高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定卷柏和墊狀卷柏中2種炔多酚和雙黃酮

高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定卷柏和墊狀卷柏中2種炔多酚和雙黃酮

柏樹是柏樹科植物的柏樹。蒲公英（托吡魯姆，ethy）s.pullingata（托吡魯姆，ethyv.）maxim。干燥的全草，具有活血和生理性疼痛的功效。2010年版《中國(guó)藥典》收載了以穗花杉雙黃酮為質(zhì)控指標(biāo)的含量測(cè)定方法。作者前期對(duì)卷柏和墊狀卷柏進(jìn)行了系統(tǒng)的化學(xué)研究,發(fā)現(xiàn)二者均富含不同連接方式的雙黃酮類化合物?，F(xiàn)代藥理研究表明卷柏藥材中的雙黃酮類成分具有抗腫瘤、抗菌、抗病毒、抗炎、舒張血管等活性,且雙黃酮的連接方式與活性密切相關(guān);而selaginellin類成分具有抗微生物、抗氧化、抗衰老及神經(jīng)保護(hù)作用。因此,這2類成分同為卷柏藥材的特征性成分和活性成分。本文采用HPLC-DAD,同時(shí)測(cè)定不同產(chǎn)地的10批卷柏和12批墊狀卷柏中selaginellin,selaginellinB,穗花杉雙黃酮,穗花杉雙黃酮-7-甲醚,扁柏雙黃酮,異柳杉雙黃酮6種成分的含量,旨在為全面評(píng)價(jià)卷柏藥材的質(zhì)量提供科學(xué)依據(jù)。1實(shí)驗(yàn)藥材和試劑HP1100高效液相色譜系統(tǒng)(自動(dòng)進(jìn)樣器,二元泵,柱溫箱,DAD檢測(cè)器,AgilentTechnologiesInc.USA);KH3200E超聲波清洗儀(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司);BP211D電子天平(SatoriusCo.Ltd.,德國(guó))。本實(shí)驗(yàn)所用的各批次藥材均購(gòu)于中國(guó)各地的藥材市場(chǎng),藥材公司或自采,經(jīng)中國(guó)藥科大學(xué)王強(qiáng)教授鑒定,分別為卷柏S.tamariscina和墊狀卷柏S.pulvinata。乙腈為色譜純(ROE,ROEScientificInc,USA);水為樂(lè)百氏純凈水;其他試劑均為分析純,購(gòu)自南京化學(xué)試劑廠。Selaginellin,selaginellinB,穗花杉雙黃酮,穗花杉雙黃酮-7-甲醚,扁柏雙黃酮,異柳杉雙黃酮對(duì)照品為作者自制,經(jīng)1H,13C-NMR及ESI-MS確定結(jié)構(gòu),HPLC-UV面積歸一化法計(jì)算純度均在98%以上。2方法和結(jié)果2.1檢測(cè)波長(zhǎng)和條件色譜柱(4.6mm×250mm,5μm),ZORBAXC18預(yù)柱(4.6mm×12.5mm,5μm)。檢測(cè)波長(zhǎng)280,337nm;流速1mL·min-1;柱溫30℃;進(jìn)樣體積10μL。流動(dòng)相乙腈(A)-0.1%甲酸水(B),梯度洗脫,0～10min,36%A;10～28min,36%～50%A;28～29min,50%～58%A;29～35min,58%A;35～45min,58%～85%A。卷柏藥材及對(duì)照品色譜圖見(jiàn)圖1。2.2藥渣的提取藥材粉碎,過(guò)40目篩。精密稱取干燥至恒重的樣品細(xì)粉2g,置500mL錐形瓶中,加400mL75%乙醇回流提取1h,濾去藥渣,溶液濃縮至干。加甲醇定容至10mL,過(guò)0.45μL微孔濾膜,即得供試品溶液。2.3對(duì)照品溶液的制備分別精密稱取selaginellin,穗花杉雙黃酮,selaginellinB,穗花杉雙黃酮-7-甲醚,扁柏雙黃酮,異柳杉雙黃酮適量,用甲醇溶解并定容至同一量瓶中,制成混合對(duì)照品溶液。2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精密吸取對(duì)照品溶液,用甲醇稀釋配制成6個(gè)質(zhì)量濃度水平。按2.1色譜條件,分別對(duì)不同質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液進(jìn)樣分析,每個(gè)質(zhì)量濃度重復(fù)測(cè)定3次,取峰面積平均值。