卷柏中穗花杉雙黃酮降血糖活性及量效關(guān)系研究

卷柏中穗花杉雙黃酮降血糖活性及量效關(guān)系研究

糖尿病是一種由遺傳或天后宮缺乏胰島素分泌或胰島素抵抗引起的慢性綜合性疾病，主要是糖代謝障礙。傳統(tǒng)的糖尿病治療藥物無法從根本上阻止胰島β細(xì)胞的進(jìn)一步壞死,并且有不同程度的不良反應(yīng),這些不良反應(yīng)限制了降糖藥物的使用。糖尿病屬于多基因病,而中草藥多靶點作用模式的潛在優(yōu)勢使它在糖尿病防治上成為當(dāng)前研究的熱點,現(xiàn)代研究結(jié)果表明具有降糖作用的植物有效成分主要有黃酮類、多糖、生物堿、皂苷、多肽等。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)中藥卷柏提取物具有降血糖作用,進(jìn)一步的研究表明其所含總黃酮為降糖的活性組分,而卷柏總黃酮中穗花杉雙黃酮是其最主要成分,含量約為31%。有研究報道穗花杉雙黃酮是蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)的非競爭性抑制劑,而PTP1B會使胰島素受體和胰島素受體底物去磷酸化,它的過表達(dá)會抑制胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo),進(jìn)而導(dǎo)致胰島素抵抗。且穗花杉雙黃酮能夠抑制α-葡萄糖苷酶的活性,提示其可能對糖代謝具有一定的干預(yù)作用。本實驗采用鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病小鼠模型進(jìn)行穗花杉雙黃酮初步體內(nèi)降血糖活性研究,考察其發(fā)揮降血糖活性最佳劑量,為穗花杉雙黃酮體內(nèi)降血糖作用提供實驗依據(jù)。1材料表面1.1動物損害責(zé)任4周齡健康雄性昆明種小鼠120只,體重18～22g,由鄭州大學(xué)動物中心提供。清潔級,動物合格證號SCXK(豫)2010-0002。飼養(yǎng)于18～22℃二級動物實驗室內(nèi),自由飲食、飲水。1.2卷柏屬植物卷柏的鑒定干燥卷柏全草購自本草國藥堂責(zé)任有限公司,經(jīng)河南中醫(yī)學(xué)院董誠明教授、陳隨清教授鑒定為卷柏屬植物卷柏Selaginellatamariscina(Beauv.)Spring。1.3研究對象鏈脲佐菌素(STZ)(批號L20100115,美國Sigma公司);羅格列酮(批號66080301,太極集團重慶涪陵制藥廠有限公司);葡萄糖檢測試劑盒(批號110613,中生北控生物科技股份有限公司);胰島素放射免疫測定試劑盒(批號P120608,北京科美東雅生物技術(shù)研究所);檸檬酸鈉,檸檬酸(北京化學(xué)試劑公司);其他各種化學(xué)試劑均為市售分析純。1.4放射免疫計數(shù)Model680型酶標(biāo)儀(美國BIO-RAD公司),SN-697型γ放射免疫計數(shù)器(上海核所日環(huán)光電儀器有限公司);倒置顯微鏡(日本Nikon公司),KDC-160HR高速低溫冷凍離心機(科大創(chuàng)新股份有限公司),AE240型1/10萬電子天平(瑞士Mettler公司)。2血糖及血糖模型的建立取干燥卷柏全草,70%的含水丙酮組織破碎提取后,置70%含水丙酮液中浸泡3d,紗布粗濾后進(jìn)行抽濾,抽濾液在真空減壓60℃條件下回收溶劑至稠膏狀,并于60℃條件下在真空干燥箱中抽干,得干浸膏。