卷柏中穗花杉雙黃酮的提取和分離純化研究

卷柏中穗花杉雙黃酮的提取和分離純化研究

柏樹(shù)及其下屬植物廣泛分布，品種豐富。全世界約有700余種,我國(guó)約有50余種,產(chǎn)于全國(guó)各地。主要分布在廣東、廣西、福建、臺(tái)灣、浙江、江蘇、江西、湖南、陜西,河北、山東、遼寧、吉林等地。春秋兩季均可采集,藥源豐富。卷柏很早就入藥,藥用全草,其性平、味微辛。古代醫(yī)家主要將生卷柏用于活血化瘀,治療跌打傷痛、腹痛、哮喘、月經(jīng)閉止等癥。炒卷柏(炭)用于止血,治療月經(jīng)過(guò)多、吐血、尿黃,研粉外敷以止刀傷出血等。卷柏經(jīng)我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)長(zhǎng)期臨床實(shí)踐及現(xiàn)代藥理驗(yàn)證,確認(rèn)其有清熱解毒、活血化瘀、止血抗癌、防癌治癌、抗炎、抗病毒、抗感染、抗過(guò)敏、鎮(zhèn)痛、催眠、降血壓、降血糖、增強(qiáng)人體免疫功能等功效。其臨床上主要用于治療閉經(jīng)、吐血、尿血、便血、崩漏、脫肛、跌打損傷、腹痛、哮喘等。近年來(lái),國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)卷柏屬植物的化學(xué)成分進(jìn)行了大量的研究。從卷柏屬植物中主要得到的是黃酮類化合物,而且其中以雙黃酮類化學(xué)物居多。目前關(guān)于卷柏中穗花杉雙黃酮的分離純化方法報(bào)道較多,但是存在成本高、工藝繁瑣、試劑耗費(fèi)量大、分離時(shí)間長(zhǎng)、操作復(fù)雜、能耗大等缺點(diǎn)。本文比較了卷柏中穗花杉雙黃酮的提取方法,并采用兩步沉淀和硅膠柱層析對(duì)其進(jìn)行純化,得到高純度的穗花杉雙黃酮產(chǎn)品,為其制備提供了一種工藝簡(jiǎn)單、可操作性強(qiáng)、成本低、收率高且不額外使用其他有毒試劑、適合工業(yè)化生產(chǎn)的方法。1材料和方法1.1試劑及儀器卷柏:河北安國(guó)藥都制藥集團(tuán)有限公司。穗花杉雙黃酮(Amentoflavone)對(duì)照品:北京匯科同創(chuàng)科學(xué)儀器有限公司;甲醇:色譜純,迪馬公司;水:超純水,自制;其余試劑均為分析純;三氟乙酸:色譜純,默克公司;薄層層析預(yù)制硅膠板:HSGF254,煙臺(tái)市化學(xué)工業(yè)研究所;硅膠:200~300目,青島海洋化工廠;層析柱:500mm×18mm,上海錦華層析設(shè)備廠。LC-20AT島津高效液相色譜儀:日本;BP211D電子分析天平:德國(guó)賽多利斯集團(tuán);TDL-5離心機(jī):上海安亭科學(xué)儀器廠。1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1高效液鉻檢測(cè)條件1.2.2配制成濃度準(zhǔn)確稱取3.94mg穗花杉雙黃酮標(biāo)準(zhǔn)品溶于1mL甲醇溶液,配制成濃度為0.031、0.062、0.124、0.247、0.493、0.985mg/mL。依次進(jìn)樣分析。以對(duì)照品濃度X(mg/mL)與穗花杉雙黃酮峰面積平均值作圖,結(jié)果經(jīng)回歸分析。1.2.3提取方法和選擇比較回流提取法、超聲提取法、堿提酸沉法、微波提取法和半仿生提取法等5種提取方法。1.2.4穗花杉、雙黃酮提取物的純化由于卷柏提取物中含有較多雜質(zhì),同時(shí)考慮到穗花杉雙黃酮較高的脂溶性及其易溶于乙醇的性質(zhì),探索將粗品溶解后調(diào)整合適的醇-水比例,進(jìn)一步微調(diào)溶解液的極性,將與穗花杉雙黃酮極性相差較大的雜質(zhì)除去,對(duì)其進(jìn)行初步的純化。稱取一定量卷柏粉末,提取。將提取液過(guò)濾濃縮,蒸干得固體粉末。稱取等量的提取物粉末,溶于一系列醇濃度的溶液中,沉降一定的時(shí)間后,離心,分別收集上清液和沉淀。