環(huán)磷酰胺對斷奶仔豬免疫功能的影響

環(huán)磷酰胺對斷奶仔豬免疫功能的影響

在豬的生產(chǎn)中，由于神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育不完善、斷奶適應(yīng)和大量接觸致病性微生物，祖母仔豬容易受到選擇性免疫抑制（袁書林，2006），這降低了生長性能，增加了疾病的易感和死亡率。目前,環(huán)磷酰胺(CY)是各種免疫抑制藥物中作用最強、應(yīng)用最廣泛的藥物之一。大量動物試驗證明,CY可抑制機體免疫功能(He等,2007;趙戈清等,2005;ElAbasy等,2004)。但是,由于CY的藥理功效復(fù)雜,對不同動物的毒作用劑量、毒作用點和毒作用程度均不同,且在豬上的模型較少,本試驗用CY構(gòu)造仔豬免疫抑制模型,從細胞免疫、體液免疫、細胞因子釋放等方面觀察了仔豬免疫功能的變化,旨在為仔豬免疫增強劑的研究和開發(fā)提供基礎(chǔ)。1材料和方法1.1培養(yǎng)基和試劑CY為蘇州尤利特生物醫(yī)藥科技有限公司產(chǎn)品,純度≥99.3%;辣根過氧化物酶標記兔抗豬IgG、刀豆蛋白A(ConA)、四甲基偶氮唑鹽(MTT)、植物血凝素(PHA)、卵清蛋白(O-VA)均為Sigma產(chǎn)品;RPMI-1640培養(yǎng)基為Hyclone產(chǎn)品;淋巴細胞分層液為中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所產(chǎn)品;胎牛血清為杭州四季青生物工程材料有限公司產(chǎn)品;牛血清白蛋白(BSA)為Roche產(chǎn)品;四甲基聯(lián)苯胺(TMB)為北京博奧森生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。1.2cy和bsa的注射選用12頭(28±3)d的杜×長×大斷奶仔豬,預(yù)試1周,按完全隨機區(qū)組設(shè)計將其分為對照組和CY組,每個處理6個重復(fù),每個重復(fù)1頭豬。試驗期14d。第1天和第7天,給CY組仔豬注射50mg/kgBW的CY,對照組仔豬注射等量的生理鹽水。另外,第1天所有仔豬從耳后肌肉注射BSA(終濃度1mg/kgBW)。參照NRC(1998)斷奶仔豬的營養(yǎng)需要配制基礎(chǔ)日糧,日糧組成及營養(yǎng)水平見表1。1.3血清bsa抗體、igg及細胞因子檢測于試驗的第7天和第14天,從仔豬的前腔靜脈采血:用非抗凝真空管采血,3500r/min離心10min后,分離血清,測定血清BSA抗體、IgG及細胞因子含量;用EDTAK3抗凝采血管采血1mL用于白細胞分類計數(shù);用肝素抗凝真空管采血7mL,測定外周血淋巴細胞轉(zhuǎn)化率。1.4指標和方法的測量1.4.1分類計數(shù)和測定血液白細胞含量及其分類計數(shù)采用日本SysmexK4500血液自動分析儀測定。1.4.2細胞免疫測定通過測定遲發(fā)型超敏反應(yīng)和外周血淋巴細胞轉(zhuǎn)化率來反映仔豬細胞免疫功能。1.4.2.細胞培養(yǎng)和mtt從仔豬前腔靜脈用肝素抗凝真空管采血7mL。取10mL離心管加淋巴細胞分層液4mL,然后沿管壁緩緩疊加血3mL,2500r/min離心30min,取中間白細胞部分,用3～5倍體積無Ca2+、Mg2+Hank’s液洗3次,每次2000r/min離心10min。然后將細胞懸浮于RPMI-1640完全培養(yǎng)液,用臺盼藍染色計數(shù)活細胞數(shù)(>95%),調(diào)整細胞濃度為2×106個/mL。然后將淋巴細胞懸液加入96孔細胞培養(yǎng)板中,加入ConA(終濃度為8μg/mL);另一組加入等體積的培養(yǎng)液為對照,培養(yǎng)體系為每孔200μL。置5%CO2、37℃培養(yǎng)72h。在培養(yǎng)結(jié)束前6h,每孔加入10mLMTT(初始濃度為5mg/mL),繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)束后,每孔加入100μL10%SDS-0.04mol/LHCl溶液,繼續(xù)培養(yǎng)2h,使紫色結(jié)晶完全溶解,用酶聯(lián)免疫檢測儀在570nm下測定OD值。1.4.2.雙側(cè)注射部位皮褶厚度的測定參照Kornegy等(1989)的方法,在仔豬左腿內(nèi)側(cè)距最后乳頭5cm及距腹中線5cm處皮下注射0.1mLPHA(150μg0.1mL),右側(cè)對稱部位注射等量的生理鹽水,24h后用游標卡尺測定雙側(cè)注射部位皮褶厚度的變化。1.4.3抗豬igg的制備通過測定血清免疫球蛋白G(IgG)和BSA抗體水平來反映仔豬體液免疫功能。IgG水平用免疫比濁法測定,嚴格按照試劑盒(北京華英生物技術(shù)研究所產(chǎn)品)說明書進行。