將卷柏70%含水丙酮提取物稠浸膏加適當(dāng)水渾懸,依次用乙醚、醋酸乙酯、正丁醇萃取,將各部位低溫減壓回收溶劑,濃縮,真空干燥后,在乙醚、醋酸乙酯部位利用DiaionHP-20,ToyopearlHW-40,MCIGelCHP-20,SephadexLH-20,硅膠等柱層析及制備薄層層析分離得到淡黃色粉末,經(jīng)鑒定為穗花杉雙黃酮,本實驗所用穗花杉雙黃酮經(jīng)HPLC歸一化法測定純度為98.12%。120只小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周,按體重均衡原則抽出12只作為正常對照組,給予基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng);其余108只小鼠ip180mg·kg-1STZ建立糖尿病模型;正常對照組ip同劑量檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。注射STZ3d后禁食12h,尾靜脈取血,3500r·min-1離心10min,分離血清,葡萄糖氧化酶法檢測空腹血糖(FBG),成模標(biāo)準(zhǔn)為空腹血糖≥16.7mmo1·L-1。選取成模小鼠84只按空腹血糖(FBG)均衡的原則隨機分為模型對照組(DC)、羅格列酮組(RG,4mg·kg-1)、穗花杉雙黃酮Ⅰ-Ⅴ組(30,60,120,240,480mg·kg-1),ig給藥,正常對照組(NC)與模型對照組(DC)給予等量的蒸餾水。連續(xù)給藥2周,給藥期間自由進(jìn)食、飲水。2.4血清胰島素的檢測記錄給藥前后各組小鼠進(jìn)食量、飲水量。給藥結(jié)束前2d進(jìn)行OGTT實驗:各組小鼠禁食12h后尾靜脈采血測定血糖即為OGTT0min血糖水平(FBG);然后給予2.0g·kg-1葡萄糖溶液,分別于30,60,120min尾靜脈采血,3500r·min-1離心10min分離血清,葡萄糖氧化酶法檢測血糖水平。給藥結(jié)束后,取血測定血清胰島素。血清胰島素使用胰島素放免試劑盒,SN-697型γ放射免疫計數(shù)器檢測。作出標(biāo)準(zhǔn)曲線,計算樣品濃度。給藥結(jié)束后,摘除眼球取血,分離血清,頸椎脫臼法處死,取胰腺組織保存于10%福爾馬林中備用,胰腺組織進(jìn)行梯度乙醇脫水,二甲苯透明,浸蠟,石蠟包埋,切片,常規(guī)HE染色,光鏡觀察病理學(xué)變化。實驗數(shù)據(jù)以xˉ±s表示,用SPSS13.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù),組間差異的顯著性采用單因素方差分析處理,P<0.05為有顯著性差異。3結(jié)果3.1正常小鼠和正常小鼠的飲水量比較注射STZ后,各組小鼠攝食量升高至正常小鼠的2倍左右,飲水量升高至正常小鼠的5倍左右。給予穗花杉雙黃酮后,攝食量和飲水量均有所下降,見表1。3.2血糖、胰島素水平給藥前,各組小鼠血糖水平為正常組小鼠血糖水平的4倍左右,且與正常組相比有極顯著差異(P<0.01);給藥后,與模型組相比,穗花杉雙黃酮各劑量組血糖水平均有不同程度降低,其中60,480mg·kg-1穗花杉雙黃酮組與模型組相比有顯著降低(P<0.05)。與正常組小鼠相比,模型組小鼠胰島素水平顯著性降低(P<0.05)。給藥后,穗花杉雙黃酮各劑量組小鼠胰島素水平與模型組相比均有不同程度升高;其中60mg·kg-1穗花杉雙黃酮組與模型組相比有顯著性升高(P<0.05),見表2。3.3穗花杉雙黃酮對小鼠血糖的影響正常組小鼠給予葡萄糖后30min血糖升高,60min降至正常水平;模型組小鼠0min到120min的血糖值與正常組相比均有極顯著性差異(P<0.01),且給予葡萄糖后30min血糖水平升高,至120min時仍維持在較高水平,說明其糖耐量嚴(yán)重受損。