第3章：細胞周期調控系統(tǒng)

第三章：細胞周期調控系統(tǒng)細胞周期調控系統(tǒng)：Cyclin:調節(jié)亞基Cdk(cyclindependentkinase)：催化亞基多種控制細胞周期調控系統(tǒng)活化的方式Cdks與Cyclins的結合磷酸化與去磷酸化蛋白質降解基因表達調控CKI的結合空間分布細胞內外信號的協(xié)調G1期：轉錄細胞外（如有絲分裂原）和細胞內的信號（如細胞生長監(jiān)控系統(tǒng)）可啟動G1/S-和S-細胞周期蛋白基因的表達，最終可以激活G1/S-Cdks，新的細胞周期因此開始。G2期：磷酸化與去磷酸化Cdk亞單位的抑制型磷酸化處于無活性的磷酸狀態(tài)。當有絲分裂開始時，這些磷酸化的突然去除導致了所有M-Cdk的激活，觸發(fā)了G2/M檢驗點的轉換。M期：蛋白質降解破壞S期和M期細胞周期蛋白——使所有主要Cdks在有絲分裂后半段失活。破壞姐妹染色單體結合在一起的蛋白——染色體分離。細胞周期調控系統(tǒng)的特性：第一，細胞周期調控系統(tǒng)包括反饋環(huán)和其他調節(jié)的相互作用，使大部分周期蛋白-Cdk復合物產生不可逆的，開關樣的激活和失活。因此，細胞周期事件通常是以“全或無”的方式進行，以使細胞避免一些事件的部分激活造成的傷害。第二，不同周期蛋白-Cdk開關的相互調節(jié)作用確保它們之間的有序與協(xié)調。細胞周期調控系統(tǒng)的特性：第三，細胞周期調控系統(tǒng)極為強大：每個周期蛋白-Cdk開關的激活與失活都能通過多種機制進行調控，使得系統(tǒng)在即使部分組分出現(xiàn)問題的情況下，依然運轉良好。最后，系統(tǒng)具有可適應性，在各種細胞內和細胞外的調節(jié)因子的作用下，主要調控開關的時間點可以能作出相應的調整。第一節(jié)細胞周期蛋白依賴的蛋白激酶細胞周期蛋白依賴激酶（Cdks）屬于絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶家族，其成員都是小分子量蛋白質(～34-40kDa)所有的Cdks都有一個共同的特征，即它們酶活性的激活需要結合細胞周期蛋白調節(jié)亞單位。大部分情況，Cdks的完全激活還需要靠近激酶活性位點的蘇氨酸的磷酸化。一、細胞周期蛋白依賴激酶的特性動物細胞包括至少九種Cdks，其中只有四種（Cdk1,2,4,6）直接參與了細胞周期調控一、細胞周期蛋白依賴激酶的特性Cdk功能在進化中高度保守。如果把酵母的Cdk1基因替換為人的Cdk1，酵母細胞依然能正常增殖。Cdks能磷酸化幾百種不同的蛋白質。Cdk蛋白識別的特定序列的絲氨酸或蘇氨酸殘基。Cdks典型的磷酸化序列是[S/T*]PX[K/R]，其中S/T*是指磷酸化的絲氨酸或蘇氨酸，X代表任意氨基酸，K/R代表堿性氨基酸賴氨酸（K）或精氨酸（R）。一、細胞周期蛋白依賴激酶的特性小的氨基端小葉大的羧基端小葉

