植物天然產(chǎn)物氧化與微生物制造

植物天然產(chǎn)物氧化與微生物制造植物天然產(chǎn)物主要包括萜類、黃酮類、醌類、生物堿類等物質(zhì)，具有豐富的生理藥理活性[1-2]。在生成植物天然產(chǎn)物的過程中，氧化反應(yīng)占重要地位，一般來說，氧化反應(yīng)引入的羥基、環(huán)氧等官能團是天然產(chǎn)物后續(xù)進行糖基化、酰基化等許多其他修飾反應(yīng)的前提，也是某些植物天然產(chǎn)物起關(guān)鍵藥理活性的關(guān)鍵基團。如齊墩果烷型的三萜類物質(zhì)β-香樹脂醇，植物中的氧化酶可以在其28號碳位進行氧化生成抗菌藥物齊墩果酸[3]，也可以在11號位和30號位分別進行羰基化和羧基化，生成具有消炎和保護肝臟作用的甘草次酸[4]，并可以通過后續(xù)的糖基化生成比蔗糖甜度高1000倍的甜味劑單葡萄糖醛酸基甘草次酸和水溶性高于甘草次酸的甘草酸[5]；黃酮類物質(zhì)柚皮素碳骨架不同部位的氧化，可以生成圣草酚、花旗松素等具有不同藥理活性的黃酮類物質(zhì)[6]。此外，一些植物天然產(chǎn)物的氧化，還可以有效降低其細(xì)胞毒性。例如，來自喜樹的具有抗癌活性但具有較高細(xì)胞毒性的生物堿類化合物喜樹堿，在其10位進行羥化后得到10-羥基喜樹堿，在提高抗癌活性的同時成功降低了喜樹堿對細(xì)胞的毒性[7]，成為目前廣泛使用的一種抗癌藥。

植物天然產(chǎn)物的氧化反應(yīng)大多是通過生物體內(nèi)的氧化酶催化進行的。氧化酶的種類豐富多樣，包括黃素依賴的氧化酶、酪氨酸酶、漆酶、P450酶等[8-10]。為實現(xiàn)氧化反應(yīng)的進行，氧化酶大多需要輔基參與，如黃素、金屬離子、血紅素等，這些輔基參與電子、質(zhì)子等物質(zhì)的傳遞。此外，在氧化反應(yīng)發(fā)生過程中需要質(zhì)子與電子供體。參與氧化反應(yīng)的電子來源較為多樣，可來源于輔酶、輔基或底物本身[11]。參與催化氧化的輔因子成本往往較為高昂，而生物體中富含氧化反應(yīng)所需的輔因子，因此目前合成生物學(xué)領(lǐng)域利用氧化酶催化氧化反應(yīng)常以生物體作為依托進行[12]。

合成生物學(xué)為微生物利用氧化酶催化植物天然產(chǎn)物氧化提供了有效方法[13]。將植物天然產(chǎn)物合成途徑包括氧化酶轉(zhuǎn)入微生物體內(nèi)，可實現(xiàn)植物天然產(chǎn)物的合成。由于植物生長較慢需要長時間占用耕地，并且植物天然產(chǎn)物往往結(jié)構(gòu)復(fù)雜，所以相比于傳統(tǒng)獲取植物天然產(chǎn)物的植物提取法和化學(xué)全合成法，微生物酶催化合成植物天然產(chǎn)物具有高效性、高立體選擇性和高區(qū)域選擇性的優(yōu)勢[14]。

由于氧化反應(yīng)對生產(chǎn)植物天然產(chǎn)物的重要性，本文首先將介紹具有代表性的萜類、生物堿、黃酮等植物天然產(chǎn)物的氧化。按照氧化酶中所含輔基的差異，分類介紹催化植物天然產(chǎn)物發(fā)生氧化作用的氧化酶，并介紹不同輔基催化氧化反應(yīng)進行的反應(yīng)機理。此外，本文還將介紹目前在合成生物學(xué)領(lǐng)域氧化酶在萜類、生物堿、黃酮等植物天然產(chǎn)物合成中的應(yīng)用和促進氧化酶高效行使氧化功能的方法。最后，對未來氧化酶在微生物合成植物天然產(chǎn)物領(lǐng)域的前景進行展望。

1植物天然產(chǎn)物形成中的氧化反應(yīng)

按照化學(xué)結(jié)構(gòu)，植物天然產(chǎn)物主要分為萜類、甾體、糖苷、黃酮、生物堿、醌類。本節(jié)著重對萜、黃酮和生物堿類化合物碳骨架的氧化作舉例說明。

1.1萜烯化合物骨架的氧化

萜烯物質(zhì)是目前在生物體中合成途徑較清晰且廣受關(guān)注的一類重要天然化合物。天然的萜烯物質(zhì)主要由甲羥戊酸途徑(MVA)和2-甲基-D-赤蘚醇-4-磷酸途徑(MEP)生成的五碳單元進一步反應(yīng)生成[15-16]。