穗花杉雙黃酮各劑量組小鼠各時間點的血糖水平均較模型組低。其中,30mg·kg-1穗花杉雙黃酮在給予葡萄糖后30min時與模型組相比有顯著性降低(P<0.05),480mg·kg-1穗花杉雙黃酮在給予葡萄糖0min時與模型組相比有顯著性降低(P<0.05),60mg·kg-1穗花杉雙黃酮組在4個時間點均與模型組相比有顯著性降低(P<0.05),見表3。3.4小鼠胰島的形態(tài)正常組小鼠胰腺內(nèi)胰島數(shù)量及島內(nèi)細(xì)胞數(shù)均較多,胰島為圓形、橢圓形細(xì)胞團,形態(tài)完整規(guī)則,邊界清楚,島型豐滿,島細(xì)胞分布均勻,各細(xì)胞核呈橢圓形,胞漿豐富,染色質(zhì)疏松。模型組小鼠胰島明顯萎縮,輪廓欠圓潤,邊界欠清楚,排列稀疏不勻,細(xì)胞核固縮,視野中胰島數(shù)量顯著下降,體積縮小,并有大量的壞死現(xiàn)象。穗花杉雙黃酮各劑量組小鼠胰腺組織中胰島邊界清楚,部分胰島中度變性萎縮,但殘存胰島細(xì)胞較多,大部分胰島細(xì)胞形態(tài)恢復(fù),胞漿豐富,染色質(zhì)疏松,見圖1。4穗花杉雙黃酮對糖尿病小鼠血糖的影響鏈脲佐菌素(STZ)是一種含亞硝基的化合物,對動物的胰島β細(xì)胞具有高度選擇的毒性作用,利用較大劑量STZ誘導(dǎo)糖尿病動物,其機制是破壞胰島細(xì)胞導(dǎo)致胰島功能破壞,血糖明顯升高,常作為糖尿病動物模型。本實驗通過180mg·kg-1給小鼠腹腔內(nèi)一次性注射STZ建立糖尿小鼠模型,模型組小鼠飲食量、飲水量與對照組相比均持續(xù)增加,說明造模成功。給予不同劑量穗花杉雙黃酮后,各劑量組小鼠飲食量、飲水量經(jīng)小幅增長后隨之下降,甚至小于給藥初。說明穗花杉雙黃酮對糖尿病小鼠的飲水及飲食量增加具有一定的改善作用。FBG反映了短期內(nèi)血糖水平,而OGTT則反應(yīng)機體處理糖的能力,是目前評價糖代謝狀況的金標(biāo)準(zhǔn),同時也是評價胰島β細(xì)胞功能及胰島素敏感性的常用方法。實驗結(jié)果顯示,穗花杉雙黃酮60,480mg·kg-1可明顯降低糖尿病小鼠空腹血糖。模型組小鼠給予葡萄糖30min后,血糖水平顯著升高,而在60,120min血糖僅有小幅降低,且各時間點血糖水平顯著高于正常組,說明其糖耐量已經(jīng)嚴(yán)重受損,給藥2周后,穗花杉雙黃酮60mg·kg-1在4個監(jiān)測點均可明顯改善糖尿病小鼠糖耐量。以上結(jié)果提示,卷柏中的穗花杉雙黃酮對糖尿病小鼠的高血糖具有一定的干預(yù)作用,能改善葡萄糖耐量,增強糖尿病小鼠處理糖的能力。胰島素是體內(nèi)唯一的降血糖激素,由胰島β細(xì)胞分泌。β細(xì)胞功能損傷和胰島素分泌障礙是糖尿病主要誘因之一,而長期高血糖則又會抑制胰島素的合成分泌并使胰島β細(xì)胞功能惡化,兩者相互促進(jìn),使病情不斷惡化。實驗結(jié)果顯示,模型組小鼠胰島素分泌明顯減少,說明STZ已經(jīng)使胰島β細(xì)胞功能受損,本研究從模型組小鼠胰腺組織病理結(jié)構(gòu)的改變得到驗證:其胰島明顯萎縮,β細(xì)胞胞漿減少,且胰島數(shù)目也明顯減少。給藥后,穗花杉雙黃酮60mg·kg-1使糖尿病小鼠血清胰島素水平顯著性升高,穗花杉雙黃酮各劑量組均可使糖尿病小鼠胰島病理結(jié)構(gòu)得到一定恢復(fù),提示穗花杉雙黃酮在修復(fù)胰島組織、增強胰島β細(xì)胞功能上具有潛在的作用。以上實驗結(jié)果表明,穗花杉雙黃酮60mg·kg-1可顯著降低糖尿病小鼠空腹血糖,且可顯著增強胰島素分泌。同時,穗花杉雙