BSA抗體水平用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定的操作程序進行:BSA抗原用碳酸鹽緩沖液(pH9.6)稀釋至10μg/mL,包被酶標板,每孔100μL,4℃過夜,洗滌液(0.01mol/LpH7.2的磷酸鹽緩沖液中加0.05%吐溫20)洗板3次,然后每孔加封閉液(PBS中加0.03%OVA)200μL,37℃封閉2h。洗板3次后,將稀釋好的血清(180)加入酶標板中,每孔100μL,每個樣品3個重復(fù),另取陰性血清稀釋后作負對照,37℃溫育1h。洗板3次,加入1∶5000稀釋的辣根過氧化物酶標記兔抗豬IgG,每孔100μL室溫下反應(yīng)1h。洗板3次后,每孔加入100μL新配制的TMB底物顯色液,室溫下反應(yīng)15min。顯色反應(yīng)結(jié)束時,每孔中加入50μL2mol/L硫酸終止反應(yīng),用酶標儀在450nm處測定OD值。1.4.4測定條件:系統(tǒng)表1.干擾素-γ(IFN-γ)采用豬的ELISA試劑盒(R&DSystemsInc.)方法測定;白細胞介素2(IL-2)采用豬的ELISA試劑盒方法(UscnlifeScienceandTechnologyCo.)測定。1.5數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行t-檢驗分析CY組和對照組之間的差異,P<0.05表示差異顯著,P<0.10表示具有顯著性趨勢。2結(jié)果與分析2.1降低嗜中性細胞數(shù)量的單核細胞數(shù)量的趨勢由表2可知,CY顯著降低第14天斷奶仔豬的白細胞、淋巴細胞、中性粒細胞數(shù)量(P<0.05),并且具有降低第7天嗜中性粒細胞和第14天單核細胞數(shù)量的趨勢(P<0.10)。2.2細胞免疫由表3可知,CY對ConA誘導(dǎo)的淋巴細胞轉(zhuǎn)化率和PHA刺激的皮褶厚度無顯著影響。2.3體免疫由表4可知,CY對IgG和第7天斷奶仔豬的BSA抗體水平無影響,但顯著降低了第14天BSA抗體水平(P<0.05)。2.4細胞因子由表5可知,CY對IL-2及第14天的IFN-γ水平無影響,但顯著降低第7天的IFN-γ水平(P<0.05)。3cdy和bsa對免疫功能的影響CY是一種烷化劑,臨床上主要用于治療腫瘤自身免疫性疾病和器官移植等,其在體外無活性,進入體內(nèi),可在肝微粒體酶的作用下,分解出烷化作用很強的氯乙基磷酞胺,并與細胞內(nèi)DNA交練結(jié)合,通過與DNA雙鏈交叉連接破壞DNA,從而破壞免疫活性細胞,抑制細胞的增殖,具有較強的免疫抑制作用。因此,研究上常用大劑量的CY來構(gòu)建動物免疫抑制模型(許愛華等,2008;董曉芳等,2007;He等,2007)。當機體發(fā)生炎癥或其他疾病時都可引起白細胞總數(shù)及各種白細胞的百分比發(fā)生變化。因此,白細胞分類計數(shù)是反映豬的免疫狀況的常用指標之一(Tan等,2009)。本試驗中,CY可降低第7天的中性粒細胞數(shù)及第14天的白細胞、淋巴細胞、中性粒細胞和單核細胞數(shù),表明仔豬的免疫功能受到一定程度的抑制。這與孫月平等(1999)、王盛民等(2006)、張炳華和劉新軍(2008)的研究結(jié)果類似。本試驗中,從遲發(fā)型超敏反應(yīng)和淋巴細胞轉(zhuǎn)化率這兩個指標可以看出,CY對細胞免疫功能無顯著影響,這與袁書林(2006)、Hou等(2007)和陳慶(2008)的結(jié)果不一致。這可能與試驗設(shè)計、試驗動物種類和健康狀況、試驗動物自身細胞免疫功能水平、CY的注射劑量及注射方式等不同有關(guān)。BSA為一種異源蛋白抗原,具有胸腺依賴性,其抗體產(chǎn)生需要Th細胞的協(xié)助。免疫前仔豬血清中BSA抗體水平應(yīng)為零,在經(jīng)過抗原BSA刺激后,機體的免疫系統(tǒng)被激活,更多的蛋白質(zhì)用于抗體的合成,抗體水平升高。本試驗中,CY顯著降低了第14天BSA抗體水平,這與He等(2007)的結(jié)果一致,表明CY抑制了仔豬的體液免疫功能。根據(jù)細胞因子產(chǎn)生的不同,CD4+的Th細胞可分為Th1和Th2亞群。Th1分泌IL-2、IFN-γ等細胞因子,提升機體免疫效應(yīng);Th2分泌IL-4、IL-10等細胞因子,參與免疫抑制或免疫耐受(Raymond和Wilkie,2004)。在體內(nèi),Th1和Th2以及相應(yīng)的細胞因子含量的變化往往意味著機體免疫狀態(tài)的變化,Th1及IL-2、IFN-γ等細胞因子的增加意味著機體免疫上調(diào),Th2及IL-4、IL-10等因子的增加往往意味著免疫耐受或免疫下調(diào)(Ichiyama等,2006)。本試驗發(fā)現(xiàn),CY可降低第7天的IFN-γ水平,這與何榮(2005)與彭廣華(2007)的報道一致。該結(jié)果提示:CY可抑制仔豬體內(nèi)同源淋巴細胞活化,誘導(dǎo)分泌IFN-γ等細