在萜類物質(zhì)碳骨架的氧化反應(yīng)中，引入的含氧官能團主要有羥基、羰基和羧基等。氧化是生成萜類物質(zhì)的重要反應(yīng)，如單萜物質(zhì)檸檬烯經(jīng)過一步氧化形成薄荷烯醇和香芹醇，進一步將其羥基氧化分別形成薄荷烯酮和香芹酮[17]；在倍半萜物質(zhì)青蒿酸的合成過程中，紫穗槐-4,11-二烯的C-12需經(jīng)過第一步氧化反應(yīng)生成青蒿醇，隨后經(jīng)過第二步氧化反應(yīng)生成青蒿酮，并經(jīng)過最后一步氧化反應(yīng)生成青蒿酸[18]；二萜物質(zhì)松香二烯經(jīng)過生成醇、醛、酸的三步連續(xù)氧化反應(yīng)，最終生成松香酸[19]。

三萜物質(zhì)的碳骨架更加復(fù)雜，按照碳骨架的區(qū)別可將三萜物質(zhì)細(xì)分為齊墩果烷型、烏蘇烷型、羽扇豆烷型等。值得注意的是，這些環(huán)狀三萜都是以角鯊烯為起始物，經(jīng)過角鯊烯環(huán)氧化酶的環(huán)氧化作用形成2,3-環(huán)氧角鯊烯，再被環(huán)化酶環(huán)化而形成，2,3-環(huán)氧角鯊烯中的2,3-環(huán)氧基團最終形成環(huán)狀三萜C-3的羥基。齊墩果烷型三萜的代表性物質(zhì)β-香樹脂醇C-28可依次進行羥基化、醛基化、羧基化，最終形成具有消炎作用的齊墩果酸[3]；除此之外，β-香樹脂醇的C-11經(jīng)歷羥基化、羰基化后生成11-羰基-β-香樹脂醇，隨后在其C-30發(fā)生羥基化、醛基化以及羧基化，最終生成具有保護肝臟作用的甘草次酸[5]；烏蘇烷型的三萜物質(zhì)α-香樹脂醇，在其C-28先后發(fā)生羥基化、醛基化以及羧基化后，生成具有抗癌作用的熊果酸[20]；羽扇豆烷型的三萜物質(zhì)羽扇豆醇，經(jīng)過C-28的三步連續(xù)氧化后生成具有顯著抗癌功效的白樺脂酸[21]。萜類物質(zhì)的氧化不僅提高了萜類物質(zhì)的水溶性使之更容易在生物體中進行代謝和轉(zhuǎn)運，同時也為后續(xù)的糖基化、?；揎椞峁┝藯l件，例如甘草次酸在C-3羥基的基礎(chǔ)上進行糖基化修飾生成單葡萄糖醛酸基甘草次酸、甘草酸[22]等。

具有代表性的萜類物質(zhì)氧化過程如圖1所示。

圖1

圖1具有代表性的萜類物質(zhì)氧化過程

Fig.1Oxidationprocessofrepresentativeterpenes

1.2黃酮類化合物骨架的氧化

黃酮化合物廣泛存在于自然界中，莽草酸途徑是其主要的生物合成途徑[23]。黃酮類物質(zhì)的基本母核是2-苯基色原酮。按照結(jié)構(gòu)來劃分，黃酮類天然產(chǎn)物主要包含黃酮、異黃酮和查爾酮等。目前，生成黃酮和異黃酮類化合物的氧化反應(yīng)報道較多。

2-苯基色原酮母核氧化會產(chǎn)生豐富的黃酮類物質(zhì)。例如，在2-苯基色原酮的5,7,4′位羥化得到芹菜素，繼續(xù)在3′位發(fā)生氧化生成具有抑制癌細(xì)胞增殖作用的木犀草素[24]；或在芹菜素的基礎(chǔ)上在3號碳位繼續(xù)發(fā)生氧化生成具有抗癌、抗癲癇、抗炎作用的山奈酚，進一步在3′位發(fā)生氧化生成低毒性、抗氧化、抗腫瘤的槲皮素[25]；在5,7-二羥基黃酮基礎(chǔ)上，6號碳位進行氧化生成能夠治療心腦血管疾病的黃芩素；以二氫黃酮代表性物質(zhì)柚皮素為骨架，在3,5′進行氧化可生成有清除自由基作用的二氫槲皮素[26]。異黃酮類物質(zhì)，具有抗氧化作用的大豆素，需要在異黃酮母核的7,4′發(fā)生羥基化；若繼續(xù)在大豆素的基礎(chǔ)上進行C-6羥化以及轉(zhuǎn)甲基化，生成能夠改善人體糖、脂代謝的鳶尾素。根皮素需要在異查爾酮母核2′,4′,6′,4位發(fā)生羥基化并還原中央三碳原子的不飽和雙鍵[27]。

黃酮化合物碳骨架氧化引入的羥基也為后續(xù)的糖基化、甲基化等反應(yīng)提供了條件。如在槲皮素的C-3羥基引入葡萄糖基和鼠李糖基可生成具有抗炎、抗氧化、抗過敏、抗病毒等功效的蘆?。辉邙S尾素C-7羥基引入葡萄糖基可獲得水溶性更好、生物利用度更高的鳶尾苷；在根皮素C-6′羥基引入葡萄糖基后獲得能有效治療糖尿病的根皮苷[28]。

