卷柏抗smmc-7721肝腫瘤組分總黃酮提取工藝研究

卷柏抗smmc-7721肝腫瘤組分總黃酮提取工藝研究

柏樹又名長不死草、九死還魂草、石蓮花和萬年青1。它具有活血化瘀、破血結(jié)論的功能。臨床用于月經(jīng)封閉、止痛痛、皺紋、跌倒和其他損傷。現(xiàn)代臨床研究表明卷柏具有防癌治癌、抗炎、抗病毒、鎮(zhèn)痛、降血壓、降血糖和增強人體免疫功能等藥理作用［2］,抗腫瘤作用的主要有效成分為黃酮、木脂素及生物堿類化合物［3-5］。卷柏中黃酮類成分含量豐富,對腫瘤細(xì)胞的抑制效果明顯,為卷柏的主要活性成分。目前有關(guān)卷柏總黃酮提取工藝的報道均只單純以有效成分含量作為考察指標(biāo)［6-8］,不能準(zhǔn)確地反映提取成分的藥理藥效,存在一定的片面性;若設(shè)計以有效成分含量和藥效作用為綜合指標(biāo)的正交試驗［9-10］,雖能保證優(yōu)選提取工藝的藥效,但操作復(fù)雜。本實驗采用量效對比法,運用以抑制率為指標(biāo)的正交試驗結(jié)果優(yōu)選替代藥效的穗花杉雙黃酮和總黃酮含量的權(quán)重系數(shù),避免了采用量效融合指標(biāo)進(jìn)行試驗的復(fù)雜性,為其他中藥材提取工藝的優(yōu)選提供參考。1生物凈化劑及儀器1100系列高效液相色譜儀(美國Aglient公司),U-2001型紫外分光光度計(日本Hitachi公司),Sunrise型酶標(biāo)儀(奧地利Tecan公司),UAIRETMUSAutoflow型CO2培養(yǎng)箱(德國Nuaire公司),HD2-BCN-1360B型生物潔凈工作臺(哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司),AE31型倒置顯微鏡(日本奧林巴斯公司)。穗花杉雙黃酮對照品(中國食品藥品檢定研究院,批號111902-201102),卷柏購自大連市開發(fā)區(qū)保健大藥房,經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)翟延君教授鑒定為Selaginellatamariscina(Beauv.)Spring的干燥全草;人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721(上海復(fù)蒙生物有限公司),羧甲基纖維素鈉(CMC-NA,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司),噻唑藍(lán)(MTT,美國GIBCO公司),二甲基亞砜(DMSO,北京索萊寶科技有限公司),所用試劑均為分析純。昆明種小鼠,體重(20±2)g,雌性,購于大連醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心,均達(dá)到國家清潔級標(biāo)準(zhǔn),合格證號SCXK(遼)2008-0002。2穗花杉雙黃酮與a的關(guān)系2.1卷柏細(xì)胞藥效學(xué)試驗2.1.1細(xì)胞培養(yǎng)人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721常規(guī)培養(yǎng)于含10%熱滅活小牛血清的1640培養(yǎng)液(含青鏈霉素100U·mL－1)中,于37℃,5%CO2培養(yǎng)箱連續(xù)培養(yǎng)。2.1.2含藥血清的制備［11-13］將清潔級昆明小鼠隨機分為10組,一組為空白對照組(給予等體積0.1%CMC水溶液),其余9組為正交試驗組。每日灌胃給藥2次,間隔12h,每次0.4mL(給藥劑量10.4g·kg－1·d－1),連續(xù)灌胃3d。末次灌胃前禁食不禁水,1h后,無菌摘取小鼠眼球取血,置2mL離心管中,靜置30min,以4000r·min－1離心15min,于56℃滅活處理30min,經(jīng)0.22μm微孔濾膜濾過,置于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?.1.3MTT試驗［14-15］取處于對數(shù)生長期的SMMC-7721細(xì)胞進(jìn)行計數(shù),調(diào)整細(xì)胞濃度5×104個/mL,接種于96孔培養(yǎng)板中,每孔加入細(xì)胞懸液100μL,于37℃,5%CO2及飽和濕度下培養(yǎng)24h,每個正交試驗組設(shè)5個復(fù)孔,24h后分別加入10%含藥血清繼續(xù)培養(yǎng)24h,培養(yǎng)板每孔加入MTT(200mg·L－1)50μL,同樣條件繼續(xù)孵育4h,吸棄上清,每孔加入DMSO150μL振蕩混勻,于酶標(biāo)儀492nm處測定各孔的吸光度值(A),計算細(xì)胞抑制率。