第16章 DNA的生物合成和損傷修復(熊宇芳)

DNA的合成及重組

DNABiosynthesisandRecombination第十六章DNA生物合成DNA復制（DNA指導的DNA合成）逆轉(zhuǎn)錄

(逆轉(zhuǎn)錄病毒RNA指導的DNA合成)校正復制中可能出現(xiàn)的錯誤，并修復受到損傷的DNA細胞中酶促修復系統(tǒng)自然界DNA重組和基因轉(zhuǎn)移的基本方式基因組復制的主要特點TheGeneralfeaturesofGenomeReplication

第一節(jié)一、基因組是細胞或病毒全部遺傳信息的總和

含有一種生物的一整套遺傳信息的遺傳物質(zhì)，稱為基因組（genome）。在真核生物體中，基因組是指一套完整單倍體DNA（染色體DNA）和線粒體DNA的全部序列，既包括編碼序列，也包括非編碼序列。二、基因組DNA復制具備一些共同特征（一）基因組DNA都具有固定的復制起始點（二）復制過程中形成復制泡和復制叉（三）復制的基本單位稱為復制子

（四）半保留復制方式保證遺傳信息的忠實傳遞

（五）半不連續(xù)復制克服了DNA空間結構對DNA新鏈合成的制約

（六）復制起點由多個短重復序列組成

（七）DNA復制必須有引物復制起點（origin）：指DNA復制所必需的一段特殊的DNA序列。

（一）基因組DNA都具有固定的復制起始點雙螺旋DNA復制時，復制區(qū)生長點的結構呈Y形或叉形，稱之為復制叉。（二）復制過程中形成復制泡和復制叉目錄從一個DNA復制起點起始的DNA復制區(qū)域，它是一個獨立復制單位，包括復制起點和終點。復制子（replicon）（三）復制的基本單位稱為復制子

（四）半保留復制方式保證遺傳信息的忠實傳遞（1）全保留式（conservative），即恢復原來的DNA雙螺旋，并產(chǎn)生一個新的子代DNA雙螺旋；（2）半保留式（semiconservative），即新老搭配，由一條新合成的DNA鏈和一條復制模板鏈配對產(chǎn)生子代雙螺旋DNA；（3）散布式（dispersive），即復制模板鏈被分成許多小片段，散布于子代DNA中。兩條新合成的DNA鏈和兩條原來的復制模板鏈之間的結合方式可能性：密度梯度實驗

——實驗結果支持半保留復制方式含重氮-DNA的細菌培養(yǎng)于普通培養(yǎng)液

第一代繼續(xù)培養(yǎng)于普通培養(yǎng)液

第二代梯度離心結果前導鏈（leadingstrand）:DNA復制時，一條鏈的合成方向和復制叉前進方向相同，可以連續(xù)復制合成的新鏈。后隨鏈（laggingstrand）:另一條鏈的合成方向與復制叉前進方向相反，不能連續(xù)復制，只能分成若干小片段分別合成，然后連接起來形成新鏈。后隨鏈中的小片段稱為岡崎片段（Okazakifragments)。（五）半不連續(xù)復制克服了DNA空間結構對DNA新鏈合成的制約前導鏈連續(xù)復制而后隨鏈不連續(xù)復制，即DNA半不連續(xù)復制。復制起點的一般特征:①由多個獨特的短重復序列組成。②短重復序列被多亞基的復制起始因子所識別并結合。③一般富含AT，利于雙螺旋DNA解旋，以產(chǎn)生單鏈DNA復制模板。（六）復制起點由多個短重復序列組成E.coli復制起始點oriCGATTNTTTATTT···GATCTNTTNTATT···GATCTCTTATTAG···11317293244···TGTGGATTA-‖-TTATACACA-‖-TTTGGATAA-‖-TTATCCACA5866166174201209237245

同向重復序列

反向重復序列5

3

5

3

酵母復制起點為自主復制序列（autonomouslyreplicatingsequences，ARS）：酵母染色體含有多個復制起點。元件A(富含A/T的共有序列)：結合一個特異的蛋白質(zhì)復合物──復制起點識別復合物(ORC)。