具有代表性的黃酮物質(zhì)骨架的氧化如圖2所示。

圖2

圖2具有代表性的黃酮物質(zhì)骨架的氧化

Fig.2Oxidationprocessofrepresentativeflavonoids

1.3生物堿類化合物骨架的氧化

生物堿是一類分布廣泛的天然化合物，現(xiàn)指存在于生物體中的含氮環(huán)狀化合物。此類化合物因普遍含有負(fù)氧化態(tài)的氮原子而往往呈堿性。由于結(jié)構(gòu)的多樣性，生物堿在生物體中具有更加復(fù)雜多樣的合成途徑[29]。

生物堿的氧化賦予其豐富的藥效。例如來自顛茄的托品烷類莨菪堿，在其托品烷的C-6、C-7發(fā)生環(huán)氧化反應(yīng)會形成東莨菪堿；若只在莨菪堿C-7發(fā)生羥基化反應(yīng)則形成山莨菪堿，東莨菪堿和山莨菪堿均可起到胃腸道解痙、抑制唾液分泌、鎮(zhèn)靜和擴瞳的作用；若在阿托品的α碳發(fā)生羥基化則生成樟柳堿，具有抗震顫、解痙、平喘、散瞳、抑制唾液分泌及解毒的功能。喹諾里西啶類生物堿苦參堿，在其N-1發(fā)生氧化形成氧化苦參堿，相比于苦參堿，氧化苦參堿具有更好的抗乙肝病毒的作用。來自藍果樹科植物喜樹的喜樹堿是一種被廣泛用于治療胃腸道癌的喹啉類生物堿，在起到抑癌活性的同時也會引起高度毒性的藥物不良反應(yīng)，在其10號碳位發(fā)生氧化引入羥基可以有效地減輕這種副作用，同時提升其抑癌功效[7]。苯菲啶類生物堿二氫血根堿和二氫白屈菜紅堿，在其氮雜環(huán)氧化脫氫會分別生成血根堿和白屈菜紅堿，均具有抗真菌增殖的功能。

生物堿碳骨架的氧化會為后續(xù)的生物堿修飾提供更多契機。如阿撲嗎啡C-11發(fā)生羥化后進而轉(zhuǎn)移甲基生成木蘭堿；C-9羥化后向C-9羥基轉(zhuǎn)移甲基生成氧化海罌粟堿。

具有代表性的生物堿骨架與其氧化產(chǎn)物如圖3所示。

圖3

圖3具有代表性的生物堿骨架與其氧化產(chǎn)物

Fig.3Oxidationprocessofrepresentativealkaloids

2氧化酶的種類及其催化機理

植物天然產(chǎn)物骨架的氧化，離不開生物體中結(jié)構(gòu)和功能多樣的氧化酶。氧化酶包括黃素依賴的單加氧酶、單胺氧化酶、過氧化物酶、P450酶等種類，因為氧化酶在行使氧化作用的同時涉及氧氣、電子以及質(zhì)子的傳遞，因此往往需要輔酶和輔基等輔因子的參與。同種輔基催化氧化反應(yīng)機理相似，因此本節(jié)按照氧化酶中所含輔基的種類對其進行分類，并對氧化反應(yīng)的催化機理進行闡釋。

2.1輔因子為黃素的氧化酶

輔因子為黃素的黃素依賴型單加氧酶（FMOs）可參與氧化結(jié)構(gòu)復(fù)雜的天然產(chǎn)物[11]，這些反應(yīng)源于其催化中心黃素異咯嗪環(huán)體系多樣的化學(xué)特性[30-31]。除此之外，蛋白質(zhì)在調(diào)節(jié)黃素輔因子的催化潛力方面也起著重要作用，因為游離黃素本身并不能執(zhí)行這些反應(yīng)[32-33]。了解和預(yù)測黃素輔因子活性如何受到蛋白質(zhì)環(huán)境的調(diào)節(jié)仍然是一個熱門的研究話題[32]。

目前已經(jīng)用實驗和計算相結(jié)合的方法研究了FMOs的黃素動力學(xué)、反應(yīng)物種的形成和穩(wěn)定以及FMOs的羥基化機理（圖4）：首先，處于還原狀態(tài)下的黃素被氧氣激活，并將一個電子從還原的黃素轉(zhuǎn)移到氧中，在黃素半醌和超氧陰離子之間形成籠狀自由基對，隨后超氧陰離子與黃素結(jié)合，并伴隨著質(zhì)子的傳遞，形成黃素C4a-(氫)氧加合物[34]；根據(jù)中間體質(zhì)子化狀態(tài)不同，這種過氧基團與底物反應(yīng)使氧-氧鍵斷裂，同時異咯嗪遠端的氧插入底物的C—H鍵，而另一個黃素近端的氧原子被還原為水，有研究表明異咯嗪C-8位被親電取代基取代會加速氧-氧鍵斷裂[35]，且目前已經(jīng)利用羥基鄰位具有高電負(fù)性的對羥基苯甲酸進行了實驗和理論計算，證明底物中若有高電負(fù)性區(qū)域的碳會更容易進攻C4a-(氫)氧加合物（過氧黃素）的氧-氧鍵，從而實現(xiàn)底物中此碳位的羥基化[36-37]；隨后黃素形成氧化狀態(tài)的黃素，需要NADPH等輔因子提供的還原力以及質(zhì)子將氧化態(tài)的黃素還原為還原狀態(tài)下的黃素，催化下一輪氧化反應(yīng)[38]，

