環(huán)磷酰胺對(duì)斷奶仔豬免疫功能的影響

環(huán)磷酰胺對(duì)斷奶仔豬免疫功能的影響

在豬的生產(chǎn)中，由于神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育不完善、斷奶適應(yīng)和大量接觸致病性微生物，祖母仔豬容易受到選擇性免疫抑制（袁書(shū)林，2006），這降低了生長(zhǎng)性能，增加了疾病的易感和死亡率。目前,環(huán)磷酰胺(CY)是各種免疫抑制藥物中作用最強(qiáng)、應(yīng)用最廣泛的藥物之一。大量動(dòng)物試驗(yàn)證明,CY可抑制機(jī)體免疫功能(He等,2007;趙戈清等,2005;ElAbasy等,2004)。但是,由于CY的藥理功效復(fù)雜,對(duì)不同動(dòng)物的毒作用劑量、毒作用點(diǎn)和毒作用程度均不同,且在豬上的模型較少,本試驗(yàn)用CY構(gòu)造仔豬免疫抑制模型,從細(xì)胞免疫、體液免疫、細(xì)胞因子釋放等方面觀察了仔豬免疫功能的變化,旨在為仔豬免疫增強(qiáng)劑的研究和開(kāi)發(fā)提供基礎(chǔ)。1材料和方法1.1培養(yǎng)基和試劑CY為蘇州尤利特生物醫(yī)藥科技有限公司產(chǎn)品,純度≥99.3%;辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記兔抗豬IgG、刀豆蛋白A(ConA)、四甲基偶氮唑鹽(MTT)、植物血凝素(PHA)、卵清蛋白(O-VA)均為Sigma產(chǎn)品;RPMI-1640培養(yǎng)基為Hyclone產(chǎn)品;淋巴細(xì)胞分層液為中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所產(chǎn)品;胎牛血清為杭州四季青生物工程材料有限公司產(chǎn)品;牛血清白蛋白(BSA)為Roche產(chǎn)品;四甲基聯(lián)苯胺(TMB)為北京博奧森生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。1.2cy和bsa的注射選用12頭(28±3)d的杜×長(zhǎng)×大斷奶仔豬,預(yù)試1周,按完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)將其分為對(duì)照組和CY組,每個(gè)處理6個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)1頭豬。試驗(yàn)期14d。第1天和第7天,給CY組仔豬注射50mg/kgBW的CY,對(duì)照組仔豬注射等量的生理鹽水。另外,第1天所有仔豬從耳后肌肉注射BSA(終濃度1mg/kgBW)。參照NRC(1998)斷奶仔豬的營(yíng)養(yǎng)需要配制基礎(chǔ)日糧,日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。1.3血清bsa抗體、igg及細(xì)胞因子檢測(cè)于試驗(yàn)的第7天和第14天,從仔豬的前腔靜脈采血:用非抗凝真空管采血,3500r/min離心10min后,分離血清,測(cè)定血清BSA抗體、IgG及細(xì)胞因子含量;用EDTAK3抗凝采血管采血1mL用于白細(xì)胞分類(lèi)計(jì)數(shù);用肝素抗凝真空管采血7mL,測(cè)定外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率。1.4指標(biāo)和方法的測(cè)量1.4.1分類(lèi)計(jì)數(shù)和測(cè)定血液白細(xì)胞含量及其分類(lèi)計(jì)數(shù)采用日本SysmexK4500血液自動(dòng)分析儀測(cè)定。1.4.2細(xì)胞免疫測(cè)定通過(guò)測(cè)定遲發(fā)型超敏反應(yīng)和外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率來(lái)反映仔豬細(xì)胞免疫功能。1.4.2.細(xì)胞培養(yǎng)和mtt從仔豬前腔靜脈用肝素抗凝真空管采血7mL。取10mL離心管加淋巴細(xì)胞分層液4mL,然后沿管壁緩緩疊加血3mL,2500r/min離心30min,取中間白細(xì)胞部分,用3～5倍體積無(wú)Ca2+、Mg2+Hank’s液洗3次,每次2000r/min離心10min。