3個序列(B1、B2和B3)可以增加復制起點的效率，其中B2的9個堿基與上述ARS共有序列相同。酵母復制起始點DNA聚合酶不能從游離的核苷酸開始合成DNA鏈，必須由引物（primer）提供自由的3

-OH末端，通過加入核苷酸使之不斷延伸。所有細胞和多數(shù)病毒的DNA復制，首先利用模板合成一段RNA引物，這一過程為引發(fā)（priming）。RNA引物5

端的第一個核苷酸通常是pppA（個別為pppG）。（七）DNA復制必須有引物1.多數(shù)DNA復制使用RNA引物

174等噬菌體以雙鏈環(huán)形DNA的一條鏈上產(chǎn)生切口處的3

-OH為引物；腺病毒及某些線性DNA病毒以結合于病毒DNA的5

端磷酸基團的末端蛋白上的dCTP的3

-OH為引物開始復制。2.個別DNA復制以DNA或核苷酸為引物三、不同基因組DNA通過不同的模式

進行復制（一）真核生物基因組DNA復制過程涉及反轉(zhuǎn)錄（二）基因組單鏈DNA通過復制中間體完成復制

（三）有的基因組DNA通過RNA中間體進行復制

（四）雙鏈環(huán)狀DNA也有不同的復制方式四、不同基因組RNA通過不同的

模式進行復制（一）基因組雙鏈RNA復制過程是雙鏈復制

（二）基因組單鏈正鏈RNA以負鏈為模板進

行復制

（三）基因組單鏈負鏈RNA以正鏈RNA為模板進行復制

（四）反轉(zhuǎn)錄病毒的基因組RNA通過DNA中間體進行復制

DNA復制過程

ProcessofDNAReplication第二節(jié)一、原核生物DNA復制體現(xiàn)了復制的基本過程和特征（一）在復制起點解旋酶和多種因子形成復合物

1.E.coli復制起始需要6種蛋白質(zhì)因子

2.解螺旋酶激活引發(fā)酶形成引發(fā)體

3.解旋還需要促旋酶和SSB

DnaA、DnaB、DnaC、HU、促旋酶（gyrase，即拓撲異構酶Ⅱ）、單鏈DNA結合蛋白(singlestrandbindingprotein,SSB)DNA復制需要6種蛋白因子：E.coliDNA復制起始

結合oriC的4個9bp反向重復序列形成復制起始復合物。作用于oriC的3個13bp正向重復序列，DNA在這3個位點解鏈，形成開放型復合物（opencomplex）。DnaA蛋白5

3

解旋酶作用產(chǎn)生兩條復制模板鏈激活引發(fā)酶DnaG蛋白DnaB蛋白與引發(fā)酶結合，形成引發(fā)體DnaB蛋白使一條DNA鏈圍繞著另一條旋轉(zhuǎn)，消除解旋產(chǎn)生的張力。促旋酶SSB蛋白HU蛋白穩(wěn)定解旋后的單鏈DNA構象，有助于解旋。DNA結合蛋白，對復制起促進作用。HU蛋白能夠使DNA發(fā)生折疊。E.coli中DnaB結合引發(fā)酶DnaG，催化合成RNA引物，其序列始于pppAG，模板鏈序列3

-GTC-5

，引物長度一般11~12個堿基。（二）引發(fā)酶合成RNA引物負責切除RNA引物。（三）復制時聚合酶Ⅲ催化DNA合成而聚合酶Ⅰ切除引物DNA聚合酶Ⅰ可利用損傷尚未修復的DNA鏈作為模板合成DNA，但不能修復損傷。負責合成DNA。DNA聚合酶ⅢDNA聚合酶ⅡTLS1Rev1TLS，體細胞高變1Pol

