紅豆杉科植物的葉片蛋白分析

紅豆杉科植物的葉片蛋白分析

在分類和研究裸子植物方面存在許多困難和差異。盡管自本世紀初以來植物學(xué)者就為此進行著不懈努力,但是至今仍然沒有獲得滿意結(jié)果。其中在紅豆杉科(Taxaceae)、三尖杉科(Cephalotaxaceae)和羅漢松科(Podocarpaceae)系統(tǒng)學(xué)研究中所存在的爭論更為明顯。目前對紅豆杉科、三尖杉科和羅漢松科的比較形態(tài)學(xué)、木材顯微結(jié)構(gòu)、葉的解剖特征、配子體發(fā)育、胚胎發(fā)生、細胞學(xué)及植物化學(xué)方面的研究均有報道,但從葉片蛋白質(zhì)分析3科植物系統(tǒng)位置的報道卻非常有限。本文研究了紅豆杉科(Taxaceae)植物南方紅豆杉(Taxuschinensisvar.mairei(LemeeetLevl.)ChengetL.K.Fu)穗花杉(Amentotaxusargotaenia(Hance)Pilger)、云南穗花杉(A.yunnanensisLi)、白豆杉(Pseudotaxuschienii(Cheng)Cheng)以及三尖杉科(Cephalotaxaceae)植物三尖杉(CephalotaxusfortuneiHook.f.)、粗榧(C.sinensis(Rehd.etWils.)Li)、海南粗榧(C.hainanensisLi)、篦子三尖杉(C.oliveriMast.)和羅漢松科(Podocarpaceae)植物羅漢松(Podocarpusmacrophyllus(Thunb.)D.Don)、雞毛松(P.imbricatus)、竹柏(P.nagi(Thunb.)Zoll)、陸均松(DacrydiumpierreiHickel)共12種植物的葉片蛋白,在蛋白質(zhì)水平對3科植物的系統(tǒng)發(fā)育進行了探討。1材料和方法1.1來自來源12種植物材料來源見表1,憑證標本藏于華南植物園和中山大學(xué)植物標本室。1.2催化劑和甲基磺酸鈉servaAcr(acrylmide,丙烯酰胺)、Bis(methylene-bisarylmide,N,N-甲叉雙丙烯胺)、SDS(Dodecylsufate-Na-Salt,十二烷基磺酸鈉)為Serva產(chǎn)品。TEMED(N,N,N′N′-tetramethyleThylene-Diamine,N,N,N′N′-四甲基乙二胺)購自北京天象人有限公司。Tris(三羥甲基氨基甲烷)購自美國SIGMA公司(優(yōu)級純)。β-mercaptoethend(β-巰基乙醇)購自美國SIGMA公司(優(yōu)級純)。其余試劑為分析純試劑。1.3tis-方法參見于玲等方法。稱取0.25g植物材料,加液氮迅速研磨成細粉,然后轉(zhuǎn)移至1.5mlEppendorf管中,加1ml丙酮輕輕振搖數(shù)分鐘,1000r/min離心數(shù)分鐘,棄丙酮液。重復(fù)一次。將EP管放入干燥器中真空抽干后,加2×樣品緩沖液(0.125mol/LTris,pH6.8;10%SDS;4%β-巰基乙醇;10%甘油;0.02%溴酚藍)1ml研磨一段時間,15000r/min離心10min,取上清液加熱(100℃,3min)再12000r/min離心10min取上清液。利用垂直板進行SDS電泳。濃縮膠濃度12%,分離膠5%,起始穩(wěn)流30mA1h,然后穩(wěn)流40mA,當染料前沿距硅橡膠框底邊1.5cm時,停止電泳,關(guān)閉電源。取出凝膠板放于培養(yǎng)皿中,加固定液(50%甲醇454ml與冰乙酸46ml混均)固定過夜。然后將染色液(0.125g考馬斯亮藍R250溶于185ml蒸餾水,62.5ml異丙醇,27.5ml冰乙酸過濾而成)倒入培養(yǎng)皿中,染色1h左右,用蒸餾水漂洗數(shù)次,再用脫色液(1000ml水溶液中含75ml冰乙酸和50ml甲醇)脫色直至蛋白質(zhì)區(qū)帶清晰。照相,并計算相對遷移率。1.4肽譜相似系數(shù)和排序參照王義弘的方法。根據(jù)肽譜之間的相似性,按各個種的肽譜計算出一組肽譜相似系數(shù),以此來確定對比種的肽譜相似程度,并在肽譜相似系數(shù)表示的組成差別的基礎(chǔ)之上進行雙軸系統(tǒng)的肽譜排序。