應(yīng)用pcr-dgge技術(shù)分析福建浮宮紅樹(shù)林細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)

應(yīng)用pcr-dgge技術(shù)分析福建浮宮紅樹(shù)林細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)

紅樹(shù)林是一個(gè)自然分布在亞熱帶和亞熱帶海岸之間的木本植物群落。它通常生長(zhǎng)在港口河口的粘土灘上。這是海灘上的一種獨(dú)特類型。紅樹(shù)林群落與其所在的生境相互聯(lián)系相互作用構(gòu)成了紅樹(shù)林生態(tài)系,該生態(tài)系統(tǒng)在結(jié)構(gòu)和功能上具有既不同于陸地生態(tài)系統(tǒng)又不同于海洋生態(tài)系統(tǒng)。它兼有海洋和陸地的性質(zhì)卻又與二者不同,這種特殊的生境使其具有一些重要的獨(dú)特性質(zhì)。它是世界上最富有多樣性,生產(chǎn)力最高的海洋生態(tài)環(huán)境之一,具有豐富的微生物資源并具有生態(tài)多樣性。這種獨(dú)特的生態(tài)系統(tǒng)和豐富的生物多樣性必然蘊(yùn)藏著獨(dú)特的酶資源和基因資源,引起了國(guó)內(nèi)、外學(xué)者的廣泛關(guān)注。微生物的多樣性是生物多樣性的重要組成部份,紅樹(shù)林土壤微生物長(zhǎng)期適應(yīng)潮間帶的鹽生環(huán)境,形成了特有的微生物類型。因此,這里的微生物資源既豐富又不失特色,其中以細(xì)菌和真菌為主,占微生物資源總量的91%。20世紀(jì)40年代以來(lái),人們一直采用分離培養(yǎng)的方法來(lái)研究微生物多樣性,而事實(shí)上,一些微生物經(jīng)常處于“活的非可培養(yǎng)狀態(tài)”(viablebutnonculturable,VBNC),通過(guò)實(shí)驗(yàn)室人工培養(yǎng)方法已經(jīng)分離和描述的微生物物種數(shù)量?jī)H占估計(jì)數(shù)量的1%~5%,而其余95%~99%的微生物類群仍然未被分離和認(rèn)識(shí)。因而這種方法只能反映極少數(shù)微生物的信息,并不能全面地分析微生物的多樣性,從而埋沒(méi)了大量的具有應(yīng)用價(jià)值的微生物資源。自1985年P(guān)ace等利用核酸序列的測(cè)序來(lái)研究微生物的進(jìn)化問(wèn)題,加之近年來(lái)基因組學(xué)的興起和現(xiàn)代分子生物技術(shù)的成熟,可以繞過(guò)純培養(yǎng)的手段來(lái)研究微生物的多樣性,使其進(jìn)入了一個(gè)嶄新的研究階段。其中,變性梯度凝膠電泳(Denaturinggradientgelelectrophoresis,DGGE)技術(shù)最早由Fischer和Leman提出并用于DNA突變檢測(cè),現(xiàn)在該技術(shù)在微生物群落多樣性和種群動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)中得到廣泛應(yīng)用。福建九龍江口浮宮紅樹(shù)林是我國(guó)主要典型紅樹(shù)林分布區(qū)之一,對(duì)該區(qū)域的研究已有多方面的報(bào)道,盡管在微生物學(xué)方面已有一些研究,但對(duì)于應(yīng)用PCR-DGGE技術(shù)研究該區(qū)域細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)仍鮮有報(bào)道。本文應(yīng)用PCR-DGGE技術(shù)對(duì)紅樹(shù)林區(qū)微生物多樣性進(jìn)行了初步研究,以期更客觀真實(shí)地反映紅樹(shù)林沉積物中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)信息。1材料和方法1.1主要試劑蛋白胨、胰蛋白胨、酵母提取物為OXOID產(chǎn)品,購(gòu)自華美公司;Tris、EDTA、Agarose、SDS購(gòu)自泰京公司;CTAB、SDS、PVP、dNTP、IPTG、X-gal為Promega產(chǎn)品,DNAmarker為MBI和NEB產(chǎn)品;Eubac341F(含GC夾子)、Eubac517R由上海博亞生物有限公司合成,pMD18-T載體為TaKaRa公司產(chǎn)品,其它試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。T-GradientPCR儀(Biometra,Germany),EPS-100電泳儀(Tanon天能科技有限公司),基因突變檢測(cè)儀(用于變性梯度凝膠電泳)(BIO-RAD,Dcode,USA公司),GIS-2008凝膠成像分析儀(Tanon天能科技有限公司)。