一個大的可彎曲的環(huán)—T-環(huán)或激活環(huán)—從羧基端小葉伸出，可阻止蛋白底物結合到活性位點縫隙入口處。未激活狀態(tài)下，Cdk活性位點的很多重要氨基酸側鏈定位不正確，使得ATP的磷酸根定向不利于激酶反應。二、細胞周期蛋白依賴激酶的結構T-loopPASTAIRE螺旋(也叫α1螺旋)與細胞周期蛋白直接作用，結合時向內移動，引起與ATP磷酸根作用的殘基重新定向。二、細胞周期蛋白依賴激酶的結構第二節(jié)細胞周期蛋白Cyclin一：細胞周期蛋白分四類細胞周期蛋白在細胞周期過程中表現(xiàn)出劇烈的濃度變化，以幫助產生Cdk活性的震蕩變化，這是形成細胞周期調控系統(tǒng)的基礎。細胞周期蛋白基因表達的改變蛋白酶解三個檢驗點；四類細胞周期蛋白:G1,G1/S,S,MG1/S細胞周期蛋白：在G1期的晚期升高，在S期早期下降

：啟動DNA復制，中心體復制S細胞周期蛋白：在S期升高。負責DNA復制，一次M細胞周期蛋白：S-G2-M。負責有絲分裂紡錘體的裝配，姊妹染色單體在紡錘體上的排列

G1細胞周期蛋白：濃度并不發(fā)生震蕩變化，而是隨著細胞的生長和細胞外生長調節(jié)信號出的存在，在整個細胞周期中的濃度逐漸增加。負責新細胞周期的設定。一：細胞周期蛋白分四類二、細胞周期蛋白的結構不同的一級結構：約100個氨基酸的細胞周期蛋白盒，與Cdk的結合和激活必需。相似的三級結構，稱為細胞周期蛋白折疊，包括一個由兩個緊密的結構域構成的核心。每個結構域包含五個alpha螺旋。第一個五個螺旋簇對應于保守的細胞周期蛋白盒。第二個五個螺旋簇與第一個螺旋簇相同，盡管序列相似性有限。細胞周期蛋白氨基末端區(qū)域的長度尤其不一樣，包括了細胞周期蛋白特異的調控和靶向結構域。S細胞周期蛋白和M細胞周期蛋白的氨基末端區(qū)域含有短的降解盒基序，能在有絲分裂期靶向蛋白酶解。二、細胞周期蛋白的結構第三節(jié)細胞周期調控系統(tǒng)的活性的調節(jié)細胞周期調控系統(tǒng)的活性受到多種因素的調節(jié)使得Cdk2構象發(fā)生變化，最明顯的變化發(fā)生在T環(huán)（T-loop）處，Cyclin的結合也使L12小螺旋轉化為β鏈，使后面的T環(huán)發(fā)生重構，不再堵塞蛋白底物的結合位點，而是在縫隙入口處幾乎平坦排列。一、與cyclin的結合是Cdk活化的基本條件底物的靶向性：Cdks：T-環(huán)與底物的SPXK的保守序列作用。細胞周期蛋白：疏水斑與底物上的RXL基序作用Cks1：磷酸根結合袋的存在能使其靶向那些含有多個磷酸化位點的靶蛋白。一、與cyclin的結合是Cdk活化的基本條件決定Cdk的底物特異性。位于cyclin表面稱為疏水斑的區(qū)域，與含有互補疏水序列稱為RXL（或Cy）的基序的底物以中度親和力結合。cyclin結合的也可以將Cdk帶到其底物所在的空間部位。有些cyclin包含有序列信息，能夠靶向自身和它們的Cdk同伴到特定的亞細胞部位。一、與cyclin的結合是Cdk活化的基本條件活化磷酸化：不去磷酸化抑制磷酸化：去磷酸化二、磷酸化與去磷酸化是控制Cdk活性的開關步驟(1)Cdk的活化磷酸化:Cdk活化激酶（CAK）催化、發(fā)生在鄰近激酶活性位點的蘇氨酸殘基發(fā)生磷酸化。二、磷酸化與去磷酸化是控制Cdk活性的開關步驟磷酸化使T環(huán)變平，移向cyclinA，使Cdk和cyclin的相互作用更加穩(wěn)定。Thr160的磷酸化使T環(huán)能夠有效地與含有SPXK保守序列的蛋白底物作用。