2結(jié)果2.1肽譜帶不相似值的計算數(shù)據(jù)處理的基本程序如下:(1)計算各個種蛋白質(zhì)肽譜帶相似系數(shù)(c),c=2w/(a+b)×100%。式中,a為種A蛋白質(zhì)肽譜帶數(shù),b為種B蛋白質(zhì)肽譜帶數(shù)。w為A、B兩種的相同譜帶數(shù)。(2)配對計算各種間的肽譜帶相似系數(shù),與計算不相似系數(shù)d(d=100-c)構(gòu)成一個矩陣。(3)計算各種肽譜帶不相似值總和Σ(表2)。(4)確定各個肽譜在x軸上的位置。xi=(L2+Da2-Db2)/2L,其中為xi所求種的肽譜沿x軸對不相似值總和最大的種A(白豆杉)肽譜的距離,L為種A與種B(雞毛松,與種A最不相似)肽譜之間的不相似值,Da為種A與所求種肽譜之間的不相似值,Db為種B與所求種肽譜之間的不相似值。(5)確定各個種的肽譜在y軸上的位置。先計算出各種的肽譜在x軸上的吻合性差度值(ei)ei=D2a?x2i??????√yi=[(L′)2+(D′a)2?(D′b)2]/2L(ei)ei=Da2-xi2yi=[(L′)2+(D′a)2-(D′b)2]/2L,其中yi為所求種的肽譜y軸對最高ei值種A′(云南穗花杉)肽譜的距離,L′為種A′與種B′(陸均松,與種A′最不相似)肽譜之間的不相似值,D′a為種A′與所求種肽譜之間的不相似值,D′b為種B′與所求種肽譜之間的不相似值。各個種肽譜在兩軸排序系統(tǒng)的位置分別由x軸和y軸坐標表示(圖1)。2.2個片段的確定各種材料所呈現(xiàn)的蛋白質(zhì)譜帶數(shù)目不等,除白豆杉譜帶較少外(11條),其余譜帶數(shù)目均較多,其中云南榧譜帶多達36條,各譜帶遷移率(Rf值)在0.026～0.987之間。根據(jù)蛋白質(zhì)譜帶的遷移率,可將蛋白質(zhì)譜帶劃分為3個區(qū)段。第一區(qū)段Rf=0.026～0.282,此區(qū)段的特點是蛋白質(zhì)譜帶相似性程度較高,數(shù)目較少;第二區(qū)段Rf=0.282～0.615,此區(qū)段除白豆杉外,其余蛋白質(zhì)譜帶相似性程度較高,數(shù)目較多;第三區(qū)段Rf=0.615～0.987,此區(qū)段蛋白質(zhì)譜帶特點是特異性較高。3討論3.1pv、丙酮的選擇從植物葉片中直接提取總蛋白質(zhì)進行電泳往往會因為譜帶背景過深而得不到理想的實驗結(jié)果甚至根本無法看清譜帶,本實驗也遇到了類似的問題。為了解決這一問題,試用了將樣品加液氮研磨后分別用丙酮、丙酮+三氯乙酸及提取液中加入PVP進行處理,結(jié)果發(fā)現(xiàn),用丙酮處理兩次然后再進行提取就能解決譜帶背景過深的問題。另外,我們也對比了嫩葉與老葉的譜帶,發(fā)現(xiàn)它們之間沒有區(qū)別。3.2穗花杉屬和三尖杉屬的重新排出性和穩(wěn)定性紅豆杉科(Taxaceae)是裸子植物的一個重要科,我國有4個屬:紅豆杉屬(Taxus)、白豆杉屬(Pseudotaxus)、穗花杉屬(Amentotaxus)和榧樹屬(Torreya)。有關(guān)白豆杉屬(Pseudotaxus)和穗花杉屬(Amentotaxus)的系統(tǒng)位置一直存在明顯的分歧。穗花杉屬是否歸屬紅豆杉科及其在紅豆杉科內(nèi)的分類等級還有爭議。穗花杉屬是Pilger根據(jù)模式種Amentotaxusargotaenia(Hance)Pilger于1916年建立的。此種最早被作為羅漢松屬(Podocarpus)的一個成員,后被移入三尖杉屬,最終又獨立為穗花杉屬。Pilger根據(jù)雄球果的復(fù)合性把穗花杉屬和三尖杉屬歸入三尖杉科。但是Kudo觀察雌球果后認為它不應(yīng)放在三尖杉科而應(yīng)成立新穗花杉科(Amentotaxaceae)。而Koidzumi認為穗花杉屬和三尖杉屬有聯(lián)系,主張把紅豆杉科和三尖杉科置于同一科內(nèi),兩者均降至亞科地位。Florin認為應(yīng)把穗花杉屬從三尖杉科移到紅豆杉科。Keng也認為穗花杉屬放在紅豆杉科比放在三尖杉科或是獨立成科更好,并且認為紅豆杉科可能是通過穗花杉屬和三尖杉科相聯(lián)系。