分別以對(duì)照品的質(zhì)量濃度X(mg·L-1)為橫坐標(biāo),峰面積值Y為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,并計(jì)算回歸方程,結(jié)果見(jiàn)表1。將混合對(duì)照品溶液用甲醇不斷進(jìn)行稀釋后分析,得到6個(gè)成分的LOD,LOQ,結(jié)果見(jiàn)表1。2.5加樣色譜條件分析取中間濃度的混合對(duì)照品溶液,同一天內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣6次,按2.1色譜條件分析,計(jì)錄峰面積,結(jié)果6個(gè)成分峰面積的RSD分別為1.6%,1.9%,1.1%,1.6%,1.6%,2.2%,1.4%,3.0%。2.6個(gè)化學(xué)成分的測(cè)定取同一批卷柏藥材6份,按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按2.1色譜條件測(cè)定供試品中的6個(gè)成分。經(jīng)計(jì)算,6個(gè)成分的保留時(shí)間及峰面積的RSD均小于3%,表明此方法重現(xiàn)性良好。2.7含量測(cè)定取同一份藥材,按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液。按2.1色譜條件,分別于0,2,4,12,24,48h測(cè)定(樣品保存于4℃冰箱中)。經(jīng)計(jì)算,6個(gè)成分的保留時(shí)間及峰面積的RSD均小于3.0%,表明供試品溶液在48h內(nèi)穩(wěn)定。2.8加樣回收率測(cè)定精密稱取已知含量的卷柏樣品6份,每份1g精密稱定,分別加入一定量的對(duì)照品,按2.2項(xiàng)下方法平行制備,按2.1項(xiàng)下方法進(jìn)樣分析,計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見(jiàn)表2。2.9種樹資基苯磺酸鈉樣品含量測(cè)定精密稱取不同來(lái)源的卷柏藥材,按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定,進(jìn)樣10μL用回歸方程計(jì)算各卷柏樣品中6種成分的含量。結(jié)果見(jiàn)表3。3卷柏與墊狀卷柏的含量測(cè)定本研究對(duì)提取溶劑,提取方式,檢測(cè)波長(zhǎng)進(jìn)行了考察。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看,selaginellins在280nm處吸收最強(qiáng),雙黃酮類化合物在337nm處吸收最強(qiáng),故采用DAD檢測(cè)器,選用280,337nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)檢測(cè)6種成分,效果滿意;以75%乙醇為提取溶劑,藥材量與溶劑量為1∶200時(shí),回流提取2h即達(dá)完全。此方法且簡(jiǎn)便易行,重復(fù)性好。本研究對(duì)全國(guó)不同產(chǎn)地的10個(gè)批次卷柏和12個(gè)批次的墊狀卷柏中selaginellins和雙黃酮2類特征性成分的含量進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示,2種卷柏藥材均含有以上2類特征性成分,二者的HPLC圖較接近。4個(gè)雙黃酮在卷柏與墊狀卷柏中的含量分布呈現(xiàn)一定的規(guī)律性,即穗花杉雙黃酮>扁柏雙黃酮>異柳杉雙黃酮>穗花杉雙黃酮-7-甲醚。表明將二者同時(shí)入用為卷柏的原藥材存在一定的合理性。含量測(cè)定結(jié)果亦表明,卷柏中穗花杉雙黃酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(5.628～9.184mg·g-1)普遍高于墊狀卷柏(0.823～7.131mg·g-1);而selaginellin卻相反,其在墊狀卷柏中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(0.123～0.593mg·g-1)高于卷柏(0.067～0.133mg·g-1),多個(gè)批次