測(cè)定上清液中穗花杉雙黃酮的含量和沉淀烘干至恒重,得到卷柏中穗花杉雙黃酮提取溶液的沉淀曲線。1.2.5卷柏粗提物的分離純化由薄層層析所得洗脫劑、洗脫劑配比進(jìn)行卷柏粗提物硅膠柱層析的分離純化,摸索洗脫順序、洗脫體積等操作參數(shù),進(jìn)行卷柏粗提物的分離純化。將硅膠柱層析洗脫所得的產(chǎn)品洗脫液接樣收集。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干后,稱質(zhì)量。精密稱取一定質(zhì)量的產(chǎn)品,用一定量甲醇溶解,進(jìn)行高效液相色譜分析,計(jì)算純度和回收率。2結(jié)果與討論2.1精密度與回收率標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=1.787×107X-5.395×104,r2=0.9999。穗花杉雙黃酮在0.031~0.985mg/mL范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。精密度試驗(yàn)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.54%,重復(fù)性試驗(yàn)RSD為0.74%,穩(wěn)定性試驗(yàn)RSD為0.82%。加樣回收率試驗(yàn)回收率平均值98.4%,RSD為0.94%。該方法與現(xiàn)有文獻(xiàn)方法相比更經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便、快捷,采用梯度洗脫模式的方法縮短了分析時(shí)間,節(jié)省了溶劑耗費(fèi),有很好的分離效果。2.2最佳提取工藝的確定比較了回流提取法、超聲提取法、堿提酸沉法、微波提取法和半仿生提取法,并篩選了提取溶劑,綜合考慮提取率、能源耗費(fèi)等因素,確定卷柏中穗花杉雙黃酮的最佳提取工藝為提取溫度75℃、料液比1∶12、提取時(shí)間為0.5h。提取次數(shù)為2次。80%乙醇水溶液回流提取的提取率為93.24%,其提取物的純度為5.92%。重復(fù)性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明此條件下的提取率重現(xiàn)性良好。2.3乙醇濃度對(duì)產(chǎn)品品質(zhì)的影響稱取100g卷柏粉末,75℃回流提取,提取液80%乙醇,料液比1∶12,提取2次,每次0.5h。將提取液過(guò)濾濃縮,蒸干得固體粉末。稱取等量的提取物粉末,溶于乙醇濃度分別為0%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%的溶液中。沉降一定的時(shí)間后,離心,分別收集上清液和沉淀。測(cè)定上清液中穗花杉雙黃酮的含量和沉淀烘干至恒重,得到卷柏中穗花杉雙黃酮提取溶液的沉淀曲線。由圖1可以看出,隨著溶液中乙醇濃度的降低,溶液中開(kāi)始有沉淀生成,且生成的沉淀重量不斷增加。與此同時(shí),上清液中穗花杉雙黃酮的含量則呈“S”型變化:隨著溶液中乙醇濃度的降低,剛開(kāi)始清液中目標(biāo)產(chǎn)物的含量基本變化不大,在溶液乙醇濃度降到70%時(shí)上清液中穗花杉雙黃酮的含量出現(xiàn)突變,而后迅速下降并在40%降至較低水平,隨著乙醇濃度的進(jìn)一步降低,清液中目標(biāo)產(chǎn)物的含量基本維持不變。乙醇濃度從80%降至60%時(shí),目標(biāo)產(chǎn)物與溶液的極性相近,主要存在于清液中;而與溶液極性相差較大的極性雜質(zhì)不斷沉淀,對(duì)應(yīng)得到的沉淀質(zhì)量也在不斷增加。在乙醇濃度從60%降至40%時(shí),上清液中穗花杉雙黃酮的含量驟降,此時(shí)有大量的穗花杉雙黃酮作為沉淀沉降,并在乙醇濃度為40%沉降完全。在乙醇濃度從40%降至0%時(shí),清液中的目標(biāo)產(chǎn)物已大部分沉降到沉淀里,溶液中的非極性雜質(zhì)與乙醇溶液的極性相差較大,作為沉淀不斷沉降。