1.2研究區(qū)地自然概況和樣品采集福建九龍江口紅樹(shù)林位于九龍江口南岸的龍海市浮宮鎮(zhèn)草埔頭村,呈帶狀分布,寬度約為40米,主要植被為秋茄,林緣有少量桐花樹(shù)和白骨壤伴生(圖1)。該紅樹(shù)林區(qū)北面臨九龍江口,這是一條重要航道,東面為一淡水河,南邊為水產(chǎn)養(yǎng)殖區(qū)、稻田區(qū)及居民生活區(qū)。該區(qū)域污染來(lái)源主要是水產(chǎn)養(yǎng)殖、居民生活和船舶運(yùn)輸。在高、中、低潮帶共建立16個(gè)采樣站位,在低潮期,分別在各站位進(jìn)行多點(diǎn)采集紅樹(shù)林表層沉積物樣品,揀去根系并混合均勻后裝入無(wú)菌袋。冰浴冷藏帶回實(shí)驗(yàn)室迅速進(jìn)行微生物學(xué)分析。1.3dna的溶解沉積物基因組DNA的提取按Tian等的方法進(jìn)行,提取后將DNA溶解于200-1000μLTE中。DNA的純化采用Qbiogene公司GeneCleanTurboKit,純化后保存于-20℃。1.41dna的純化選擇細(xì)菌的16SrDNAV3區(qū)的引物341F-GC(5′-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和517R(5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′),以純化后的紅樹(shù)林沉積物DNA為模板進(jìn)行PCR,其反應(yīng)條件為94℃5min;94℃1min,65℃1min(每個(gè)循環(huán)降1℃),72℃1min,10個(gè)循環(huán),94℃1min,55℃1min,72℃1min,20個(gè)循環(huán),72℃10min。1.5變性梯度及dppe程序PCR產(chǎn)物用基因突變檢測(cè)儀分析,PAGE(聚丙烯酰胺)膠濃度為8%(w/v),變性梯度為40%-60%。DGGE程序按文獻(xiàn)進(jìn)行。電泳完畢后,將膠于含有EB的1×TAE緩沖液中染色,將染色后的凝膠用凝膠影像分析系統(tǒng)分析,觀察每個(gè)樣品的電泳條帶并拍攝。1.6dh5感受態(tài)細(xì)胞的檢測(cè)DGGE凝膠在紫外分析儀照射下進(jìn)行DNA條帶的切割,切下的DNA條帶分別放入EP管中,重復(fù)沖洗后,過(guò)夜保存;上清液作為PCR的模板進(jìn)行擴(kuò)增。純化后的PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體連接,并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞,送上海英駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。所測(cè)得序列用DNAMAN去除載體序列和GC夾子后,將有效序列在NCBI上進(jìn)行比對(duì),以其中同源性最高的序列確定為參照菌株,相似性≥97%的序列視為同一序列型(sequencetype),并用DNAMAN軟件采用鄰接法(Neighbor-joiningmethod)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。1.7物種多樣性分析多樣性指數(shù)(Shannon-wiener’s指數(shù))又稱香濃指數(shù)(H),豐度(S)和均勻度(EH)等指標(biāo)被用來(lái)比較各個(gè)樣品的細(xì)菌多樣性。計(jì)算公式如下:其中,在研究細(xì)菌物種遺傳多樣性中,Pi是某個(gè)樣品中單一條帶的強(qiáng)度在該樣品的所有條帶總強(qiáng)度中所占的比率,S是某個(gè)樣品中所有條帶數(shù)目總和。2結(jié)果2.1總dna的電泳觀察采用原位裂解法提取紅樹(shù)林區(qū)16個(gè)站位沉積物樣品的總DNA,將總DNA溶于TE后,溶液有不同程度的深色,這可能與粗提DNA中含有較多的雜質(zhì)有關(guān)。電泳觀察各樣品的的總DNA,均有不同程度的拖帶,從電泳圖譜來(lái)看,各站位樣品總DNA大小約為23kb,并且形成較亮的主帶。因粗提的紅樹(shù)林各站位樣品總DNA含有較多的腐殖酸等雜質(zhì),不能直接進(jìn)行后續(xù)PCR等操作,用GeneCleanTurboKit試劑盒純化后,DNA拖帶明顯減少,雜質(zhì)含量也明顯較少,DNA純度較高。2.21pcr擴(kuò)增反應(yīng)以細(xì)菌16SrDNAV3高變區(qū)序列的通用引物Eubac341F和Eubac517R對(duì)所純化后的紅樹(shù)林各站位樣品總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,經(jīng)純化后的紅樹(shù)林樣品總DNA均可進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng),且均能夠擴(kuò)增出大小約為200bp的DNA片段。