相對準確的TLS（穿越環(huán)丁烷二聚體）1Pol

TLS1Pol

體細胞高變（somatichypermutation）1Pol

減數(shù)分裂相關的DNA損傷修復1Pol

TLS1Pol

DNA交聯(lián)損傷修復1Pol

DNA復制，核苷酸切除修復，堿基切除修復4Pol

DNA復制，核苷酸切除修復，堿基切除修復2~3Pol

線粒體DNA復制和損傷修復3Pol

堿基切除修復1Pol

合成引物4Pol

功能亞基數(shù)目真核生物TLS（translesionsynthesis）3PolⅤ(UmuC,UmuD)DNA損傷修復，穿越損傷合成（TLS）1PolⅣ(DinB)染色體DNA復制9PolⅢ全酶染色體DNA復制3PolⅢ核心酶DNA損傷修復1PolⅡ去除RNA引物，DNA損傷修復1PolⅠ功能亞基數(shù)目原核生物（E.coli）原核、真核細胞DNA聚合酶的類型和功能目錄２個核心酶1個

-復合物（

、

、

、

、

、

6種亞基）可滑動的DNA夾子（含1對

-亞基）DNA聚合酶Ⅲ全酶結構全酶結構包括：

亞基（130000）主要功能是合成DNA

亞基具有3

5

外切酶活性（校正功能）

亞基可增強其活性

亞基可能起組裝作用核心酶由

、

和

亞基組成：2個

-亞基分別和1個核心酶相互作用，其柔性連接區(qū)可以確保在復制叉1個全酶分子的2個核心酶能夠相對獨立運動，分別負責合成前導鏈和后隨鏈。功能：

-復合物是DNA夾子加載蛋白，負責將可沿DNA鏈滑動的一對

-亞基（DNA夾子）加載于DNA，使DNA聚合酶Ⅲ具有持續(xù)合成能力。

-復合物由6種亞基組成：

、

、

、

、

、

在復制叉同時合成前導鏈和后隨鏈3

5

3

5

3

5

3

5

前導鏈(leadingstrand)后隨鏈(laggingstrand)解鏈方向?qū)槠?

5

5

3

外切酶：去除RNA引物3

5

外切酶：起校正作用DNA聚合酶活性：填補兩個岡崎片段之間的缺口DNA聚合酶Ⅰ有3個酶促活性結構域:323個氨基酸小片段5

核酸外切酶活性大片段：Klenow片段

604個氨基酸DNA聚合酶活性

5

核酸外切酶活性N端C端枯草桿菌蛋白酶DNA-polⅠTus蛋白具有反解旋酶（contra-helicase）活性，識別并結合ter序列中共有序列，阻止DnaB蛋白的解旋作用，從而抑制復制叉前進。Tus蛋白除了使復制叉停止運動以外，還可能造成復制體解體。(四)Tus蛋白識別復制終點使復制終止在復制叉匯合點兩側約100kb處各有一個終止區(qū)（terD/A和terC/B）。當oriC處于半甲基化狀態(tài)時，SeqA蛋白迅速結合半甲基化的GATC，阻止Dam甲基化酶與之結合，使復制起點不能被完全甲基化，同時阻止DnaA蛋白結合oriC。oriC的GATC被完全甲基化，DnaA蛋白就能與之結合，開始新的一輪復制。(五)DNA甲基化保證復制起點在每個復制周期中僅起一次作用E.coli復制起點oriC含有11個拷貝GATC，這一回文序列中的A是Dam甲基化酶的靶位點。在復制過程中，DNA每復制10bp，復制叉前方的模板DNA雙螺旋就要繞其長軸旋轉(zhuǎn)一周，產(chǎn)生正超螺旋。拓撲異構酶是一種可逆的核酸酶。它們可共價結合DNA分子上的磷酸基團，切斷磷酸二酯鍵。(六)DNA復制需要兩類DNA拓撲異構酶消除正超螺旋，使復制叉能夠順利前進。維持E.coli、噬菌體和質(zhì)粒DNA復制起始模板DNA負超螺旋狀態(tài)。環(huán)形染色體復制后產(chǎn)生的兩個子染色體連環(huán)體解連環(huán)。DNA拓撲異構酶功能：E.coIi的TopoⅠ只作用于負超螺旋DNA，消除負超螺旋。

DNA拓撲異構酶Ⅰ的功能：E.coli的TopoⅡ?qū)⑶胺疆a(chǎn)生的正超螺旋轉(zhuǎn)變?yōu)樨摮菪?。DNA拓撲異構酶Ⅱ的功能E.coli