圖4

圖4黃素單加氧酶催化氧化機理

Fig.4Mechanismofflavin-dependentmonooxygenasecatalyticoxidation

黃素依賴型單加氧酶基于其結(jié)構(gòu)特征、氨基酸序列、電子供體和氧化反應(yīng)類型進行分類[9]。目前已報道的具有代表性的黃素單加氧酶共有八類[11]，其依賴的輔因子、電子供體以及催化的反應(yīng)各不相同。表1對黃素依賴的單加氧酶分類進行了概述。

表1黃素依賴的單加氧酶主要類別［11］

Table1Mainclassesofflavin-dependentmonooxygenases［11］

種類輔因子電子供體反應(yīng)類型舉例文獻AFADNAD(P)H羥基化反應(yīng)對羥基苯酸3-羥化酶[39]

磺化氧化反應(yīng)MICAL[40]BFADNAD(P)H拜爾-維立格氧化反應(yīng)環(huán)己酮單加氧酶[41]

雜原子氧化反應(yīng)二甲基苯胺單加氧酶[42]

N-羥基化反應(yīng)L-鳥氨酸單加氧酶[43]

氧化脫羧反應(yīng)吲哚-3-丙酮酸單加氧酶[44]CFMNFMNH2光化學(xué)反應(yīng)烷醛單加氧酶[45]

拜爾-維立格氧化反應(yīng)二酮環(huán)烷單加氧酶[46]

環(huán)氧化反應(yīng)二酮環(huán)烷單加氧酶[46]

脫硫反應(yīng),磺化氧化反應(yīng)烷烴磺酸鹽單加氧酶[47]

羥基化反應(yīng)長鏈烷烴單氧酶[48]DFAD/FMNFADH2/FMNH2羥基化反應(yīng)對羥基苯乙酸3-羥化酶[49]

N-羥基化反應(yīng)KijD3糖N-氧化酶[50]EFADFADH2環(huán)氧化反應(yīng)苯乙烯單加氧酶[51]FFADFADH2鹵代反應(yīng)色氨酸7-鹵化酶[52]GFAD底物氧化脫羧反應(yīng)色氨酸2-單加氧酶[53]HFMN底物氧化脫羧反應(yīng)乳酸2-單加氧酶[54]

氧化脫硝反應(yīng)硝酸單加氧酶[55]新窗口打開|下載CSV

作為一種具有代表性的黃素依賴的氧化酶，依賴FAD的單胺氧化酶(MAOs)因具有高選擇性和活性，以及酶促合成所固有的環(huán)境優(yōu)勢，廣受生物催化方面的關(guān)注和報道[56]。MAOs以氧氣分子為氧化劑，將胺氧化脫氫形成亞胺[57]。配合單胺氧化酶的氧化脫氫作用可以利用后續(xù)的化學(xué)反應(yīng)將亞胺進行加成反應(yīng)，形成伯胺的對映異構(gòu)體，也可以利用亞胺進行繼續(xù)脫氫形成叔胺[58]，因此MAOs是可以用于氧化多種不同胺并進行手性胺拆分的高性能生物催化劑。

2.2輔因子為銅離子的氧化酶

一些氧化酶活性中心含金屬離子，這些金屬離子是酶的關(guān)鍵輔因子，對整個催化過程起控制作用，這類酶被稱為金屬酶。在氧化酶中，以銅離子為輔因子的氧化酶較為常見，包括銅藍蛋白、酪氨酸酶、漆酶、抗壞血酸氧化酶等。

隸屬于多銅氧化酶家族的銅藍蛋白是一種以銅離子為輔基的氧化酶。銅藍蛋白在發(fā)揮催化氧化過程中銅離子中心會接受來自底物提供的電子，隨后進一步將電子傳遞給氧分子，使之還原為水或過氧化氫[59]。另外銅藍蛋白對機體內(nèi)的苯二胺還能發(fā)揮胺氧化酶作用[60]。

具有雙核銅離子結(jié)構(gòu)的多亞基氧化酶酪氨酸酶(Tyr)，對酪氨酸等苯酚類化合物具有催化鄰位氧化的功能。酪氨酸酶的雙核銅離子Cu(A)Cu(B)和與兩銅離子配位的六個組氨酸殘基構(gòu)成了酪氨酸酶的活性中心。在酪氨酸催化的整個氧化過程中，銅離子、氧分子、酪氨酸三者會形成多種反應(yīng)中間體與過渡態(tài)(圖5)。這些中間體過渡態(tài)主要被分為氧化態(tài)(Eoxy)、還原態(tài)(Emet)、脫氧態(tài)(Edeoxy)和失活態(tài)(Edeact)四種。

圖5

圖5來自巨型芽孢桿菌的酪氨酸酶及其活性位點組氨酸與銅離子的配位（PDB：3NM8）

Fig.5TyrosinasefromBacillusmegateriumandcoordinationofitsactivesitehistidinewithcopperion（PDB：3NM8）