然后將細(xì)胞懸浮于RPMI-1640完全培養(yǎng)液,用臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)(>95%),調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106個(gè)/mL。然后將淋巴細(xì)胞懸液加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,加入ConA(終濃度為8μg/mL);另一組加入等體積的培養(yǎng)液為對(duì)照,培養(yǎng)體系為每孔200μL。置5%CO2、37℃培養(yǎng)72h。在培養(yǎng)結(jié)束前6h,每孔加入10mLMTT(初始濃度為5mg/mL),繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)束后,每孔加入100μL10%SDS-0.04mol/LHCl溶液,繼續(xù)培養(yǎng)2h,使紫色結(jié)晶完全溶解,用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在570nm下測(cè)定OD值。1.4.2.雙側(cè)注射部位皮褶厚度的測(cè)定參照Kornegy等(1989)的方法,在仔豬左腿內(nèi)側(cè)距最后乳頭5cm及距腹中線5cm處皮下注射0.1mLPHA(150μg0.1mL),右側(cè)對(duì)稱(chēng)部位注射等量的生理鹽水,24h后用游標(biāo)卡尺測(cè)定雙側(cè)注射部位皮褶厚度的變化。1.4.3抗豬igg的制備通過(guò)測(cè)定血清免疫球蛋白G(IgG)和BSA抗體水平來(lái)反映仔豬體液免疫功能。IgG水平用免疫比濁法測(cè)定,嚴(yán)格按照試劑盒(北京華英生物技術(shù)研究所產(chǎn)品)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。BSA抗體水平用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定的操作程序進(jìn)行:BSA抗原用碳酸鹽緩沖液(pH9.6)稀釋至10μg/mL,包被酶標(biāo)板,每孔100μL,4℃過(guò)夜,洗滌液(0.01mol/LpH7.2的磷酸鹽緩沖液中加0.05%吐溫20)洗板3次,然后每孔加封閉液(PBS中加0.03%OVA)200μL,37℃封閉2h。洗板3次后,將稀釋好的血清(180)加入酶標(biāo)板中,每孔100μL,每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù),另取陰性血清稀釋后作負(fù)對(duì)照,37℃溫育1h。洗板3次,加入1∶5000稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記兔抗豬IgG,每孔100μL室溫下反應(yīng)1h。洗板3次后,每孔加入100μL新配制的TMB底物顯色液,室溫下反應(yīng)15min。顯色反應(yīng)結(jié)束時(shí),每孔中加入50μL2mol/L硫酸終止反應(yīng),用酶標(biāo)儀在450nm處測(cè)定OD值。1.4.4測(cè)定條件:系統(tǒng)表1.干擾素-γ(IFN-γ)采用豬的ELISA試劑盒(R&DSystemsInc.)方法測(cè)定;白細(xì)胞介素2(IL-2)采用豬的ELISA試劑盒方法(UscnlifeScienceandTechnologyCo.)測(cè)定。1.5數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t-檢驗(yàn)分析CY組和對(duì)照組之間的差異,P<0.05表示差異顯著,P<0.10表示具有顯著性趨勢(shì)。2結(jié)果與分析2.1降低嗜中性細(xì)胞數(shù)量的單核細(xì)胞數(shù)量的趨勢(shì)由表2可知,CY顯著降低第14天斷奶仔豬的白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞數(shù)量(P<0.05),并且具有降低第7天嗜中性粒細(xì)胞和第14天單核細(xì)胞數(shù)量的趨勢(shì)(P<0.10)。