第7章 酶學(xué)分析技術(shù)

第一節(jié)酶活性測定的基本知識

酶是一種生物催化劑，其化學(xué)本質(zhì)是蛋白質(zhì)。它在體內(nèi)含量極微，每ml僅為pg水平，要直接測定其絕對量是十分困難的，目前是根據(jù)其催化反應(yīng)速度來定量，稱為相對定量法。第七章酶學(xué)分析技術(shù)（一）酶活性的概念

酶活性是指在規(guī)定條件下，單位時(shí)間內(nèi)底物的減少量或產(chǎn)物的生成量。即酶反應(yīng)的速度。如果在酶反應(yīng)過程中測得的產(chǎn)物[P]或底物[S]的變化量對時(shí)間作曲線可得到酶促反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行曲線。一、酶活性的概念和單位反應(yīng)最初階段，[S]過量，原始濃度很大。[P]或[S]的變化量隨反應(yīng)時(shí)間而線性地增減，即單位時(shí)間內(nèi)[P]或[S]的變化量或反應(yīng)速度是恒定的，此階段稱為零級反應(yīng)期。一般情況下，產(chǎn)物和底物的變化量是一致的，但測定產(chǎn)物的生成要比測定底物的減少為好，因產(chǎn)物是從無到有，只要測定方法足夠靈敏，準(zhǔn)確度很高。（二）酶活性單位酶活性大小通常以單位來表示，單位是一個(gè)人為規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)，是指在規(guī)定條件下，使酶反應(yīng)達(dá)到某一速度所需要的酶量，酶單位有三種表示方式。

1.慣用單位60年代前，各種酶活力的表示法和酶單位定義沒有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，一般由方法的設(shè)計(jì)者自行規(guī)定在某一特定條件下生成一定量的產(chǎn)物為一個(gè)單位。這樣，同一種酶由于測定方法不同，可有不同單位定義，如ALT的比色測定法有金氏法、穆氏法、賴氏法，三種方法原理相同，但單位的定義不同，正常參考范圍也不同。

King法每100ml血清在37℃與底物作用60min，每生成1μmol丙酮酸為一個(gè)酶活性單位。

Mokum法1ml血清37℃與底物作用60min每產(chǎn)生5μg丙酮酸為一個(gè)酶活性單位。

Reitmen法套用Karman單位，在規(guī)定條件下（血清1ml，反應(yīng)液總量3ml，25℃，作用1min內(nèi)徑1cm比色杯）測定340nm波長處，吸光度減少值，每減少0.001為一個(gè)酶活性單位。2.國際單位1961年國際生化學(xué)會酶學(xué)委員會建議使用統(tǒng)一的國際單位（IU）是指在規(guī)定條件下（如25℃，最適pH，最適[S]時(shí)）每分鐘催化1μmol底物發(fā)生反應(yīng)的酶量。1965年改為30℃，1972年取消對溫度的規(guī)定。缺點(diǎn)：（1）由慣用單位換等成IU較麻煩。（2）對分子量不明的底物無法計(jì)算其摩爾濃度。（3）同一種酶用不同的測定方法，換算成國際單位后仍不相同。3.Katal單位為了與法定計(jì)量單位（SI）接軌，1972年國際酶學(xué)委員會又提出的一種新單位，是指在最適條件下，每秒使1mol底物發(fā)生變化的酶量。1Kat=60×106IU1nKat=0.06IU1IU=16.67nKat（三）酶的比活性

是指單位質(zhì)量的蛋白質(zhì)所具有某種的活性，用酶活性單位/mg蛋白質(zhì)來表示，比活性是衡量酶純度的一個(gè)指標(biāo)，比活性高，表示酶制劑中雜蛋白的含量少，酶純度高。酶活性單位的計(jì)算，實(shí)際上就是計(jì)算單位時(shí)間內(nèi)底物或產(chǎn)物的變化量。計(jì)算公式二、酶活性單位的計(jì)算如血清淀粉酶測定（碘比色法）緩沖淀粉液，0.4g/L，用量1.0ml，血清0.02ml。單位定義100ml血清37℃，作用15min每水解5mg淀粉為一個(gè)淀粉酶單位。

如ALT測定速度法NADH在340nm的摩爾吸光系數(shù)為6300,反應(yīng)液（工作液）1.0ml，血清0.1ml，光徑1cm。三、酶促反應(yīng)進(jìn)程酶促反應(yīng)不同于一般催化反應(yīng)，反應(yīng)不是瞬時(shí)完成的，而是經(jīng)過一個(gè)進(jìn)程。CABA延滯期B線性期C偏離線性期反應(yīng)時(shí)間t反應(yīng)速度酶活性測定原理酶活性測定不論采用何種方法，都必須符合兩個(gè)原則。