酪氨酸酶催化苯酚類化合物鄰位氧化的整個循環(huán)過程如圖6所示：首先酚羥基氧負(fù)離子靠近活性中心并與一個銅離子配位，同時酚羥基鄰位碳靠近與銅離子配位的一個氧；與此同時，Cu(A)配位的一個組氨酸咪唑氮接受由酚羥基解離出質(zhì)子[10,61-63]從而使Cu(A)與組氨酸解離；Cu(A)和與其配位的過氧橋一起靠近苯酚的鄰位碳原子，利于苯酚鄰位碳原子進攻過氧橋；隨后活性中心的[O—O]鍵斷裂，靠近苯酚鄰位的氧與高電負(fù)性的苯酚鄰位結(jié)合，使氧與苯酚鄰位成鍵從而形成復(fù)合物E；復(fù)合物E再接受兩個質(zhì)子，與活性中心解離生成鄰苯二酚；鄰苯二酚可以為下一步氧化反應(yīng)提供電子，自身被進一步氧化為鄰苯二醌，與此同時處于還原態(tài)的酪氨酸酶(Met)被還原成脫氧態(tài)的酪氨酸酶(Deoxy)；脫氧態(tài)的酪氨酸酶在接下來的反應(yīng)中可以直接與氧分子結(jié)合，使氧化態(tài)的酪氨酸酶(Oxy)重新生成，催化下一輪的氧化反應(yīng)的進行。目前酪氨酸酶已被用于生物合成多種化合物，其反應(yīng)過程的動力學(xué)也被廣泛研究[64]。

圖6

圖6酪氨酸酶催化酚類物質(zhì)氧化機理[61]

Fig.6Mechanismofphenolicoxidationcatalyzedbytyrosinase[61]

2.3含血紅素的氧化酶

過氧化物酶和P450酶是兩種典型的利用血紅素作為輔基催化氧化反應(yīng)進行的氧化酶。

過氧化物酶可以催化底物的氧化反應(yīng)，同時將電子傳遞給過氧化氫，使之還原為水。過氧化物酶可以通過上述過程清除生物體內(nèi)的過氧化氫以及胺類和酚類化合物，從而減輕它們對細(xì)胞造成的毒性。近年來，過氧化物酶在氧化催化中的應(yīng)用得到了廣泛的綜述[65-67]。

細(xì)胞色素P450酶也是一個含血紅素的蛋白家族，血紅素鐵通過軸向保守的半胱氨酸與蛋白質(zhì)相連[8,68]。P450在天然產(chǎn)物的生物合成途徑、外源物質(zhì)的降解、類固醇激素的生物合成和藥物代謝中發(fā)揮重要作用。P450被認(rèn)為是自然界中用途最廣泛的生物催化劑，參與20多種不同類型的化學(xué)氧化反應(yīng)[69-71]。

P450催化系統(tǒng)主要包含底物、P450酶、起電子傳遞作用的P450還原酶以及提供還原力的輔因子NAD(P)H四個部分[8,72]。這四個部分使P450酶催化氧化反應(yīng)順利進行。以P450催化的羥基化反應(yīng)為例(圖7)，P450中包含靜息狀態(tài)鐵的活性中心首先接受底物，底物取代活性中心的水分子，但底物并不直接與鐵結(jié)合。然后，高自旋狀態(tài)的鐵(FeⅢ)接受來自其氧化還原伴侶的電子被還原為亞鐵(FeⅡ)。隨后，氧氣進入酶的活性位點并與FeⅡ結(jié)合形成[FeⅡO2]配合物。配合物[FeⅡO2]被來自氧化還原伴侶的第二電子還原形成配合物[FeⅢO22-]，它利用溶劑中的質(zhì)子生成過氧鐵配合物[FeⅢ-OOH]，被稱為化合物0。伴隨第二個質(zhì)子進入活性位點，[FeⅢ-OOH]的O—O鍵斷裂，釋放出一個水分子，生成高價卟啉自由基陽離子四價鐵[FeⅣ=O](即化合物Ⅰ)。這種高活性的配合物易從底物中爭奪一個氫原子，形成鐵基羥基化合物[FeⅣ-OH](即化合物Ⅱ)。隨后，伴隨底物自由基與化合物Ⅱ的羥基反應(yīng)生成羥基化產(chǎn)物(R-OH)，鐵也由化合物Ⅰ中的四價被還原為三價。最后，一分子水返回活性位點與FeⅢ配位并將底物置換，使FeⅢ恢復(fù)靜息狀態(tài)。當(dāng)?shù)孜锓肿釉俅芜M入P450活性口袋并將水分子置換，使FeⅢ變?yōu)楦咦孕隣顟B(tài)時，相同的催化循環(huán)被再一次啟動。值得注意的是，一些P450能夠直接利用H2O2作為電子供體，直接使高自旋狀態(tài)的FeⅢ形成化合物0，并利用過氧化物分流途徑行使催化功能(圖7，虛線箭頭)。然而，除了P450過氧化物酶(如CYP152亞家族)[73]外，大多數(shù)P450的低效和低H2O2耐受性極大地限制了這種分流途徑的應(yīng)用。