席以珍對穗花杉(Amentotaxusargotaenia(Hance)Pliger)、云南穗花杉(A.yunnanensisLi)花粉外壁的超微結(jié)構(gòu)進行了研究,支持把穗花杉屬從紅豆杉科分離出來建立穗花杉科。管啟良等報道了穗花杉(A.argotaenia(Hance)Pilger)雌株和雄株的染色體數(shù)目、核型,認為穗花杉均不同于紅豆杉科其它屬和三尖杉科,而接近羅漢松科羅漢松屬的某些種,贊同將穗花杉屬歸于羅漢松科。由二維排序結(jié)果可知,穗花杉(A.argotaenia(Hance)Pilger)、云南穗花杉(A.yunnanensisLi)與紅豆杉科其它兩種植物的親緣關(guān)系較近,因此穗花杉屬(Amentotaxus)應(yīng)置于紅豆杉科內(nèi),不支持將穗花杉屬(Amentotaxus)獨立成科的觀點。白豆杉屬(Pseudotaxus)是鄭萬均建立的,是我國裸子植物的特有屬之一。本屬僅有白豆杉(Pseudotaxuschienii(Cheng)Cheng)一種。它的胚胎發(fā)育類似于紅豆杉屬?；ǚ坌螒B(tài)的研究顯示應(yīng)把白豆杉由紅豆杉屬分離出來成為一新屬,而且應(yīng)將白豆杉屬上升為白豆杉族(Pseudotaxeae)和紅豆杉族并列。張君增等根據(jù)白豆杉和紅豆杉屬的化學(xué)成分有很大的區(qū)別,支持白豆杉屬上升為白豆杉族的觀點。在二維排序圖上,白豆杉一方面和紅豆杉科其它三種植物聚為一類;另一方面又與這三種植物之間有一定的距離,因而支持白豆杉是紅豆杉科內(nèi)一個屬的觀點。3.3尖杉屬分類的選擇一般認為三尖杉科(Cephalotaxaceae)僅包括三尖杉屬(Cephalotaxus)一屬。胡玉熹在光鏡與掃描電鏡下比較了三尖杉屬植物葉片構(gòu)造與葉表面角質(zhì)層的特征,發(fā)現(xiàn)篦子三尖杉(Cephalotaxusoliveri)和三尖杉屬的其余種類相似特征獨特,建議將三尖杉屬分為三尖杉組(Sect.Cephalotaxus)和篦子三尖杉組(Sect.Pectinatae)。傅立國對三尖杉屬的分類作了訂正,認為三尖杉屬宜分為篦子三尖杉組(Sect.Pectinatae)和三尖杉組(Sect.Cephalotaxus)及9個種。對篦子三尖杉的胚胎學(xué)研究發(fā)現(xiàn)它與三尖杉屬的其它種相比有不少共性但是也存在明顯差異,贊同將篦子三尖杉在本屬中另立一組。席以珍對三尖杉科的花粉形態(tài)及其外壁超微結(jié)構(gòu)進行了研究。支持在該屬中分別成立篦子三尖杉組(Sect.Pectinatae)和三尖杉組(Sect.Cephalotaxus)的意見?？偟鞍纂淖V表明,三尖杉、粗榧、海南粗榧相互之間親緣關(guān)系較近,在蛋白質(zhì)水平上未能分開,但篦子三尖杉跟這三種植物親緣關(guān)系相對較遠,支持在三尖杉科內(nèi)成立篦子三尖杉組和三尖杉組。3.4竹柏類的納入羅漢松屬是羅漢松科(Podocarpaceae)中的一個頗為引人注目的類群。羅漢松屬內(nèi)的竹柏類植物因葉脈和生殖器官的構(gòu)造特殊,分類地位和進化也一直存在許多爭議。DeLaubenfeles修訂羅漢松科時曾將竹柏類獨立成屬。Page確認了Nageia屬名的合法性并指出竹柏類是極自然的類群。傅德志進一步主張將竹柏屬從羅漢松科中分離出來建立單屬新科竹柏科(NageiaceaeD.Z.Fu)。在蛋白質(zhì)二維排序圖上,羅漢松(Podocarpusmacrophyllus)、雞毛松(Podocarpusimbricatus)、竹柏(Podocarpusnagi)三種植物親緣關(guān)系相對較近,而陸均松與羅漢松科其它植物親緣關(guān)系較遠,這一方面說明陸均松屬是一個自然類群,支持在羅漢松科內(nèi)成立陸均松屬,另一方面則不支持將竹柏屬從羅漢松科中分離出來建立單屬新科。3.5材料間的聚類關(guān)系紅豆杉科、三尖杉科及羅漢松科是研究裸子植物系統(tǒng)發(fā)育的焦點之一。紅豆杉科、三尖杉科及羅漢松科是一個特殊類群。本世紀初Pilger根據(jù)這些類群具包裹種子的肉質(zhì)結(jié)構(gòu)和極為減化的珠鱗,把三尖杉科和羅漢松科包括在紅豆杉科內(nèi)。Neger認為三尖杉屬的雌球花極為特殊,與紅豆杉科區(qū)別