（1）在零級反應(yīng)期測定

v＝Vmax＝常數(shù)，即－[S]或[P]與反應(yīng)時(shí)間成正比。保持過量底物。（2）反應(yīng)速度與酶量成線性關(guān)系。Ⅰ級反應(yīng)級數(shù)0級[P][S]反應(yīng)時(shí)間t酶促反應(yīng)時(shí)間進(jìn)程曲線（一）米—曼公式酶的活性除了受溫度pH，抑制劑，激活劑等因素的影響外，還受底物濃度的影響，1913年michacli-memten根據(jù)酶作用的中間產(chǎn)物學(xué)說，定量地分析了酶反應(yīng)速度與底物濃度的關(guān)系，其數(shù)學(xué)表達(dá)式為：四、酶促反應(yīng)底物動力學(xué)（二）Km的意義和應(yīng)用

1.Km的意義Km是3個(gè)速度常數(shù)的復(fù)合函數(shù)，在數(shù)值上相當(dāng)于反應(yīng)速度為最大速度一半時(shí)的底物濃度。當(dāng)Km可表示酶與底物的親和力，Km越大，表示E與S的親和力越小反應(yīng)，Km越小表示酶與S的親和力越大。Km＝[S]

Km是酶的特征性常數(shù)之一，只與酶的結(jié)構(gòu)底物性質(zhì)以及反應(yīng)條件（如溫度、pH、離子強(qiáng)度）有關(guān)，而與酶的濃度無關(guān)，各種酶的Km一般在10－6～10－3mol/L之間

競爭性 反競爭性 非競爭性Vm 不變 降低 降低Km 增大 減小不變

2.Km的應(yīng)用

（1）計(jì)算不同[S]時(shí)v為Vm的百分率如[S]＝10Km時(shí)（2）確定酶反應(yīng)中的底物濃度為了使酶反應(yīng)的速度接近Vmax一般要求[S]＝10～20Km，此時(shí)v＝91％～95％Vmax。

（3）作為鑒別酶的依據(jù)如兩種酶對同一底物（相同條件下）表現(xiàn)有相同的Km，則這兩種酶為同一種酶，否則為兩種不同的酶。

（4）確定酶的天然底物有些酶可有多種底物，其中Km最小的底物是該酶的最適（天然）底物。（5）判斷酶的激活劑或抑制劑凡能降低Km的物質(zhì)為激活劑，凡能增大Km的物質(zhì)為酶抑制劑。（6）鑒別酶的抑制類型根據(jù)抑制劑以對Km和Vm的瑣影響，可區(qū)分抑制類型。

（三）Vmax的意義和應(yīng)用

Vmax是指酶完全被底物飽和時(shí)的反應(yīng)速度，在[E]不變時(shí)，對于特定的底物、Vmax也是一個(gè)常數(shù)。如果已知酶的總濃度，則可從Vmax來計(jì)算酶的轉(zhuǎn)換率，轉(zhuǎn)換率可代表酶的催化效率，指單位時(shí)間內(nèi)每分子酶所能催化反應(yīng)的次數(shù)。大多數(shù)酶的轉(zhuǎn)換率為1～104s－1（四）Km和Vmax的測定將[S]對v作用不能求得Km和Vmax這是因?yàn)閂max是一個(gè)漸近的極限值，不可能從實(shí)驗(yàn)中直接得到，由于Km是v為Vmax一半時(shí)的[S]，所以也不能得到Km，一般都將米一曼公式演變成直接方程，然后根據(jù)直線方程斜率用標(biāo)準(zhǔn)法求得Km和Vmax。第二節(jié)酶活性測定方法及酶學(xué)分析類型

酶學(xué)分析是20世紀(jì)70年代發(fā)展起來的一類檢測技術(shù)，包括酶活性測定和底物濃度測定兩大類型。酶活性的測定方法包括終點(diǎn)法和連續(xù)監(jiān)測法。根據(jù)酶的時(shí)間，酶活性測定分為兩種類型。一、酶活性的測定方法1.終點(diǎn)法（end-paintamalyin）測定酶反應(yīng)開始后某一段時(shí)間內(nèi)(從t1→t2)產(chǎn)物或底物的總變化量稱為終點(diǎn)法。而t1和t2是反應(yīng)歷程中的兩個(gè)點(diǎn)，故又稱兩點(diǎn)法。優(yōu)點(diǎn)：簡便，測定產(chǎn)物時(shí)，酶反應(yīng)被終止，顯色劑的選擇只考慮對酶活性的影響，分光光度計(jì)不需保溫裝置。缺點(diǎn)：無法了解這段時(shí)間的反應(yīng)是否都是零級反應(yīng)，故難以保證結(jié)果的真實(shí)性。2.連續(xù)監(jiān)測法（continuouemonitosing）每隔一定時(shí)間（10～60s）連續(xù)測定酶反應(yīng)中產(chǎn)物或底物的變化量稱為連續(xù)監(jiān)測法。又稱動力法或速率法，終點(diǎn)法的測定兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)，該法進(jìn)行多點(diǎn)連續(xù)測定。優(yōu)點(diǎn)：多點(diǎn)測定結(jié)果，連接成線，很容易找到成直線的區(qū)段，因而可選擇線性反應(yīng)期來計(jì)算酶活性，不需終止反應(yīng)，測定結(jié)果較準(zhǔn)確。省時(shí)、省試劑。