圖7

圖7P450羥化機理

Fig.7HydroxylationmechanismofP450

值得一提的是，P450催化循環(huán)的維持依賴于氧化還原伴侶向血紅素鐵的持續(xù)電子傳遞，這是個復(fù)雜的電子傳遞系統(tǒng)。根據(jù)氧化還原伴侶的類型和P450與氧化還原伴侶的相互作用關(guān)系，P450氧化還原系統(tǒng)可以分為五個主要類別[74-76]（圖8）。大多數(shù)細(xì)菌和線粒體P450中存在的第Ⅰ類P450系統(tǒng)具有一個雙組分的氧化還原伴侶系統(tǒng)，這種系統(tǒng)由一個含F(xiàn)AD的鐵氧還蛋白還原酶(FDR)和一個含鐵硫的鐵還蛋白(FDX)[77]組成。真核生物使用的Ⅱ類P450系統(tǒng)有一個單組分的氧化還原伴侶，這種氧化還原伴侶是一種膜結(jié)合蛋白，其含有的FAD和FMN將來自NADPH的電子傳遞給血紅素，被稱為細(xì)胞色素P450還原酶(CPR)。Ⅲ類P450系統(tǒng)有一個真核細(xì)胞樣的CPR，并通過一個柔性連接子融合在P450血紅素結(jié)構(gòu)域的C末端。Ⅳ類P450系統(tǒng)以FMN/Fe2S2還原酶結(jié)構(gòu)域為電子供體，F(xiàn)MN/Fe2S2還原酶結(jié)構(gòu)域與P450結(jié)構(gòu)域通過連接子連接。除此之外，一些P450可以直接與它們的電子供體相互作用，并且不依賴于額外的氧化還原伙伴蛋白來完成催化反應(yīng)，被劃分為第Ⅴ類P450。Ⅲ~Ⅴ類P450不依賴于氧化還原伴侶蛋白，通常被稱為自給自足的P450。

圖8

圖8五個主要類別的P450氧化還原系統(tǒng)[76]

Fig.8FivemaincategoriesofP450REDOXsystems[76]

3微生物制造植物天然產(chǎn)物的氧化過程

氧化酶在天然產(chǎn)物合成過程中起著至關(guān)重要的作用。且酶催化反應(yīng)的高效性、高立體選擇性和區(qū)域選擇性賦予了酶高效合成手性藥物的能力[78]，因此利用氧化酶催化合成天然產(chǎn)物有著植物提取、化學(xué)全合成無法替代的優(yōu)勢。

3.1萜類化合物合成過程中的氧化酶

近些年，植物中的氧化酶，尤其是P450酶催化的萜烯氧化反應(yīng)廣為報道。例如，CYP71AV9可以將倍半萜類物質(zhì)吉瑪烯A氧化為吉瑪烯酸，吉瑪烯酸進一步被CYP71BL5氧化為6-羥基吉瑪烯酸，作為洋薊內(nèi)酯生物合成途徑的前體物質(zhì)，為洋薊內(nèi)酯的生物合成奠定基礎(chǔ)[79]；在紫蘇中挖掘的CYP76AJ1在酵母細(xì)胞中被證實具有氧化補身醇形成水蓼二醛的功能，為其生物合成提供借鑒[80]；CYP701A26被鑒定為能夠氧化二萜化合物ent-貝殼杉烯生成赤霉素前體物質(zhì)ent-貝殼杉烯酸的P450酶，是赤霉素生物合成過程中的重要一步[81]；CYP716家族的P450氧化酶絕大多數(shù)具有氧化各類三萜化合物C-28的作用[82]，例如CYP716A179可以專一地氧化各種三萜化合物的C-28位：將羽扇豆醇28號碳位氧化為羧酸生成具有顯著抗腫瘤活性的樺木酸[83]，將β-香樹脂醇28號碳位氧化為羧酸生成對急性肝損傷有明顯保護作用的齊墩果酸[84]，將α-香樹脂醇的28號碳位氧化為羧酸生成具有對革蘭陽性菌、革蘭陰性菌以及酵母菌有明顯抑制作用的熊果酸[85]，同樣CYP716A44和CYP716A46也具有相同的功能[86]。CYP716家族的另一種P450氧化酶CYP716A175還能氧化日耳曼醇的28號碳位形成羧酸，生成模繞酸[87]。CYP716家族的CYP716A141除了能氧化β-香樹脂醇的C-28，也能氧化其C-16,在其對應(yīng)位置生成羥基，合成馬尼拉二醇[88]。除此之外，CYP716A1、CYP716A2也具有相似的氧化功能[89]。來自番茄的CYP716E26可以特異性氧化β-香樹脂醇C-6生成曼陀羅萜二醇[86]。CYP716C49可以氧化齊墩果酸的C-2，生成山楂酸，氧化熊果酸C-2生成科羅索酸，氧化樺木酸C-2生成麥珠子酸[90]。CYP714家族的CYP714E19可以氧化齊墩果酸的C-23生成絲石竹酸；同時也可以氧化烏蘇烷型的五環(huán)三萜C-23生成相應(yīng)的羧酸[91]。CYP87家族的P450氧化酶CYP87D18可以專一性氧化葫蘆二烯醇的11號碳位，在對應(yīng)位置生成羥基，隨后繼續(xù)催化羥基氧化為羰基[92]。來自甘草的CYP88D6，可以催化β-香樹脂醇C-11氧化生成甘草次酸的前體物質(zhì)11-羰基-β-香樹脂醇[93]。來自苜蓿的CYP72A68和CYP72A67分別連續(xù)地對齊墩果酸的C-2、C-23進行氧化，分別生成常春藤素和貝萼皂苷元，隨后CYP72A68還可以繼續(xù)對常春藤素C-23進行連續(xù)氧化，生成棉根皂苷元和絲石竹酸[94]。來自苜蓿的CYP72A63和來自甘草的CYP72A154，可以氧化β-香樹脂醇和11-羰基-β-香樹脂醇的C-30，分別生成11-脫氧甘草次酸和甘草次酸[4]。