因此選取乙醇濃度70%、65%、60%和50%、45%、40%對(duì)沉降目標(biāo)產(chǎn)物的合適乙醇濃度進(jìn)行進(jìn)一步細(xì)化。結(jié)果發(fā)現(xiàn),60%乙醇溶液能很好的沉降極性雜質(zhì)且保證絕大部分的目標(biāo)產(chǎn)物仍存在于清液里,45%乙醇溶液能使絕大部分目標(biāo)產(chǎn)物沉降且使較多的非極性雜質(zhì)存在于清液中。兩步沉降的具體過(guò)程如下:卷柏回流提取液濃縮后加水,使其乙醇濃度為60%,沉降一定時(shí)間后過(guò)濾;濾液再次濃縮,加水使其乙醇濃度為45%,沉降一定時(shí)間后離心,棄上清液,所得沉淀即為目標(biāo)產(chǎn)物。一次沉降目標(biāo)產(chǎn)物的回收率為93.86%,二次沉降目標(biāo)產(chǎn)物的回收率為95.46%;兩步沉降的總回收率為88.66%,所得產(chǎn)品純度為58.19%。卷柏回流提取的粗提物的純度為5.92%,經(jīng)兩步沉淀工藝初步純化后,其純度可達(dá)58.19%,且兩步沉淀工藝的回收率高達(dá)88.66%。可見(jiàn)兩步沉淀工藝是初步純化卷柏回流粗提物的有效步驟。該工藝?yán)萌芤褐心繕?biāo)產(chǎn)物與雜質(zhì)極性的差異,操作方便、工藝簡(jiǎn)單、未使用其他有機(jī)溶劑,同時(shí)可兼顧純度和回收率,得到較高純度的目標(biāo)產(chǎn)物。2.4洗脫劑配比優(yōu)化根據(jù)穗花杉雙黃酮的結(jié)構(gòu)和性質(zhì),以氯仿、甲醇、二氯甲烷、正己烷、乙酸乙酯及其不同配比為薄層展開(kāi)劑,篩選硅膠柱層析的洗脫劑和配比。Hexane∶EtOAc體系對(duì)粗品完全不能展開(kāi)。CHCl3∶MeOH體系目標(biāo)產(chǎn)物和雜質(zhì)有不同程度的分離,條帶分隔較為明顯,且CHCl3∶MeOH=12∶1時(shí)開(kāi)始有目標(biāo)產(chǎn)物被洗脫下來(lái),對(duì)該洗脫劑配比進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。MeOH體系則將目標(biāo)產(chǎn)物和雜質(zhì)全部洗脫。將CHCl3∶MeOH=12∶1配比的洗脫劑進(jìn)一步細(xì)化篩選,其具體配比見(jiàn)表4。CHCl3∶MeOH洗脫劑配比為72∶3和72∶5時(shí)可較好的將目標(biāo)產(chǎn)物與雜質(zhì)分離,因此選用這兩個(gè)配比的洗脫劑作為硅膠柱層析的洗脫劑。以卷柏粗提物2步沉淀工藝后的粗品干法上樣,硅膠柱層析的洗脫劑、配比及洗脫順序、洗脫體積等參數(shù)詳見(jiàn)表5。CHCl3∶MeOH=72∶3體系主要洗脫弱極性的雜質(zhì),隨著洗脫體系中甲醇比例的增高,目標(biāo)產(chǎn)物被洗脫。目標(biāo)產(chǎn)物被完全洗脫后,隨著洗脫體系中甲醇比例的進(jìn)一步增加,粗品中的極性雜質(zhì)被洗脫下來(lái)。CHCl3∶MeOH體系洗脫劑配比8∶1時(shí)所得產(chǎn)品純度可達(dá)97.16%,回收率可達(dá)50.74%。為了提高硅膠柱層析的回收率,可將CHCl3∶MeOH=5∶1和72∶5的洗脫液合并,蒸干后再用甲醇溶解,上樣,重復(fù)上述洗脫過(guò)程,得到產(chǎn)品,進(jìn)而提高硅膠柱層析過(guò)程中目標(biāo)產(chǎn)物穗花杉雙黃酮的回收率。3采用兩次沉淀法測(cè)定穗花杉雙黃酮產(chǎn)品純度通過(guò)兩步沉淀法和硅膠柱層析法對(duì)卷柏中穗花杉雙黃酮進(jìn)行了分離純化。本方法工藝簡(jiǎn)單、可操作性強(qiáng)、成本低、回收率高且不使用其他的試劑,為其分離純化提供了一條更優(yōu)的方法。采用兩次沉淀法使卷柏提取物的純度由5.92%升高至58.1