2.2細(xì)胞免疫由表3可知,CY對(duì)ConA誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率和PHA刺激的皮褶厚度無(wú)顯著影響。2.3體免疫由表4可知,CY對(duì)IgG和第7天斷奶仔豬的BSA抗體水平無(wú)影響,但顯著降低了第14天BSA抗體水平(P<0.05)。2.4細(xì)胞因子由表5可知,CY對(duì)IL-2及第14天的IFN-γ水平無(wú)影響,但顯著降低第7天的IFN-γ水平(P<0.05)。3cdy和bsa對(duì)免疫功能的影響CY是一種烷化劑,臨床上主要用于治療腫瘤自身免疫性疾病和器官移植等,其在體外無(wú)活性,進(jìn)入體內(nèi),可在肝微粒體酶的作用下,分解出烷化作用很強(qiáng)的氯乙基磷酞胺,并與細(xì)胞內(nèi)DNA交練結(jié)合,通過(guò)與DNA雙鏈交叉連接破壞DNA,從而破壞免疫活性細(xì)胞,抑制細(xì)胞的增殖,具有較強(qiáng)的免疫抑制作用。因此,研究上常用大劑量的CY來(lái)構(gòu)建動(dòng)物免疫抑制模型(許愛(ài)華等,2008;董曉芳等,2007;He等,2007)。當(dāng)機(jī)體發(fā)生炎癥或其他疾病時(shí)都可引起白細(xì)胞總數(shù)及各種白細(xì)胞的百分比發(fā)生變化。因此,白細(xì)胞分類(lèi)計(jì)數(shù)是反映豬的免疫狀況的常用指標(biāo)之一(Tan等,2009)。本試驗(yàn)中,CY可降低第7天的中性粒細(xì)胞數(shù)及第14天的白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞數(shù),表明仔豬的免疫功能受到一定程度的抑制。這與孫月平等(1999)、王盛民等(2006)、張炳華和劉新軍(2008)的研究結(jié)果類(lèi)似。本試驗(yàn)中,從遲發(fā)型超敏反應(yīng)和淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率這兩個(gè)指標(biāo)可以看出,CY對(duì)細(xì)胞免疫功能無(wú)顯著影響,這與袁書(shū)林(2006)、Hou等(2007)和陳慶(2008)的結(jié)果不一致。這可能與試驗(yàn)設(shè)計(jì)、試驗(yàn)動(dòng)物種類(lèi)和健康狀況、試驗(yàn)動(dòng)物自身細(xì)胞免疫功能水平、CY的注射劑量及注射方式等不同有關(guān)。BSA為一種異源蛋白抗原,具有胸腺依賴性,其抗體產(chǎn)生需要Th細(xì)胞的協(xié)助。免疫前仔豬血清中BSA抗體水平應(yīng)為零,在經(jīng)過(guò)抗原BSA刺激后,機(jī)體的免疫系統(tǒng)被激活,更多的蛋白質(zhì)用于抗體的合成,抗體水平升高。本試驗(yàn)中,CY顯著降低了第14天BSA抗體水平,這與He等(2007)的結(jié)果一致,表明CY抑制了仔豬的體液免疫功能。根據(jù)細(xì)胞因子產(chǎn)生的不同,CD4+的Th細(xì)胞可分為T(mén)h1和Th2亞群。Th1分泌IL-2、IFN-γ等細(xì)胞因子,提升機(jī)體免疫效應(yīng);Th2分泌IL-4、IL-10等細(xì)胞因子,參與免疫抑制或免疫耐受(Raymond和Wilkie,2004)。在體內(nèi),Th1和Th2以及相應(yīng)的細(xì)胞因子含量的變化往往意味著機(jī)體免疫狀態(tài)的變化,Th1及IL-2、IFN-γ等細(xì)胞因子的增加意味著機(jī)體免疫上調(diào),Th2及IL-4、IL-10等因子的增加往往意味著免疫耐受或免疫下調(diào)(Ichiyama等,2006)。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),CY可降低第7天的IFN-γ水平,這與何榮(2005)與彭廣華(2007)的報(bào)道一致。該結(jié)果提示:CY可抑制仔豬體內(nèi)同源淋巴細(xì)胞活化,誘導(dǎo)分泌IFN-γ等細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