2.2總黃酮的含量測定2.2.1對照品溶液制備精密稱取減壓干燥至恒重的穗花杉雙黃酮對照品10.1mg,加甲醇超聲溶解并定容至100mL量瓶中,即得0.101g·L－1的對照品儲備液。2.2.2檢測波長的選擇移取對照品儲備液適量,加甲醇定容至刻度,倒入比色皿中,于200~900nm進(jìn)行全波長掃描,確定卷柏總黃酮的最大收波長269nm。2.2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制分別精密移取穗花杉雙黃酮對照品儲備液0.1,0.2,0.3,0.4,0.5mL于5mL量瓶中,加甲醇定容至刻度,倒入比色皿中,以相應(yīng)試劑為空白,于269nm處測定A,以A為縱坐標(biāo),質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),得回歸方程Y=78.202X+0.0563(R2=0.9996),表明在2.70~8.90mg·L－1與A呈良好線性關(guān)系。2.3穗花杉雙黃酮的含量測定2.4正交試驗在預(yù)試驗基礎(chǔ)上,選取提取時間、提取次數(shù)、乙醇用量及體積分?jǐn)?shù)為考察因素,分別以抑制率、總黃酮和穗花杉雙黃酮提取量的綜合評分為評價指標(biāo),試驗安排及結(jié)果見表1,方差分析見表2,3。以抑制率為指標(biāo),直觀分析表明各因素對提取工藝的影響順序為D>A>C>B。以極值最小的B因素為誤差項進(jìn)行方差分析,表明因素D具有顯著性影響,其他因素則無顯著性影響,結(jié)合生產(chǎn)周期和成本考慮,確定最佳提取條件為A3B1C1D2,即加10倍量70%乙醇回流提取1次,每次3h。通過該提取條件優(yōu)選得到穗花杉雙黃酮與總黃酮含量的最佳權(quán)重系數(shù)分別為0.3,0.7,此時2種指標(biāo)的最佳提取條件一致,證明在該權(quán)重系數(shù)下含量測定的綜合評分可代替抑制率作為卷柏抗腫瘤組分提取工藝的考察指標(biāo)。2.5單因素試驗正交試驗表明乙醇體積分?jǐn)?shù)是影響提取工藝的最主要因素,為驗證優(yōu)選乙醇體積分?jǐn)?shù)的準(zhǔn)確性,對其進(jìn)行了單因素試驗考察,選擇65%,70%,75%共3個水平,結(jié)果卷柏提取液細(xì)胞抑制率分別為38.12%,39.79%,39.43%,表明70%醇提液對肝腫瘤細(xì)胞抑制效果顯著,進(jìn)一步驗證了優(yōu)選的提取工藝。2.6相關(guān)性分析通過SPSS17.0軟件將9組樣品的穗花杉雙黃酮含量分別與總黃酮含量及細(xì)胞抑制率三者進(jìn)行Pearson相關(guān)系數(shù)分析,結(jié)果見表4,表明指標(biāo)性成分選擇正確,同時進(jìn)一步認(rèn)證黃酮類成分為卷柏抗腫瘤的有效成分。2.7驗證試驗稱取卷柏3份,每份10g,按優(yōu)選的工藝條件進(jìn)行提取,結(jié)果抑制率分別為45.12%,44.96%,43.90%,總黃酮提取量依次為2.27%,2.24%,2.18%,穗花山雙黃酮提取量分別為0.46%,0.46%,0.48%,表明優(yōu)選的提取工藝穩(wěn)定可行,且藥效學(xué)結(jié)果穩(wěn)定。3單因素試驗和正交試驗考察總黃酮含量與療效的關(guān)系文獻(xiàn)報道超聲法為卷柏總黃酮的最佳提取方法,該方法雖具有操作簡便、提取時間短等優(yōu)點,但不太適合工業(yè)大生產(chǎn)。預(yù)試驗分別考察了浸泡法、回流法、超聲波提取法,結(jié)果顯示超聲提取法雖有較好提取率,但三者間無顯著性差異,故綜合考慮,確定選用回流提取法。在確定提取方法基礎(chǔ)上,曾對提取溶劑(乙酸乙酯,乙醇,水等)進(jìn)行單因素試驗考察,以總黃酮含量為指標(biāo),確定最佳溶劑為乙醇。中藥有效成分復(fù)雜,某一類化學(xué)成分與藥效間多無直接的線性關(guān)系。本文通過正交量效對比,建立卷柏有效成分含量與肝腫瘤抑制率的關(guān)聯(lián),探索可代表細(xì)胞抑制率的有效成分含量指標(biāo)的權(quán)重系數(shù),該方法不僅能在確保藥效的前提下簡化考察指標(biāo),同時也進(jìn)一步說明黃酮類成分為卷柏藥材抗腫瘤的活性成分。通過SPSS17.0軟件相關(guān)性分析,證實了總黃酮是卷柏抗腫瘤作用的主要有效成分,而穗花衫雙黃酮為總黃酮的指標(biāo)性成分,且驗證了代替藥效的有效成分含量指標(biāo)所賦予的