二、磷酸化與去磷酸化是控制Cdk活性的開關步驟(2)Cdk的抑制磷酸化由于Cdks的活化性磷酸化不受去磷酸化的調控，兩種抑制磷酸化就在調節(jié)Cdk活性中起著重要作用：一個是保守的酪氨酸殘基（人Cdks的Tyr15），這存在于所有的Cdks中。附近的蘇氨酸殘基（Thr14）的磷酸化進一步阻礙了Cdk的活化。Thr14和Tyr15位于激酶的ATP結合位點的頂端，它們的磷酸化可能通過干擾ATP磷酸根的方向而抑制Cdk活性。這些抑制性磷酸化位點的去磷酸化對cyclin-Cdks的激活至關重要，是開關樣激活的關鍵開關位點。二、磷酸化與去磷酸化是控制Cdk活性的開關步驟蛋白激酶Wee1：負責Tyr15的磷酸化蛋白激酶Myt1：催化Thr14和Tyr15的磷酸化抑制性位點的去磷酸化由Cdc25家族的磷酸酶來執(zhí)行。例一：G2/MCdk1開關樣的激活抑制性位點的去磷酸化由Cdc25磷酸酶家族執(zhí)行，Cdc25家族在脊椎動物中有三個成員（Cdc25A、Cdc25B、Cdc25C）。例一：G2/MCdk1開關樣的激活兩種酶都受到它們有絲分裂底物M期cyclin-Cdk復合物的調節(jié)：由M-Cdk導致的磷酸化抑制Wee1而激活Cdc25。因此，在有絲分裂開始階段，M-Cdk激活了它自身的激活因子，抑制了自身的抑制因子，形成了正反饋環(huán)來產生開關樣的Cdk激活。盡管CKI的蛋白氨基酸序列的相似性很小，它們卻擁有一些共同的重要功能特性。第一，CKI主要是S-和M-Cdk復合物的重要抑制因子，在細胞中高水平表達以確保在G1期中不存在任何S-或M-Cdk活性。第二，CKI不能抑制G1/S-Cdks，因此，它們不能阻斷這些激酶在起始檢查點的激活。最后，這些抑制因子最后要被Cdks磷酸化后降解。在G1期的晚期，上升的G1/S-Cdk活性能降解這些抑制因子——以允許S-Cdk在S期開始階段被激活。三、CKI對G1期Cdk活性的抑制動物細胞的CKIs可分類為兩大結構家族，對Cdk的抑制的機制不同。Cip/Kip家族成員：包括Dacapo和p27，結合周期蛋白和Cdk復合物。他們的基本功能是通過抑制G1/S-和S-Cdks來阻斷細胞周期進程，但他們也能通過激活G1-Cdks來促進細胞周期的進入，INK4家族成員：是絕對的抑制因子，它們能特異性地針對Cdk4和Cdk6的單體，通過減少細胞周期蛋白的結合親和力來起作用。三、CKI對G1期Cdk活性的抑制

Cip/Kip蛋白與周期蛋白-Cdk復合物的兩個亞單位都結合p27的細胞周期蛋白結合部分與周期蛋白A的疏水斑作用。p27的Cdk結合區(qū)域與激酶亞單位廣泛地相互作用。這些相互作用完全扭曲和部分拆散了在激酶活性位點上方的氨基端突出結構，也直接阻礙了ATP的結合位點，完全破壞了酶的催化功能。三、CKI對G1期Cdk活性的抑制