缺點(diǎn)：分光光度計(jì)必須有保溫裝置，而且P或S應(yīng)是可直接測定的化合物，如需加入其他試劑則必須考慮它們對待測酶活性是否有影響。三、影響酶活性測定的因素

（一）樣品處理的影響

1.溶血RBC中某些酶活性比血高，如LDH高150倍，AST高15倍，ALT高7.5倍。

2.抗凝劑某些酶可被抗凝劑抑制，如EDTA、草酸鹽，可抑制需Ca2+的AMS和需Mg2+的CK、5NT、ALP等，酸酶活性測定都用血清。

3.樣品存放時(shí)間，各種血清酶穩(wěn)定性不同，如ACP、CK在室溫下迅速失活，AMS、GGT則很穩(wěn)定。（二）測定條件的影響

1.溫度溫度對酶活性的影響包括兩個(gè)方面，一方面是溫度升高，反應(yīng)速度加快，同一般化學(xué)反應(yīng)，其關(guān)系符合Arrhenius公式K=Ae。另外一方面溫度升高，會發(fā)生熱變性，使酶活性降低。

（1）溫度的選擇37℃反應(yīng)速度快，單位時(shí)間反應(yīng)物質(zhì)變化量大，測定靈敏度增加，保溫時(shí)間短，25℃、30℃可使單位時(shí)間的散熱較少，溫度便于恒定，很多實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的物理化學(xué)較難定在30℃進(jìn)行，IFCC建議30℃作為參考方法的標(biāo)準(zhǔn)溫度。（2）溫度系數(shù)

將溫度每升高10℃后反應(yīng)速度相當(dāng)于原來的倍數(shù)，稱為溫度系數(shù)(Q10)。Q10表示溫度對反應(yīng)速度影響的大小。

2.pH（1）改變底物的解離狀態(tài)，影響酶與底物結(jié)合。（2）改變酶活性中心必需基因的解離狀態(tài)，影響酶活性。（3）改變酶的三維空間構(gòu)象，使酶變性。（4）使亞基解聚3.緩沖液性質(zhì)酶活性下僅受緩沖液pH影響，也受緩沖液性質(zhì)的影響，選擇緩沖液應(yīng)考慮的因素。

（1）緩沖液中弱酸的解離數(shù)pka必須接近酶測定時(shí)的Ph。如ALT測定pH7.4（磷酸pka6.7）LDH測定pH8.8，（二乙醇胺pka8.8）ALP測定pH10（碳酸pka10.32）。

（2）緩沖液對酶活性無抑制作用，如甘氨酸對LDH、ALP有抑制作用。

（3）緩沖液在酶反應(yīng)體系中不會發(fā)生降解或破壞。（4）緩沖液在可見光區(qū)或紫外區(qū)沒有成僅有極低光吸收現(xiàn)象。一、同工酶的概念

1971年國際生化學(xué)會（IUB）提出同工酶是指同一種屬中由不同基因位點(diǎn)或等位基因編碼的多肽鏈單體，純聚體或雜交體，其生物性質(zhì)不同但能催化相同反應(yīng)的酶。同工酶的分布除了具備組織器管特異性外，在同一細(xì)胞的不同細(xì)胞器中也有不同的分布，這對于提高疾病的診斷有重要意義。第三節(jié)同工酶測定

（一）電泳法：

常用的電泳材料有醋酸纖維薄膜、瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠等。（二）層析法主要有兩種1.離子交換層析利用同工酶表面電荷的不同，與離子交換樹脂結(jié)合，常用的離子交換劑有二乙氨基乙基纖維素（DEAE-C）、二乙氨基乙基葡聚糖A-50（DEAE-SephadexA-50）等。分離方法

2.親和層析法利用多基因位點(diǎn)的同工酶具有不同免疫學(xué)特性和不同底物專一性，將特異性配體（如抗體）用固相化技術(shù)結(jié)合在葡聚糖或瓊脂糖凝膠上，樣品通過層析柱時(shí)，凝膠就能選擇性結(jié)合某一同工酶，而讓其他同工酶通過，然后用洗脫劑洗脫。

評價(jià)可用于同工酶的提純制備，但費(fèi)時(shí)。（三）免疫化學(xué)法利用同工酶的抗原性不同進(jìn)行分離，主要適用于基因位點(diǎn)的同工酶。1.免疫抑制法

利用同工酶的某一亞基與相應(yīng)抗體結(jié)合后，酶活性受抑制，而不含這種亞基的同工酶不受影響。故測定加與不加抗體樣品中酶活性的差別，可推并且該型同工酶的活性，如在CK同工酶中加入足備的CK-MM抗體，則：CK-MM活性全部被抑制CK-MB活性抑制50％CK-BB活性不受