2.3srrnav區(qū)細(xì)胞的條帶分析對(duì)紅樹(shù)林各站位樣品16SrDNAV3區(qū)PCR產(chǎn)物進(jìn)行DGGE分析,結(jié)果如圖2所示。不同條帶代表該樣品中不同細(xì)菌16SrDNAV3區(qū)基因片段,每個(gè)樣品均可分離到17到24條數(shù)目不等、位置各異的細(xì)菌16SrDNAV3區(qū)片段條帶,條帶數(shù)目最少的為1號(hào)和16號(hào)站位,均為17條,條帶數(shù)目最多的為4號(hào)、14號(hào)和15號(hào)站位,它們的條帶數(shù)均為24條。2.4細(xì)菌群落的遺傳多樣性從各站位樣品DGGE指紋圖譜來(lái)看,不同的條帶代表不同的細(xì)菌16SrDNAV3區(qū)基因片段,每個(gè)泳道中條帶的亮度反映出細(xì)菌相對(duì)生物量的多少,電泳條帶的多少可以直觀地反映樣品中細(xì)菌群落的遺傳多樣性,本研究根據(jù)電泳圖譜中每條條帶的信息,對(duì)各樣品中的細(xì)菌多樣性指數(shù)(H)、豐度(S)和均勻度(EH)等指標(biāo)進(jìn)行了綜合分析,結(jié)果如表1所示。各站位樣品細(xì)菌多樣性指數(shù)(H)、豐度(S)和均勻度(EH)均有所不同,細(xì)菌多樣性指數(shù)最高的是3號(hào)站位,指數(shù)為2.842,多樣性指數(shù)最低的是1號(hào)站位,指數(shù)為2.182;細(xì)菌豐度最高的是4號(hào)、14號(hào)和15號(hào)站位,它們的豐度均為24,細(xì)菌豐度最低的是1號(hào)和16號(hào)站位,它們的豐度均為17;細(xì)菌的均勻度最高的是3號(hào)站位,均勻度為0.933,均勻度最低的是1號(hào)站位,均勻度為0.770。2.5不同站位的細(xì)菌群落相似性分析在DGGE指紋圖譜中,不同的樣品共有條帶數(shù)目的多少,可以反映不同樣品之間細(xì)菌群落相似性。通過(guò)計(jì)算群落相似性系數(shù)可以得到群落之間細(xì)菌種類差異的信息,表2列出了不同站位樣品之間共有條帶數(shù)和細(xì)菌相似性結(jié)果。從表中可以看出,各樣品間的細(xì)菌群落相似性系數(shù)不盡相同,相似性系數(shù)最高的是14號(hào)和15號(hào)站位,相似性系數(shù)為95.83%,相似性系數(shù)最低的是1號(hào)和9號(hào)站位,相似性系數(shù)為41.03%。對(duì)不同站位細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相似性進(jìn)行聚類分析,結(jié)果如圖3所示,1號(hào)和2號(hào)站位的分類位置較遠(yuǎn)于其它站位,不同站位比較,同一采樣斷面的站位細(xì)菌群落相似性較高,聚類位置相近。2.6微生物資源回收及序列測(cè)定根據(jù)紅樹(shù)林各站位沉積物樣品的PCR-DGGE指紋圖譜,對(duì)優(yōu)勢(shì)的條帶進(jìn)行切膠回收,共得到5條帶,如圖1所示,對(duì)這5條帶進(jìn)行序列測(cè)定,同源性最高的序列均為未培養(yǎng)微生物,如表3和圖4所示。它們分別屬于變形菌門(Proteobacteria)、酸菌門(Acidobacteria)和綠菌門(Chlorobi)。3細(xì)菌群落相似性及聚類分析紅樹(shù)林生長(zhǎng)在熱帶、亞熱帶海岸潮間帶,其生境具有還原性、酸性、高含鹽量、營(yíng)養(yǎng)豐富等特征,其中的微生物資源既豐富又不失特色。該系統(tǒng)中分布著數(shù)量極其龐大,種類繁多的微生物。本研究前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明紅樹(shù)林沉積物細(xì)菌總數(shù)高達(dá)109cell/g沉積物,另外多環(huán)芳烴降解菌的數(shù)量也高達(dá)104-105cfu/g沉積物,并且也存在著豐富的降解高分子量多環(huán)芳烴的微生物。數(shù)量如此龐大的功能微生物,采用傳統(tǒng)分離方法研究其群落結(jié)構(gòu)具有時(shí)間長(zhǎng),過(guò)程復(fù)雜,有時(shí)還會(huì)造成嚴(yán)重的微生物多樣性丟失。不經(jīng)微生物分離培養(yǎng),直接從土壤中抽提總DNA,分析其中16SrDNA的序列多態(tài)性,以此反映微生物的種群構(gòu)成,是近年來(lái)逐步發(fā)展起來(lái)的新方法。它有效克服了傳統(tǒng)方法的缺點(diǎn),所揭示的微生物多樣性更加客觀和真實(shí)。該方法對(duì)于研究紅樹(shù)林區(qū)沉積物微生物資源的開(kāi)發(fā)利用具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。