實驗一 酵母RNA的提取及含量測定(紫外吸收法)

1實驗一酵母RNA的提取及含量測定一、實驗?zāi)康呐c要求1、了解并掌握稀堿法提取RNA的原理和方法。2、熟悉和掌握紫外吸收法測定核酸含量原理和操作方法，3、熟悉紫外分光光度計的基本原理和使用方法。二、實驗原理由于RNA的來源和種類很多，因而提取制備方法也很各異。一般有苯酚法、去污劑法和鹽酸胍法。其中苯酚法又是實驗是最常用的。組織勻漿用苯酚處理并離心后，RNA即溶于上層被酚飽和的水相中，DNA和蛋白質(zhì)則留在酚層中。向水層加入乙醇后，RNA即以白色絮狀沉淀析出，此法能較好的除去DNA和蛋白質(zhì)。上述方法提取的RNA具有生物活性。工業(yè)上常用稀堿法和濃鹽法提取RNA，用這兩種方法所提取的核酸均為變性的RNA，主要用作制備核苷酸的原料，其工藝比較簡單。濃鹽法使用10%左右氯化鈉溶液，90℃提取3-4h，迅速冷卻，提取液經(jīng)離心后,上清液用乙醇沉淀RNA。稀堿法使用稀堿使酵母細(xì)胞裂解，然后用酸中和，除去蛋白質(zhì)和菌體后的上清液用乙醇沉淀RNA或調(diào)pH2.5利用等電點沉淀。酵母含RNA達(dá)2.67-10.0%，而DNA含量僅為0.03-0.516%，為此，提取RNA多以酵母為原料。核酸、核苷酸及其衍生物的分子結(jié)構(gòu)中的嘌呤、嘧啶堿基具有共軛雙健系統(tǒng)（-C=C一C=C-），能夠強(qiáng)烈吸收250-280nm波長的紫外光。核酸（DNA,RNA）的最大紫外吸收值在260nm處。遵照Lambert-Beer定律，可以從紫外光吸收值的變化來測定核酸物質(zhì)的含量。在不同pH溶液中嘌呤、嘧啶堿基互變異構(gòu)的情況不同，紫外吸收光也隨之表現(xiàn)出明顯的差異，它們的摩爾消光系數(shù)也隨之不同。所以，在測定核酸物質(zhì)時均應(yīng)在固定的pH溶液中進(jìn)行。核酸的摩爾消光系數(shù)（或吸收系數(shù)），通常以ε（ρ）來表示，即每升含有一摩爾核酸磷的溶液在260nm波長處的消光值（即光密度，或稱為光吸收）。核酸的摩爾消光系數(shù)不是一個常數(shù)，而是依賴于材料的前處理、溶液的pH和離子2強(qiáng)度發(fā)生變化。RNA溶液（pH=7.0）的ε（ρ）=7700-7800，RNA的含磷量為9.5%，含1μg/mLRNA溶液的光密度為0.022-0.024。因此，測定未知濃度的DNA（RNA）溶液的光密度OD260nm，即可計算測出其中核酸的含量。該法簡單、快速、靈敏度高，如核酸3μg/mL的含量即可測出。對于含有微量蛋白質(zhì)和核苷酸等吸收紫外光物質(zhì)的核酸樣品，測定誤差較小。蛋白質(zhì)由于含有芳香族氨基酸，因此也能吸收紫外光。通常蛋白質(zhì)的吸收高峰在280nm波長處，在260nm波長處的吸收值僅為核酸的十分之一或更低，故核酸樣品中的蛋白質(zhì)含量較低時對核酸的紫外測定影響不大。三、主要儀器和試劑試劑：啤酒酵母粉、0.04MNaOH溶液、95%乙醇、乙醚、酸性乙醇溶液：30mL乙醇加0.3mLHCl。儀器：紫外分光光度計、離心機(jī)、真空干燥箱、三角瓶、燒杯、水浴鍋。四、實驗步驟 1、稱取5g干酵母粉，用30mL0.04MNaOH溶液分步在研缽中研磨均勻后，轉(zhuǎn)入2支50ml比色管，沸水浴加熱35min，冷卻，轉(zhuǎn)入離心管，4000r/min，離心15min，將上清慢慢傾入裝有10mL酸性乙醇的離心管，邊加邊攪動。2、加畢，靜置，待RNA沉淀完全后，5000r/min離心5min。棄去上清液。用95％乙醇分步將沉淀轉(zhuǎn)移至布氏漏斗抽濾并洗滌，消耗95％乙醇體積總約30ml；3、再用乙醚洗滌沉淀兩次，消耗體積總約20ml，沉淀在空氣中干燥。稱量所得RNA粗品的重量（減去濾紙重量），并記錄該數(shù)據(jù)。