3.2生物堿合成過程中的氧化酶

生物堿的合成途徑的復(fù)雜多樣造成了生物堿碳骨架的多樣化，與此同時生物堿的氧化修飾也隨之變得更加豐富，參與生物堿氧化反應(yīng)的氧化酶種類也更繁多，其氧化反應(yīng)類型也更加多樣。

Hagel等[95]鑒定了黃素蛋白氧化酶DBOX和TPOX，分別能催化二氫血根堿和四氫罌粟堿氧化脫氫，生成血根堿和罌粟堿；Ghislieri等[96]利用來自黑曲霉的單胺氧化酶突變體（MAO-N）催化的去消旋反應(yīng)，催化(±)-毒芹堿生成(R)-毒芹堿，也可利用突變體催化(±)-胡禿子堿和(±)-細(xì)茜花堿分別去消旋化形成(R)-胡禿子堿和(R)-細(xì)茜花堿，同樣他們也發(fā)現(xiàn)這種單胺氧化酶的突變體能夠催化四氫-β-咔啉環(huán)系的去消旋化，得到去消旋化的四氫-β-咔啉環(huán)[97]，是帶有四氫-β-咔啉環(huán)生物堿微生物合成的關(guān)鍵一步；Xu等[98]發(fā)現(xiàn)FMN依賴的氧化酶PhzG能夠催化吩嗪類化合物碳骨架的氧化脫氫；Meng等[99]鑒定了來自鏈霉菌S.sapporonensis的6種氧化酶的功能，其中5種是依賴于酮戊二酸/Fe2+的雙加氧酶（BcmB、BcmC、BcmE、BcmF、BcmG），另一種是細(xì)胞色素P450單加氧酶（BcmD），這六種氧化酶通過羥基化、氧化脫氫、環(huán)氧化，將環(huán)磷酰胺最終氧化為雙環(huán)霉素；Ju等[100]在茄病鐮刀菌Fusariumsolani中鑒定了一種D-氨基酸氧化酶FsDAAO，該氧化還原酶可高度特異地將四氫異喹啉類化合物去消旋化，催化其氧化脫氫并進而反應(yīng)生成(S)-四氫異喹啉類化合物；Couturier等[101]發(fā)現(xiàn)契珠哈氏菌Hahellachejuensis中的黃素依賴氧化酶PigB和HapB，經(jīng)鑒定這兩種酶可催化2-甲基-3-戊基二氫吡咯生成2-甲基-3-戊基吡咯，作為靈菌紅素的重要前體物質(zhì)，這兩種氧化酶的發(fā)現(xiàn)對靈菌紅素的生物合成具有借鑒意義。

3.3黃酮化合物合成過程中的氧化酶

目前，因氧化是植物類黃酮生物合成的重要步驟，黃酮類天然產(chǎn)物氧化酶的挖掘也成為了熱門話題[102]。黃酮合成過程中的第一個羥基化反應(yīng)由P450酶C4H催化，在C-4位引入一個羥基從肉桂酸到A環(huán)，形成對香豆酸[103]。目前，多種黃酮氧化酶的功能已經(jīng)被解析。催化黃酮骨架氧化的酶主要是P450酶，如大豆苷元分別在氧化酶nfa12130和nfa33880的氧化作用下，可以分別在苷元A環(huán)的C-6、C-8位進行氧化生成相應(yīng)的羥基[104]；大豆苷元也可以在P450酶CYP107H1的氧化作用下，在其B環(huán)的C-3′形成羥基[105]；P450酶SAV2377、SAV5841、SAV4539對染料木素、白楊素、芹黃素中B環(huán)具有較好的氧化活性[106]。

3.4其他天然產(chǎn)物合成過程中的氧化酶

近些年，醌、糖苷和甾體類天然產(chǎn)物合成途徑的氧化酶也有報道。

Ehrlich等[107]在黃曲霉素合成基因簇中發(fā)現(xiàn)了一個氧化酶HypC，催化降散盤衣酸蒽酮C-10氧化為降散盤衣酸；Throckmorton等[108]驗證了煙曲霉中的氧化酶TpcL，催化大黃素蒽酮C-10氧化為大黃素；Marzorati等[109]利用來自毛栓菌Trametespubescens的漆酶氧化葡萄糖及其衍生物生成葡萄糖醛酸，Baratto等[110]利用同樣的漆酶將硫代秋水仙堿苷、苦杏仁苷、積雪草皂苷和人參皂苷的葡萄糖苷氧化為葡萄糖醛酸；Ncanana等[111]也利用來自Trametespubescens的漆酶氧化桃柘酚的酚羥基形成自由基中間體，進一步反應(yīng)生成二聚桃柘酚；甾體的合成往往也需要氧化酶參與催化氧化脫羧[112]，也需要P450氧化酶對其骨架進行氧化，如Kiss等[113]報道來自巨大芽孢桿菌Bacillusmegaterium的CYP106A1可催化強的松醇的C-11羥基和C-15，生成15β-羥基強的松，也可以催化地塞米松C-11的羥基氧化，生成11-羰基地塞米松。