本文通過(guò)PCR-DGGE技術(shù)分析了九龍江口紅樹(shù)林沉積物中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分布特征,從不同站位樣品的DGGE指紋圖譜可以看出,每個(gè)樣品均可分離到17到24條不等的條帶,而不同的條帶代表不同細(xì)菌的基因片段,表明每個(gè)站位樣品都存在著在豐富的微生物種類。條帶數(shù)目最少的為1號(hào)和16號(hào)站位,條帶數(shù)最多的為14號(hào)和15號(hào)站位,1號(hào)和16號(hào)站位均為非紅樹(shù)林覆蓋區(qū),而14號(hào)和15號(hào)站位為典型紅樹(shù)林覆蓋區(qū),表明紅樹(shù)林區(qū)細(xì)菌多樣性高于非紅樹(shù)林區(qū)細(xì)菌多樣性。研究證明,微生物-營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)-植物間的緊密聯(lián)系是紅樹(shù)林生態(tài)系統(tǒng)中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)保存和循環(huán)的主要機(jī)制之一。具有高生產(chǎn)力和豐富多樣性的紅樹(shù)林土壤微生物,不斷地將紅樹(shù)林凋落物轉(zhuǎn)化成可被植物利用的氮、磷或其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。植物根系分泌物又為該系統(tǒng)中微生物和其他大型生物提供營(yíng)養(yǎng),使得根基微生物的多樣性更加豐富。電泳條帶的多少,可以直觀地反映樣品中細(xì)菌群落的遺傳多樣性,而多樣性指數(shù)是研究群落物種數(shù)及其個(gè)體數(shù)的分布均勻度的綜合指標(biāo)。本研究根據(jù)電泳圖譜中每條帶的信息,對(duì)各站位樣品中的細(xì)菌多樣性指數(shù)(H)、豐度(S)和均勻度(EH)等指標(biāo)進(jìn)行了綜合分析,它們的細(xì)菌多樣性指數(shù)、豐度和均勻度均存在差異,數(shù)值雖有所波動(dòng),但它們的變化范圍不大。在各站位樣品的DGGE指紋圖譜中,不同樣品的共有條帶數(shù)目的多少,可以反映不同樣品之間細(xì)菌群落相似性。通過(guò)計(jì)算群落相似性系數(shù)可以得到群落之間細(xì)菌種類差異的信息,各站位樣品間的相似性系數(shù)變化范圍為41.03%-95.83%,不同站位間相似性系數(shù)變化較大。相似性系數(shù)較低的站位為1號(hào)站位,而1號(hào)站位是淡水河淺灘,無(wú)紅樹(shù)林生長(zhǎng),表明紅樹(shù)林區(qū)與非紅樹(shù)林區(qū)微生物群落結(jié)構(gòu)存在差異,相似性系數(shù)較高的為14號(hào)和15號(hào)站位,它們是典型的紅樹(shù)林覆蓋區(qū),具有較高的相似性系數(shù)。從各站位樣品相似性進(jìn)行聚類分析的圖譜可以看出,1號(hào)和2號(hào)站位的聚類位置遠(yuǎn)于其它站位,而1號(hào)站位是淡水河淺灘,2號(hào)站位剛好是紅樹(shù)林起點(diǎn)處,地理位置最近,這可能與它們的相似性系數(shù)較高,聚類位置也較近有關(guān)。有紅樹(shù)林覆蓋的各站位相似性聚類位置也較近,這些站位均為相鄰站位,它們又大都處于同一采樣斷面,這些站位聚類位置相近,可以推測(cè)同一采樣斷面的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分布特征相似。DGGE指紋圖譜能夠直觀地反映紅樹(shù)林區(qū)各站位細(xì)菌組成成份的變化,它是一種能夠提供一個(gè)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化趨勢(shì)的研究方法,如果想要進(jìn)一步了解細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的組成,一種簡(jiǎn)便可靠的方法就是對(duì)DGGE條帶進(jìn)行切膠回收測(cè)序。本研究通過(guò)對(duì)紅樹(shù)林區(qū)沉積物各站位樣品DGGE的優(yōu)勢(shì)條帶進(jìn)行測(cè)序,這些條帶序列對(duì)應(yīng)的同源性最高的微生物分別屬于變形菌門(Proteobacteria)、酸菌門(Acidobacteria)和綠菌門(Chlorobi)。這些微生物均為未培養(yǎng)微生物,且均來(lái)自于河口海岸沉積物。這些細(xì)菌還未被培養(yǎng)或不可培養(yǎng),就很難鑒定它們?cè)谠簧鷳B(tài)環(huán)境中的生理生化特性及其所具備的生態(tài)功能意義,要具體了解這些優(yōu)勢(shì)菌群在紅樹(shù)林沉積物中的結(jié)構(gòu)與功能,還需要做更