4、RNA粗品中RNA純度測定：將樣品配制成含5～50μg核酸/mL的溶液：將上述RNA粗品溶解于100ml容量瓶，定容，靜置，取上清液于紫外分光光度計上測定260nm吸收值，按下式計算純品RNA濃度。若O.D260讀數(shù)過大，則根據(jù)O.D260值再做適當(dāng)稀釋。五、計算：O.D260－260nm波長處的光密度讀數(shù)；L－為比色杯的厚度，一般為1或0.5；0.024為1μgRNA/mL的光密度；結(jié)果RNA濃度=O.D260/0.024×L=0.386/0.024μg/mL=16×10^-6g/ml干酵母粉RNA含量=RNA重/干酵母稱重×100%=16×10^-6g/ml×100ml/5g×100%=0.032%七、思考題1.破酵母細(xì)胞時為什么要在沸水浴中進(jìn)行?答：由于酵母細(xì)胞外有一層厚厚的細(xì)胞壁，而RNA存在于細(xì)胞質(zhì)中，所以必需將酵母細(xì)胞的細(xì)胞壁研磨破碎后才能提取出RNA。加入NaOH之后水浴煮沸30min的作用是促進(jìn)細(xì)胞壁變性，使類脂、甘露聚糖、葡聚糖等成分部分分解，使蛋白質(zhì)變性，從而使細(xì)胞破裂，RNA則從細(xì)胞中分離出來。另外細(xì)胞中含有多種分解RNA的酶類（如RNase等），為了避免RNA在提取過程中被降解，得到較為完整的RNA分子，破碎酵母細(xì)胞時應(yīng)在沸水中進(jìn)行，這樣可以使細(xì)胞中降解RNA的蛋白酶類活性受到抑制甚至變性失活，從而起到保護(hù)RNA分子的作用。2.為什么用酵母作為實驗原料？如何使RNA從酵母中釋放出來？RNA的等電點是多少？答：酵母繁殖快，生長周期短；其細(xì)胞質(zhì)中的核酸大部分是RNA，而DNA很少；RNA提取液與菌體分離比較容易，因此酵母是提取RNA的好材料。工業(yè)上將RNA從細(xì)胞中釋放出來主要有三種方法，包括稀堿法、濃鹽法和自溶法。（1）稀堿法是在一定的堿濃度下，使構(gòu)成細(xì)胞壁的蛋白質(zhì)、脂肪及糖的化合物得到水解，從而破壞細(xì)胞壁，使RNA從細(xì)胞中釋放出來，該方法屬于化學(xué)破壁法。（2）濃鹽法是基于改變酵母細(xì)胞的滲透壓，是細(xì)胞自身破裂而釋放出RNA，即利用高濃度的鹽（10%NaCl）在90～100°C條件下改變了細(xì)胞膜通透性，并將核蛋白體解離成RNA和蛋白質(zhì)而使RNA釋放到鹽溶液中。同時，90～100°C的高溫可破壞磷酸單酯酶和磷酸二酯酶的活力，避免RNA的降解。該方法屬于物理化學(xué)破壁法。（3）自溶法是利用某些酵母菌種在發(fā)酵結(jié)束后，細(xì)胞中的溶酶體膜破裂，使得溶酶體中的水解酶釋放到細(xì)胞之中，利用菌體自身的酶系將細(xì)胞溶解，從而釋放出RNA。通常自溶法的菌濃度為2%，PH值9.5～10，自溶溫度以60～65°C為宜。RNA的等電點為PH2.5。根據(jù)核酸在等電點溶解度最小的性質(zhì)，將溶液在低溫下調(diào)pH至2.0～2.5，RNA則以白色絮狀沉淀形式從鹽溶液中析出。再次離心，固液分離，便可獲得RNA粗產(chǎn)品。3為什么用稀堿溶液可以使酵母細(xì)胞裂解？答：酵母菌的細(xì)胞壁呈“三明治”結(jié)構(gòu)——外層為甘露聚糖，內(nèi)層為葡聚糖，中間層為一層蛋白質(zhì)分子（包括多種酶類），此外細(xì)胞壁壁上還含有少量的類脂和幾丁質(zhì)。稀堿溶液能夠?qū)湍妇?xì)胞壁和細(xì)胞膜上的脂類起到抽提作用，脂類發(fā)生皂化反應(yīng)從而被分解，使細(xì)胞穿孔。同時細(xì)胞壁的聚糖成分在堿液中會部分水解，蛋白質(zhì)（包括多種酶類）也會發(fā)生變性，從而增加酵母細(xì)胞的通透性，酵母細(xì)胞原生質(zhì)膜失去選擇透過性，細(xì)胞就破裂使RNA流出。4.核酸的溶解性質(zhì)是什么?常用什么試劑分離沉淀核酸?答：核酸是具有極性的高分子物質(zhì)，