的TopoⅣ功能是將復制產(chǎn)生的兩個子染色體從連環(huán)體中分離出來，催化連環(huán)和去連環(huán)過程。真核生物復制子多、岡崎片段短、復制叉前進速度慢等；DNA復制從引發(fā)進入延伸階段發(fā)生DNA聚合酶

/

轉(zhuǎn)換；切除岡崎片段RNA引物的是核酸酶RNAseHⅠ和FEN1等。二、真核生物DNA復制和原核生物相似但更為復雜真核生物與原核生物DNA復制的差異：(一)常見的真核細胞DNA聚合酶有5種A家族與大腸桿菌PolⅠ同源，包括Pol

和Pol

B家族與大腸桿菌PolⅡ同源，包括Pol

、

、

和ζC家族與大腸桿菌PolⅢ同源，僅在真菌中發(fā)現(xiàn)X家族與大腸桿菌DNA聚合酶并無同源性，卻與末端轉(zhuǎn)移酶同源，成員包括Pol

、

、

Y家族（UmuC/DinB超家族），近年發(fā)現(xiàn)一個特殊的真核及原核DNA聚合酶家族，成員包括Pol

、

、

和Rev1Pol

負責合成引物Pol

負責DNA復制、核苷酸切除修復和堿基切除修復Pol

的功能與Pol

相似（其確切功能尚待定）Pol

可能和堿基切除修復有關Pol

負責線粒體DNA復制和損傷修復常見的真核DNA聚合酶有5種：拓撲異構酶，去除負超螺旋（使解旋酶容易解旋），去除復制叉前方產(chǎn)生的正超螺旋TolⅠ和TolⅡDNA雙螺旋解鏈，參與組裝引發(fā)體DNA解旋酶連接岡崎片段DNA連接酶Ⅰ核酸酶，切除RNA引物RNAseHⅠ核酸酶，切除RNA引物FEN1DNA復制，核苷酸切除修復，堿基切除修復Pol

/

合成RNA-DNA引物Pol

/引發(fā)酶有依賴DNA的ATPase活性，結合于引物-模板鏈，激活DNA聚合酶，促使PCNA結合于引物-模板鏈RFC激活DNA聚合酶和RFC的ATPase活性PCNA單鏈DNA結合蛋白，激活DNA聚合酶，使解旋酶容易結合DNARPA功能蛋白質(zhì)真核DNA復制叉主要蛋白質(zhì)的功能(二)真核DNA復制叉主要蛋白質(zhì)的類型和功能與原核基本相似DNA聚合酶

（Pol

）分子含有4個亞基：1.DNA聚合酶

/引發(fā)酶復合物合成RNA-DNA引物p180：催化亞基p48：具有引發(fā)酶活性p58：p48的穩(wěn)定性和活性所必需的p70：與組裝引發(fā)體有關功能：合成RNA引物反應過程：調(diào)節(jié)：磷酸化的調(diào)節(jié)作用Pol

/引發(fā)酶復合物首先，合成RNA引物；其次，利用DNA聚合酶活性將引物延伸，產(chǎn)生起始DNA（initiatorDNA，iDNA）短序列，形成RNA-DNA引物；最后，Pol

/引發(fā)酶脫離模板鏈DNA，發(fā)生DNA聚合酶轉(zhuǎn)換（switch）。結構：

p70、p34和p11組成異源三聚體功能：

2.RPA的功能與E.coli的SSB相似復制蛋白A（replicationproteinA，RPA）結合單鏈DNA促使雙螺旋DNA解旋激活Pol

/引發(fā)酶活性為Pol

依賴復制因子C（RFC）和增殖細胞核抗原（PCNA）合成DNA所必需RPA三聚體與SV40T抗原結合，組裝引發(fā)體復合物所必需RPA參與DNA重組和修復p140結合PCNAp40、p37和p36組成穩(wěn)定的核心復合物，具有依賴DNA的ATPase活性p38可能在p140和核心復合物之間起連接作用3.RFC與E.coliDNA聚合酶Ⅲ的

-復合物功能相似復制因子C（replicationfactorC，RFC）結構：有p140，p40，p38，p37、p365個亞基促使可滑動的DNA夾子PCNA結合于引物-模板鏈，是Pol