Cip/Kip蛋白還有助于激活G1激酶Cdk4和Cdk6周期蛋白D和Cdk4或Cdk6在沒有其他蛋白的情況下結合并不緊密。Cip/Kip蛋白能通過與這兩個亞單位作用而增強它們之間的結合。三、CKI對G1期Cdk活性的抑制INK4家族僅僅只是Cdk4和6的抑制因子，優(yōu)先結合于Cdk單體這些抑制因子能在細胞周期蛋白結合位點的相反一側結合Cdk的兩個突出，破壞了ATP的結合與定向。INK4蛋白也將激酶上部的突出扭曲，使之不適合與細胞周期蛋白的結合三、CKI對G1期Cdk活性的抑制遠祖真核細胞的細胞周期可能只由一個cyclin-Cdk振蕩器操縱，但現(xiàn)代的真核生物擁有多個不同的cyclin-Cdk復合物，它們以固定的順序被激活和失活。這種順序的形成取決于不同cyclin的基因轉錄在不同細胞周期階段順序激活。芽殖酵母大約800個基因或裂殖酵母蛋白編碼基因的約15%，在細胞周期中顯示出明顯的表達變化四、cyclin的水平震蕩由基因表達調控在G1期的晚期通過起始點時表達，約300個成員。包括G1/S細胞周期蛋白、S期細胞周期蛋白，以及編碼染色體復制和其他S期事件所必需酶的基因。G2/M期轉換和有絲分裂時表達，約120種，包括了編碼M期細胞周期蛋白的基因。有絲分裂后半段和G1期表達，大約含110種基因，包括編碼Cdk抑制因子的基因。四、cyclin的水平震蕩由基因表達調控G1是細胞周期中承前啟后的重要時期，一方面細胞要清除上一個周期的各類調節(jié)因子的殘存，為下一次DNA復制做好準備；另一方面，為了維持細胞體積的恒定，細胞生長的調節(jié)機制必須讓細胞在這個時期大量合成細胞內容物，爭取在下次分裂前細胞的體積能夠加倍。當增大細胞的體積到一定的閾值時，就傳遞某種信號給細胞周期調控系統(tǒng)，不可逆地啟動下一個新細胞周期的進程。例2：G1期Cdk的活性調控方式G1期Cdk活性的抑制機制。增加細胞周期蛋白的降解Cdk抑制蛋白對Cdk活性的抑制作用減少細胞周期蛋白基因表達例2：G1期Cdk的活性調控方式動物細胞Start檢驗點之前，G1/S基因的表達被抑制型E2F的結合而抑制。所以Start檢驗點G1/S基因表達的升高依賴于抑制型E2F從G1/S基因的啟動子上去除，并被置換成激活型的E2Fs。這個過程依賴于pRB蛋白質的失活。例2：G1期Cdk的活性調控方式：基因表達細胞跨過Start檢驗點，激發(fā)G1/S基因表達的關鍵是pRB的磷酸化。pRB蛋白是細胞周期的主要剎車機制，通過結合轉錄因子E2F，抑制了E2F的轉錄激活功能。例2：G1期Cdk的活性調控方式：基因表達周期蛋白D-Cdk復合物只催化了部分pRB的磷酸化和E2F的激活。E2F的完全激活只有在G1期的末段G1/S-Cdk：周期蛋白E-Cdk2的活性升高并完成pRB蛋白的磷酸化作用后。正反饋例2：G1期Cdk的活性調控方式：基因表達一個細胞周期事件向下一個細胞周期的轉換是單向的并且是不可逆的，這個不可逆性可以通過Cdk激活的不可逆性來部分實現(xiàn)，更重要的保證是cyclin的降解。有絲分裂cyclin降解保證了有絲分裂的退出，也使Cdk活性在G1期維持低的狀態(tài)。周期蛋白，CKI和其他細胞周期調控因子通過泛素化途徑被定向降解。泛素化經(jīng)過一系列反應中完成—泛素激活，泛素偶聯(lián)和泛素—蛋白連接作用，泛素化的蛋白質最后被稱為蛋白酶體（proteasome）的巨大蛋白酶復合體識別并降解。五、蛋白質降解控制了細胞周期的單向性泛素活化酶（E1）：將泛素轉移到一個泛素結合酶家族成員（E2）上。E2與靶向特異性泛素連接的酶（E3）合作，催化泛素活化的甘氨酸羧基端與靶蛋白的賴氨酸側鏈形成肽鍵。