及其F1雜種進行細胞學鑒定。第一節(jié)分子標記與連鎖圖譜二、遺傳圖譜構(gòu)建的基本步驟（一）建立參考家系(2)分離群體類型的選擇:根據(jù)其遺傳穩(wěn)定性可將分離群體分成兩大類：一類稱為暫時性分離群體，如F2、F3、F4、BC、三交群體等，這類群體中分離單位是個體，一經(jīng)自交或近交其遺傳組成就會發(fā)生變化，無法永久使用。另一類稱為永久性分離群體，如RI、DH群體等，這類群體中分離單位是株系，不同株系之間存在基因型的差異，而株系內(nèi)個體間的基因型是相同且純合的，是自交不分離的。這類群體可通過自交或近交繁殖后代，而不會改變?nèi)后w的遺傳組成，可以永久使用。第一節(jié)分子標記與連鎖圖譜二、遺傳圖譜構(gòu)建的基本步驟（一）建立參考家系(3)群體大小的確定:

遺傳圖譜的分辨率和精度，很大程度上取決于群體大小。群體越大，則作圖精度越高。但群體太大，不僅增大實驗工作量，而且增加費用。因此確定合適的群體大小是十分必要的。a.合適群體大小的確定與作圖的內(nèi)容有關(guān)。從作圖效率考慮，作圖群體所需樣本容量的大小取決于以下兩個方面：是從隨機分離結(jié)果可以辨別的最大圖距。是兩個標記間可以檢測到重組的最小圖距。b.作圖群體大小還取決于所用群體的類型。在分子標記連鎖圖的構(gòu)建方面，為了達到彼此相當?shù)淖鲌D精度，所需的群體大小的順序為F2>RI>BC1>DH。第一節(jié)分子標記與連鎖圖譜二、遺傳圖譜構(gòu)建的基本步驟（一）建立參考家系（二）基因型分析（三）通過標記間的連鎖分析，構(gòu)建遺傳連鎖圖譜（1）連鎖的兩點檢測（2）利用最大似然法估計重組率（3）似然比與連鎖分析（4）多點分析與基因直線排序基因重組和連鎖理論連鎖圖譜構(gòu)建的理論基礎(chǔ)是染色體的交換與重組?；虻倪B鎖是位于同一染色體上的基因在遺傳過程中一般傾向于維系在一起?；虻闹亟M是通過一對同源染色體的兩個非姊妹染色單體之間的交換來實現(xiàn)的。

ShCshc二分體ShCShCShCShCShCshcshcshcshcshcshCShcCShCShCShcShCshcshcshcsh四分體全部親組合占94％3％親組合3％重組合6%細胞交換F1新新新shcshcShCShCP1P294％細胞無交換重組型配子所占的比例取決于減數(shù)分裂細胞中發(fā)生交換的頻率。交換頻率越高，則重組型配子的比例越大。重組型配子最大可能的比例是50%，這時在所有減數(shù)分裂的細胞中，在兩對基因的連鎖區(qū)段上都發(fā)生交換，相當于這兩對基因間無連鎖，表現(xiàn)為獨立遺傳。重組型配子占總配子的比例稱為重組率，用r表示。重組率的高低取決于交換的頻率，而兩對基因之間的交換頻率取決于它們之間的直線距離。重組率的值變化于完全連鎖時的0%到完全獨立時的50%之間。因此重組率可用來表示基因間的遺傳圖距，圖距單位用厘摩（centi-Morgan，cM）表示，1cM的大小大致符合1%的重組率。通過標記間的連鎖分析，構(gòu)建遺傳連鎖圖譜（1）連鎖兩點檢測

如果兩個基因座位于同一染色體上且相距較近，則在分離后代中通常表現(xiàn)為連鎖遺傳。對兩個基因座之間的連鎖關(guān)系進行檢測，稱為兩點檢測。了解各基因座位的等位基因分離是否符合孟德爾分離比例，這是連鎖檢驗的前提：

在共顯性條件下，F(xiàn)2群體中一個座位上的基因型分離比例為1:2:1，而BC1和DH群體中分離比例均為1:1；在顯性條件下，F(xiàn)2群體中分離比例為3:1，而BC1和DH群體中分離比例仍為1:1。檢驗DNA標記的分離是否偏離孟德爾比例，一般采用