在模板DNA鏈上組裝并形成具有持續(xù)合成能力全酶所必需的。RFC的功能：PCNA是Pol

的進行性因子，使Pol

獲得持續(xù)合成能力。PCNA是協(xié)調(diào)DNA復制、損傷修復、表觀遺傳和細胞周期調(diào)控的核心因子。PCNA水平是檢測細胞增殖的重要指標。PCNA能激活Pol

。4.PCNA是可滑動的DNA夾子增殖細胞核抗原（proliferatingcellnuclearantigen，PCNA）結構：功能：同源三聚體，可形成閉合環(huán)形的可滑動DNA夾子。p125：催化亞基，具有DNA聚合酶活性和3

5

核酸外切酶活性，其N端區(qū)與PCNA相互作用p50：輔助PCNA激活p1255.DNA聚合酶

合成前導鏈和后隨鏈結構：Pol

分子是異源二聚體（p125和p50）功能：Pol

合成前導鏈和后隨鏈DNA聚合酶

FEN1（flapendonuclease1）具有核酸內(nèi)切酶和5

3

核酸外切酶活性。FEN1參與去除岡崎片段5

端的RNA引物。6.FEN1和RNAseHⅠ切除RNA引物RNAseHⅠ是核酸內(nèi)切酶，參與岡崎片段成熟時切除5

端RNA引物，底物RNA連接在DNA鏈的5

端，切割后在DNA鏈的5

端殘留一個核糖核苷酸，這個核苷酸再被FEN1切除。DNA復制需要DNA解旋酶打開DNA雙螺旋，使復制模板鏈得以暴露。7.DNA解旋酶打開雙螺旋以暴露復制模板8.真核復制叉有1個Pol

和2個Pol

復合物真核DNA復制叉模型Pol

/引發(fā)酶 合成RNA-DNA引物Pol

合成前導鏈和后隨鏈RFC 識別引物iDNA的3

端并驅(qū)除Pol

/引發(fā)酶PCNA 結合DNA并引入Pol

RNAseHI/FEN1切除岡崎片段5

端的RNA引物真核生物復制過程中酶及功能Pol

（或Pol

） 填補岡崎片段之間的空隙DNA連接酶Ⅰ 封口RPA 穩(wěn)定解旋后的單鏈DNA解旋酶 復制叉的形成和移動必不可少拓撲異構酶 釋放復制叉前進時產(chǎn)生的扭曲應力(三)引發(fā)和延伸發(fā)生DNA聚合酶