被26S蛋白酶體識別，降解泛素化蛋白成短肽。泛素-蛋白連接酶通常在泛素化機制中是最重要的調節(jié)靶蛋白，一方面是因為它們在泛素化過程中是靶蛋白特異性的主要決定因素，另一方面是因為它們是催化該過程的限速步驟。G1/S轉換:關鍵的泛素-蛋白連接酶是稱為SCF的一種酶，它的命名來源于其三個中心成分——Skp1,cullin和F-盒。中后期轉換:關鍵的泛素-蛋白連接酶為后期促進因子（APC）或cyclosome。5.蛋白質降解控制了細胞周期的單向性有絲分裂后半段事件主要受到兩種機制的調控：APC介導的蛋白質降解作用和Cdk1磷酸化底物的去磷酸化作用。APC控制了細胞周期調控檢查點的啟動：中期—后期轉換檢查點。當細胞進入中期時，姐妹染色單體的分離被強大的抑制系統(tǒng)阻止。而當姐妹染色單體一旦完成雙指向整列，這些“剎車系統(tǒng)”就被泛素蛋白連接酶APCCdc20酶解去除。APCCdc20將蛋白質泛素化修飾，使之被定向酶解，進而發(fā)動不可逆轉的后期進程，并退出有絲分裂。例3，APC控制的蛋白降解：中/后期轉化當細胞到達中期時，M-Cdks通過磷酸化APC核心亞單位激活了APC，這增強了與Cdc20的結合。然后APCcdc20靶向降解安全子和M期細胞周期蛋白，從而滅活M-Cdks。因此，M-Cdks觸發(fā)了導致自身最終降解的系列事件，形成一個負反饋環(huán)。例3，APC控制的蛋白降解：中/后期轉化APCCdc20觸發(fā)了兩個關鍵調控蛋白的泛素化和酶解：第一，securin的酶解釋放出蛋白酶分離酶（separase），切割黏連蛋白的Scc1亞基，打破姐妹染色單體之間的黏合；第二，有絲分裂cyclin的酶解導致很多Cdk靶蛋白的去磷酸化，這為有絲分裂后半段事件的發(fā)生所必需。例3，APC控制的蛋白降解：中/后期轉化例3，APC控制的蛋白降解：中/后期轉化

不同的激活因子決定APC的底物特異性APC的激活因子有兩種：Cdc20和Cdh1。有絲分裂的前半段和后半段的開始時，Cdh1被Cdk磷酸化，與APC的結合被抑制。此時APC結合Cdc20，其底物主要為S，M期cyclin和securin。有絲分裂中期Cdk的失活使APC與Cdh1去磷酸化，從而導致APC與Cdc20結合下降而與Cdh1親和力增加，形成的APCCdh1的其中一個靶蛋白又是Cdc20，這樣就徹底關閉APCCdc20的功能。同時APCCdh1決定了其他不被APCCdc20識別蛋白質的酶解，如有絲分裂蛋白激酶Plk和AuroraA。所以Plk和AuroraA的降解的時間要晚于cyclinB-Cdk1，這對有絲分裂的退出至關重要。例3，APC控制的蛋白降解：中/后期轉化2．抑制因子決定了APC激活的時間一個叫Emi1的蛋白質在G2期和有絲分裂的前半段與Cdc20結合，并可能阻礙其與APC的相互作用而抑制了APC的活化。在前期的末段，Emi1可以同時被Plk和cyclinB-Cdk1復合物磷酸化，為泛素蛋白連接酶SCFb-TrCP1所識別，導致Emi1在前中期被酶解，釋放出Cdc20，形成有活性的APCCdc20。Emi1水平在G1期結束時再次升高，抑制了APCCdh1的活性。例3，APC控制的蛋白降解：中/后期