2檢驗。（2）利用最大似然法估計重組率兩個連鎖座位不同基因型出現(xiàn)的頻率是估算重組值的基礎(chǔ)。在一般的遺傳學教材中，重組值的估計是根據(jù)分離群體中重組型個體占總個體的比例來估計的。這種估計方法無法得到估計值的標準誤差，因而無法對估值進行顯著性檢驗和置信區(qū)間估計。采用最大似然法進行重組率的估計可解決這一問題。最大似然法以滿足其估計值在觀察結(jié)果中出現(xiàn)的概率最大為條件。在人類遺傳學研究中，由于通常不知道父母的基因型或父母中標記基因的連鎖相是相斥還是相引，因而無法簡單地通過計算重組體出現(xiàn)的頻率來進行連鎖分析，而必須通過適當?shù)慕y(tǒng)計模型來估算重組率，并采用似然比檢驗的方法來推斷連鎖是否存在，即比較假設(shè)兩座位間存在連鎖（r<0.5）的概率與假設(shè)沒有連鎖（r=0.5）的概率。通過標記間的連鎖分析，構(gòu)建遺傳連鎖圖譜（3）似然比與連鎖分析

這兩種概率之比可以用似然比統(tǒng)計量來表示，即L（r）/L（0.5），其中L（）為似然函數(shù)。為了計算方便，常將L（r）/L（0.5）取以10為底的對數(shù)，稱為LOD值。要確定兩對基因之間存在連鎖，一般要求似然比大于1000:1，即LOD>3；要否定兩對基因連鎖的存在，則要求似然比小于100:1，即LOD<2。在其它生物遺傳圖譜的構(gòu)建中，似然比的概念也用來反映重組率估值的可靠性程度或作為連鎖是否真實存在的一種判斷尺度。通過標記間的連鎖分析，構(gòu)建遺傳連鎖圖譜（4）多點檢測對多個座位進行聯(lián)合分析，利用多個座位間的共分離信息來確定它們的排列順序，也就是多點檢測。

在未知各基因座位于哪條染色體的情況下：兩點檢測，根據(jù)兩點測驗的結(jié)果，將那些基因座分成不同的連鎖群，然后再對各連鎖群（染色體）上的座位進行多點連鎖分析。

在一條染色體上，經(jīng)過多次多點測驗，就能確定出最佳的基因排列順序，并估計出相鄰基因間的遺傳圖距，從而構(gòu)建出相應的連鎖圖。通過標記間的連鎖分析，構(gòu)建遺傳連鎖圖譜第一節(jié)分子標記與連鎖圖譜三、禽畜基因組計劃進展（一）雞基因組計劃（二）?；蚪M計劃（三）綿羊基因組計劃（四）豬基因組計劃第二節(jié)基因定位的技術(shù)方法

第二節(jié)基因定位的技術(shù)方法

基因定位→QTL定位

什么是QTL？什么是數(shù)量性狀？第二節(jié)基因定位的技術(shù)方法

數(shù)量性狀（quantitativecharacters）是指在一個群體內(nèi)的各個體間表現(xiàn)為連續(xù)變異的性狀，如動植物的高度或長度等。數(shù)量性狀較易受環(huán)境的影響，在一個群體內(nèi)各個個體的差異一般呈連續(xù)的正態(tài)分布，難以在個體間明確地分組。第二節(jié)基因定位的技術(shù)方法

第二節(jié)基因定位的技術(shù)方法

第二節(jié)基因定位的技術(shù)方法

第二節(jié)基因定位的技術(shù)方法

第二節(jié)基因定位的技術(shù)方法

第二節(jié)基因定位的技術(shù)方法

第二節(jié)基因定位的技術(shù)方法

QTL(quantitativetraitlocus)，數(shù)量性狀座位或者數(shù)量性狀基因座，它指的是控制數(shù)量性狀的基因在基因組中的位置。

對QTL的定位必須使用遺傳標記，人們通過尋找遺傳標記和感興趣的數(shù)量性狀之間的聯(lián)系，將一個或多個QTL定位到位于同一染色體的遺傳標記旁，換句話說，標記和QTL是連鎖的。近幾年QTL定位應用的較為廣泛，在人類基因上與疾病有關(guān)的基因定位甚多。一、QTL定位的原理第二節(jié)基因定位的技術(shù)方法

第二節(jié)基因定位的技術(shù)方法

第二節(jié)基因定位的技術(shù)方法

第二節(jié)基因定位的技術(shù)方法

二、QTL定位方法（一）候選基因（二）基因組掃描第二節(jié)基因定位的技術(shù)方法

二、QTL定位方法（二）基因組掃描1.實驗設(shè)計1)近交系間或存在差異的群體間雜交（也稱異化群體）2)遠交群體的雜交第二節(jié)基因定位的技術(shù)方法

近交系（inbredline）：在動、植物中，通過親代與子代重復雜交若干代而獲得的遺傳型相對純一的純系。近交系中，個體的性狀會逐步趨于穩(wěn)定一致，然而其生活力則降低。指隨著反復連續(xù)地近親交配，具有不同性狀的個體進行分離，成為基因純合體系統(tǒng)。最終完成的