/

轉(zhuǎn)換識別染色體DNA復制起點和DNA局部解旋后，Pol

/引發(fā)酶復合物結合于復制起點，這一步叫做引發(fā)體組裝。引發(fā)體組裝包括DNA解旋酶與Pol

/引發(fā)酶相互作用。1.解旋酶與Pol

/引發(fā)酶相互作用組裝引發(fā)體前導鏈：出現(xiàn)在引發(fā)后期后隨鏈：發(fā)生于每個岡崎片段合成之際發(fā)生DNA聚合酶

/

轉(zhuǎn)換的原因是Pol

不具備持續(xù)合成能力DNA聚合酶

/

轉(zhuǎn)換的關鍵蛋白是RFC2.DNA聚合酶

/

轉(zhuǎn)換真核DNA聚合酶轉(zhuǎn)換和后隨鏈合成首先RNAseHⅠ利用核酸內(nèi)切酶活性切割連接在岡崎片段5

端的RNA片段，在RNA-DNA引物連接點旁留下1個核糖核苷酸；然后FEN1利用5

3

核酸外切酶活性切除這最后一個核糖核苷酸。(四)切除RNA引物有兩種機制解旋酶Dna2具有依賴DNA的ATPase和3

5

解旋酶活性，其解旋作用可以使前一個岡崎片段的5

端引物形成“蓋子”結構，再由FEN1的內(nèi)切酶活性切除引物。依賴RNAseHⅠ/FEN1切除方式：依賴Dna2/FEN1切除方式：切除RNA引物的兩種機制RNAseHⅠ/FEN1Dna2/FEN1真核所有染色體DNA復制僅僅出現(xiàn)在細胞周期的S期，而且只能復制一次。(五)真核染色體在每個細胞周期中只能復制一次1.前復制復合物在G1期形成而在S期被激活真核細胞DNA復制的起始分兩步進行，即復制基因的選擇和復制起點的激活。復制基因（replicator）是指DNA復制起始所必需的全部DNA序列。復制基因的選擇出現(xiàn)于G1期，基因組的每個復制基因位點均組裝前復制復合物（pre-replicativecomplex，pre-RC）。復制起點的激活出現(xiàn)于細胞進入S期以后，這一階段將激活pre-RC，募集若干復制基因結合蛋白和DNA聚合酶，并起始DNA解旋。在原核細胞中，復制基因的識別與DNA解旋、募集DNA聚合酶偶聯(lián)進行。而在真核細胞中，這兩個階段相分離可以確保每個染色體在每個細胞周期中僅復制一次。ORC至少募集兩種解旋酶加載蛋白Cdc6和Cdt1。復制起點識別復合物（origin

recognitioncomplex，ORC）識別并結合復制基因。三種蛋白質(zhì)一起募集真核細胞解旋酶Mcm2-7。前復制復合物（pre-RC）的形成pre-RC磷酸化導致在復制起點組裝其他復制因子并起始復制，復制因子包括3種DNA聚合酶。DNA聚合酶在復制起點按一定順序組裝：首先Pol

和Pol

結合，然后是Pol

/引發(fā)酶。在S期，pre-RC被蛋白激酶（Ddk和Cdk）磷酸化，從而被激活。pre-RC的激活和組裝真核DNA復制叉（1）激活pre-RC，以起始DNA復制；（2）抑制形成新的pre-RC。2.Cdk控制pre-RC的形成和激活真核細胞通過依賴細胞周期蛋白的蛋白激酶（cyclin-dependentkinases，CDK）嚴格控制pre-RC的形成和激活。Cdk功能：在每個細胞周期過程中，僅有一次機會形成pre-RC，也僅有一次機會激活pre-RC。pre-RC在被激活后即解體，所暴露的復制基因可形成新的pre-RC并迅速結合ORC。但在S、G2和M期，高活性的Cdk抑制pre-RC的其他組分結合ORC。只有當染色體分離和細胞分裂完成時，Cdk的活性消失，新的pre-RC才能形成。(六)端粒酶確保染色體末端復制完整

前導鏈產(chǎn)生完整的子染色單體。后隨鏈3

端留下縮短的未復制的ssDNA區(qū)。端粒（telomeres）由富含TG的重復序列組成。人的端粒重復序列為5’-TTAGGG-3

。這些重復序列多為雙鏈，但每個染色體的3’端比5

端長，形成單鏈ssDNA。這一特殊結構可解決染色體末端復制問題。端粒酶（telomerase）是一種核糖核蛋白（RNP），由RNA和蛋白質(zhì)組成。端粒酶以自己的RNA組分作為模板，以染色體的3

端ssDNA（后隨鏈模板）為引物，將端粒序列添加于染色體的3

端。這些新合成的DNA為單鏈。DNA聚合酶：催化合成DNADNA解旋酶（helicase）：解開DNA雙螺旋，暴露復制模板鏈引發(fā)酶：引發(fā)，即合成RNA引物，利用引物3’-OH開始延伸DNA連接酶：連結岡崎片段其他酶和蛋白因子小結：DNA復制需要多種酶參與如：起穩(wěn)定作用的單鏈DNA結合蛋白（SSB）和改變DNA超螺旋狀態(tài)的DNA拓撲異構酶（topoisomerase）等DNA聚合酶的合成前誤差控制(presyntheticerrorcontrol)和校正控制(proofreadingcontrol)功能。細胞修復系統(tǒng)是DNA復制高度忠實性的重要因素。復制起始利用引物也是確保DNA復制忠實性的重要機制之一。DNA復制具有高度忠實性

DNA復制是雙向復制

一個起點，兩個復制叉，雙向復制。兩個起點，兩個生長點，單向復制。一個起點，一個復制叉，單向復制。DNA鏈的合成3種方式：線粒體DNA的D環(huán)（D-loop）復制噬菌體的滾環(huán)（rollingcircle）復制