表2列舉了部分天然產(chǎn)物氧化物催化實例。

表2天然產(chǎn)物氧化酶催化舉例

Table2Examplesofnaturalproductoxidasecatalysis

氧化酶來源種類反應(yīng)底物反應(yīng)產(chǎn)物文獻CYP71AV9CynaracardunculusP450吉瑪烯A吉瑪烯酸[79]CYP71BL5CynaracardunculusP450吉瑪烯酸6-羥基吉瑪烯酸[79]CYP76AJ1PersicariahydropiperP450補身醇水蓼二醛[80]CYP701A26ZeamaysP450ent-貝殼杉烯ent-貝殼杉烯酸[81]CYP716A179GlycyrrhizauralensisP450羽扇豆醇樺木酸[83]

β-香樹脂醇齊墩果酸[84]

α-香樹脂醇熊果酸[85]CYP716A175MaluspumilaP450日耳曼醇模繞酸[87]CYP716A141PlatycodongrandiflorusP450β-香樹脂醇馬尼拉二醇[88]CYP716E26SolanumlycopersicumP450β-香樹脂醇曼陀羅萜二醇[86]CYP716C49CrataeguspinnatifidaP450齊墩果酸山楂酸[90]

熊果酸科羅索酸[90]

樺木酸麥珠子酸[90]CYP714E19CentellaasiaticaP450齊墩果酸絲石竹酸[91]CYP72A68MedicagotruncatulaP450齊墩果酸常春藤素[94]CYP72A67MedicagotruncatulaP450常春藤素貝萼皂苷元[94]DBOXPapaversomniferum黃素依賴型氧化酶二氫血根堿血根堿[95]TPOXPapaversomniferum黃素依賴型氧化酶四氫罌粟堿罌粟堿[95]MAO-N

黃素依賴型氧化酶(±)-毒芹堿(R)-毒芹堿[96]

(±)-胡禿子堿(R)-胡禿子堿[96]

(±)-細(xì)茜花堿(R)-細(xì)茜花堿[96]FsDAAOAspergillusniger黃素依賴型氧化酶四氫異喹啉(S)-四氫異喹啉[100]HypCAspergillusnidulans蒽酮氧化酶降散盤衣酸蒽酮降散盤衣酸[107]TpcLAspergillusfumigatus蒽酮氧化酶大黃素蒽酮大黃素[108]Trametespubescens漆酶Trametespubescens漆酶葡萄糖葡萄糖醛酸[109]

桃柘酚二聚桃柘酚[111]CYP106A1BacillusmegateriumP450強的松醇15β-羥基強的松[113]

地塞米松11-羰基地塞米松[113]新窗口打開|下載CSV

4微生物細(xì)胞工廠中氧化過程的調(diào)控

在天然產(chǎn)物合成中，氧化反應(yīng)的進行往往會受到一些因素的制約。例如：氧化還原反應(yīng)伴隨的輔因子消耗、氧化酶在行使催化作用時電子等物質(zhì)的傳遞耦合性低和傳遞效率低等，使氧化酶經(jīng)常成為級聯(lián)反應(yīng)中制約物質(zhì)轉(zhuǎn)化效率的限速酶，這也是目前微生物合成天然產(chǎn)物面臨的瓶頸問題。如何解決這一瓶頸問題，是實現(xiàn)氧化酶高效催化天然產(chǎn)物氧化的關(guān)鍵。微生物制造天然產(chǎn)物的氧化過程調(diào)控方法主要可分為酶工程、代謝工程和底物工程等。

通過代謝工程以及酶工程提高氧化酶在生物體內(nèi)的活性的方法是目前合成生物學(xué)中的研究熱點（圖9）。挖掘活性更高的同工酶、氧化還原伴侶適配、增強輔因子的供應(yīng)、酶的定點突變、定向進化等是目前較為常用且有效的策略[114]。

圖9

圖9氧化酶氧化過程調(diào)控的主要方法

Fig.9Mainmethodsforregulatingtheoxidationprocessofoxidase

作為典型的氧化酶，P450酶的電子傳遞是它的瓶頸問題。研究表明，P450與CPR的有效適配能夠增強電子傳遞，進而增強其氧化效率。由于烏拉爾甘草根部積累大量甘草次酸，而葉片幾乎沒有甘草次酸積累，因此Zhu等[115]通過分析烏拉爾甘草轉(zhuǎn)錄組中甘草根與葉片的轉(zhuǎn)錄組差異，挖掘到一個P450氧化還原伴侶GuCPR1，酵母細(xì)胞體內(nèi)驗證發(fā)現(xiàn)GuCPR1可與CYP88D6和CYP72A63高度適配，使甘草次酸在釀酒酵母內(nèi)的產(chǎn)量達到(18.9±2.0)mg/L，適配效果遠遠強于來自苜蓿和擬南芥的CPR；Kim等[116]利用釀酒酵母異源表達原人參二醇的合成途徑，研究P450酶與CPR的適配，在表達來自人參的P45