三、線粒體和噬菌體DNA復制具有特殊方式（一）線粒體DNA按D環(huán)方式復制環(huán)形、雙螺旋DNA分子兩條鏈一條為重鏈（H鏈），另一條為輕鏈（L鏈）dNTPDNA-polγ

線粒體DNA分子特點：有特異的復制起點；環(huán)形線粒體DNA兩條鏈（H和L）的復制不同步D環(huán)或取代環(huán)（displacementloop）：線粒體DNA復制開始以H鏈作為模板合成新的L鏈，取代原來的L鏈并和H鏈互補，而原來的L鏈則保持單鏈狀態(tài)，形成類似英文字母D的區(qū)域；兩條鏈具有不同的復制起點和相反的合成方向；線粒體DNA復制也需要RNA引物。線粒體DNA復制特點：（二）噬菌體DNA按滾環(huán)方式復制環(huán)形雙螺旋DNA分子一條為模板鏈，另一條為非模板鏈E.coli噬菌體DNA的分子結構特點：僅以一條鏈作為模板合成若干環(huán)形DNA分子拷貝噬菌體DNA復制的方式是滾環(huán)復制噬菌體DNA復制特點：噬菌體DNA復制首先由它自己編碼的A蛋白在非模板鏈上造成缺口，再以所產(chǎn)生的游離3

端羥基作為引物，并在宿主細胞的DNA聚合酶、解旋酶和SSB蛋白等作用下合成新鏈，新鏈和模板鏈互補并取代了原來的非模板鏈。這種復制方式稱為滾環(huán)復制。滾環(huán)復制：3

-OH5

-P5

5

5

3

3

3

3

5'滾環(huán)復制5'

5

3

3

5

雙螺旋DNA在復制起點解鏈不一定導致兩條鏈同時復制，也可能利用一條鏈作為模板起始DNA合成。雙螺旋DNA的兩條DNA鏈的復制起點也可能處于不同的位置。滾環(huán)復制和D環(huán)不對稱復制的存在說明：DNA的反轉(zhuǎn)錄合成Reversetranscription第三節(jié)RNA腫瘤病毒

DNA原病毒（或前病毒）

RNA腫瘤病毒Temin等提出，原病毒（provirus）DNA是RNA腫瘤病毒在復制過程中的中間物。*反轉(zhuǎn)錄的發(fā)現(xiàn)發(fā)展了中心法則DNA

中間模板分子（mRNA）

蛋白質(zhì)中心法則：反轉(zhuǎn)錄酶的發(fā)現(xiàn)發(fā)展了中心法則反轉(zhuǎn)錄病毒（retroviruses）：RNA病毒，含有反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄：在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下以RNA為模板合成DNA的過程。RNA指導的DNA聚合酶活性；DNA指導的DNA聚合酶活性；RNAseH的活性是指它能夠從5

3

和3

5

兩個方向水解DNA-RNA雜合分子中的RNA。一、反轉(zhuǎn)錄酶以tRNA為引物合成雙鏈cDNA反轉(zhuǎn)錄酶有3種酶的活性：反轉(zhuǎn)錄酶的結構反轉(zhuǎn)錄病毒RNA基因組和原病毒反轉(zhuǎn)錄病毒RNA基因組轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鏈cDNA的途徑二、反轉(zhuǎn)錄病毒在宿主細胞內(nèi)的主要活動（一）反轉(zhuǎn)錄合成雙鏈cDNA（二）雙鏈cDNA插入宿主染色體形成原病毒原病毒或前病毒：存在于真核染色體中和反轉(zhuǎn)錄病毒RNA基因組相對應的雙鏈DNA序列。gag基因編碼幾種病毒核心蛋白（衣殼蛋白）;pol基因編碼3種酶：反轉(zhuǎn)錄酶、蛋白酶和整合酶;env基因編碼插入病毒外膜磷脂雙層中的糖蛋白。（三）原病毒DNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生病毒RNA具有自我復制能力的反轉(zhuǎn)錄病毒基因組含有3個基因：①直接翻譯產(chǎn)生多蛋白Gag和Gag-Pol。②含有包裝信號，因此構成完整的病毒基因組。③大約一半初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物經(jīng)過剪接加工形成gag-polmRNA和envmRNA。原病毒初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物有3種重要功能：初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物多蛋白Gag-Pol，經(jīng)過蛋白酶水解，可產(chǎn)生反轉(zhuǎn)錄酶、蛋白酶和整合酶。多蛋白Gag經(jīng)過加工，生成4種病毒衣殼蛋白。env基因編碼的Env蛋白，經(jīng)過加工以后插入病毒外膜磷脂雙層。這些病毒蛋白和病毒RNA基因組可以迅速組裝成許多新的反轉(zhuǎn)錄病毒顆粒。（四）病毒RNA經(jīng)翻譯和包裝形成反轉(zhuǎn)錄病毒顆粒DNA損傷修復

DNADamageandRepair第四節(jié)

一、多種因素通過不同形式可引起DNA損傷

堿基開環(huán)和糖苷鍵斷裂引起堿基丟失

輻射或氧化損傷等引起堿基改變

化學因素可引起核苷酸插入或缺失

輻射和化學損傷可引起DNA鏈斷裂物理和化學因素可引起DNA鏈間或鏈內(nèi)交聯(lián)

其一，導致復制或轉(zhuǎn)錄障礙其二，導致復制后產(chǎn)生基因突變DNA損傷的結果:

二、DNA損傷修復系統(tǒng)有多種類型DNA聚合酶（Y-家族），如E.coli：UmuC嘧啶二聚體、無嘌呤位點跨損傷DNA合成E.coli：RecA和RecBCD雙鏈斷裂重組修復E.coli：UvrA,UvrB,UvrC,UvrD人：XPC,XPA,XPD,ERCCI-XPF,XPG嘧啶二聚體，堿基烷基化核苷酸切除修復DNA糖苷酶（即DNA糖基水解酶）堿基損傷堿基切除修復嘧啶二聚體直接修復E.coli：MutS,MutL,MutH人：MSH,MLH,PMS復制差錯錯配修復酶損傷修復系統(tǒng)的類型修復對象：將DNA中因紫外線照射而形成的嘧啶二聚體分解。機制：細胞內(nèi)光裂合酶（photolyases）分子中生色基團次甲四氫葉酸吸收光子并將FADH2激活生成的激發(fā)型FADH2，再將電子轉(zhuǎn)移給嘧啶二聚體，使其還原。分布：分布廣泛，除哺乳動物外均有之。（一）直接修復（directrepair）利用修復酶簡單地逆轉(zhuǎn)DNA損傷光復活修復系統(tǒng)修復對象：DNA中被甲基化修飾的鳥嘌呤（O6-甲基鳥嘌呤，與T配對）。機制：將甲基轉(zhuǎn)移到酶蛋白活性中心的Cys殘基側鏈上，使鳥嘌呤復原，避免發(fā)生突變。特點：DNA甲基轉(zhuǎn)移酶一旦接受甲基就不再具有催化活性，修復代價高昂。O6-甲基鳥嘌呤DNA甲基轉(zhuǎn)移酶修復糖苷酶（glycosylases）識別、切除受損堿基，產(chǎn)生AP位點（apurinicorapyrimidinicsite）。AP內(nèi)切酶在AP位點的5’端切斷磷酸二酯鍵。AP外切酶再切割AP位點的3’端。DNA聚合酶填補產(chǎn)生的缺口。最后DNA連接酶連接。（二）堿基切除系統(tǒng)修復切除受損堿基堿基切除修復（baseexcisionrepair,BER）對象：受損的堿基修復系統(tǒng)：E.coli堿基切除修復系統(tǒng)切除胞嘧啶自發(fā)脫氨基產(chǎn)生的尿嘧啶胞嘧啶脫氨基產(chǎn)生的尿嘧啶；氧化的鳥嘌呤（oxoG）；脫氨基的腺嘌呤；開環(huán)堿基；碳原子之間雙鍵變成單鍵的堿基等。

DNA糖苷酶識別的異常堿基包括：功能：利用DNA糖苷酶切除DNA復制前未去除的損傷堿基。自動防故障（fail-safe）系統(tǒng)堿基切除修復系統(tǒng)切除鳥嘌呤氧化產(chǎn)物oxoGD