高脂飼料對(duì)高脂血癥大鼠血液流變學(xué)及血管內(nèi)皮損傷的影響

高脂飼料對(duì)高脂血癥大鼠血液流變學(xué)及血管內(nèi)皮損傷的影響

此前，該項(xiàng)目的研究主要用于動(dòng)脈粥樣硬化領(lǐng)域的研究。近年來(lái)，由于該模型同時(shí)存在高血脂、血液流變學(xué)和血管內(nèi)皮損傷等多種病理機(jī)制，也被用于中醫(yī)痰濁和血瘀證候的研究。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為,證候是對(duì)人體運(yùn)動(dòng)狀態(tài)和方式的概括和描述，隨時(shí)間而動(dòng)態(tài)變化，即其具有“動(dòng)態(tài)時(shí)空”的特征。在以往的報(bào)道中，只有關(guān)于該模型造模末期大鼠血脂、血液流變學(xué)、血管內(nèi)皮的變化，尚缺少對(duì)造模過(guò)程中各指標(biāo)的動(dòng)態(tài)觀察。研究表明,血液流變學(xué)異常、血管內(nèi)皮損傷是血瘀證的重要生物學(xué)表現(xiàn)，過(guò)食膏梁厚味，血脂異常與中醫(yī)痰濁關(guān)系密切。本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)觀察高脂血癥大鼠血脂、血液流變學(xué)和血管內(nèi)皮損傷因素隨造模時(shí)間的延長(zhǎng)而發(fā)生的動(dòng)態(tài)變化，研究痰濁、血瘀證候的動(dòng)態(tài)演化規(guī)律的生物學(xué)基礎(chǔ)。材料和方法1.材料表面1.1美國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司致scxk/u3000gSD雄性成年大鼠，體質(zhì)量160-180g,SPF級(jí)，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，合格證號(hào)：SCXK[京]11-00-0008。高脂飼料由普通鼠飼料77.9%、膽固醇2%、豬油10%、牛膽酸鈉0.1%和10%蛋黃粉組成，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所提供。1.2脂質(zhì)中-c-ldl-c檢測(cè)總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-c)及低密度脂蛋白膽固醇(LDL-c)試劑盒,由首都醫(yī)科大學(xué)臨床科技中心提供；聚乙烯吡咯烷酮(PVP),配制紅細(xì)胞變形液，Sigma公司產(chǎn)品。一氧化氮（NO）試劑盒，由晶美生物技術(shù)有限公司提供，內(nèi)皮素（ET）試劑盒，由東亞生物試劑有限公司提供。1.3微量血漿試驗(yàn)BeckmanCoulterCX4Pro全自動(dòng)生化分析儀，美國(guó)Beckman公司生產(chǎn)。LBY-N6B全自動(dòng)清洗血流變儀及微量血漿測(cè)試裝置，LBY-BX3紅細(xì)胞變形儀，C2000-2高性能血凝儀，由北京普利生儀器有限公司生產(chǎn)。DL-4000B冷凍離心機(jī)，由上海安亭科學(xué)儀器廠生產(chǎn)。WFZ800-3型紫外可見(jiàn)單光束分光光度計(jì)，北京瑞利光學(xué)儀器廠產(chǎn)品。γ計(jì)數(shù)器，北京核儀器廠生產(chǎn)。2.方法2.1高脂對(duì)飼料的基本情況進(jìn)行全部實(shí)驗(yàn)大鼠同批購(gòu)入，飼養(yǎng)于SPF動(dòng)物房?jī)?nèi)，室溫保持在23℃-25℃，相對(duì)濕度55%±5%。大鼠隨機(jī)分為5組：正常對(duì)照組，高脂2周、高脂4周、高脂8周和高脂16周組。高脂各組分別給予高脂飲食2周、4周、8周和16周，正常對(duì)照組喂以普通飼料。實(shí)驗(yàn)期間自由進(jìn)食，動(dòng)物采取終點(diǎn)取齊法，即由不同時(shí)間起點(diǎn)開(kāi)始飼養(yǎng)，同一時(shí)間終點(diǎn)進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)的檢測(cè)。造模終點(diǎn)各組大鼠禁食16h，腹腔注射10%水合氯醛麻醉，固定，頸總動(dòng)脈插管放血，肝素（20U/ml血）抗凝測(cè)定血液黏度和紅細(xì)胞變形、聚集能力，EDTA和消炎痛抗凝血檢測(cè)血漿ET，非抗凝血制備血清檢測(cè)血脂和NO。2.2血脂指標(biāo)的測(cè)定取血，待血液自凝后，取血清，用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清中TC、TG、HDL-c和LDL-c含量。并分別計(jì)算LDL-c與HDL-c、TC與HDL-c的比值，作為致動(dòng)脈粥樣硬化指數(shù)，評(píng)價(jià)動(dòng)脈粥樣硬化的程度。2.3血液流變量指數(shù)的檢測(cè)2.3.1高切變率全血黏度測(cè)定取肝素抗凝血0.8ml，用LBY-N6B全自動(dòng)血液流變儀，測(cè)定在10s-1低切、60s-1中切、150s-1高切變率下的全血黏度；以肝素抗凝血1ml,3000r/min離心10min，取上清0.2ml血漿以微量血漿測(cè)試裝置檢測(cè)血漿黏度。2.3.2紅細(xì)胞變形指數(shù)測(cè)定取肝素抗凝血0.15ml,加15%PVP緩沖液（配制方法：PVP30kDa,61mMNaCl,0.8mMNa2HPO4,0.2mMKH2PO4,pH7.4,290mOsm/kg,黏度15mPa·s)2ml，混勻;取0.5ml樣品，然后用LBY-BX3紅細(xì)胞變形儀，測(cè)定在切變率600s-1、800s-1、1000s-1下的紅細(xì)胞變形指數(shù)；以肝素抗凝血0.4ml，加15%PVP緩沖液0.1ml，混勻;取0.5ml樣品，然后用LBY-BX3紅細(xì)胞變形儀測(cè)定紅細(xì)胞聚集指數(shù)。2.4edta和消炎痛抗凝血活性的檢測(cè)取血清0.1ml，嚴(yán)格按照NO試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行檢測(cè)，取EDTA和消炎痛抗凝血的血漿0.1ml，按照試劑盒說(shuō)明書，以γ計(jì)數(shù)器檢測(cè)ET含量。3.統(tǒng)計(jì)處理使用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)用x-±s表示；組間比較，應(yīng)用單因素方差分析，以P<0.05為差異有顯著性意義。c組的-c水平見(jiàn)表1。與正常對(duì)照組比較，高脂飲食喂飼2、4、8、16周后，大鼠的血清TC和LDL-c水平顯著增高，并保持不變。高脂飲食喂飼16周后大鼠血清TG和HDL-c水平顯著升高。計(jì)算結(jié)果顯示致動(dòng)脈粥樣硬化指數(shù)LDL/HDL和TC/HDL在喂飼高脂飼料的短期內(nèi)明顯增加，且維持不變（表2），提示高脂飼料具有引起大鼠產(chǎn)生動(dòng)脈粥樣硬化樣變化的趨勢(shì)。2.高脂飼料對(duì)大鼠紅細(xì)胞功能的影響見(jiàn)表3。與正常對(duì)照組相比，高脂飼料喂養(yǎng)8周起，大鼠的血液黏度有所升高，表現(xiàn)為高切、中切、低切變率下全血黏度和血漿黏度升高；此變化可持續(xù)到第16周。見(jiàn)表3。與正常對(duì)照組相比，高脂飼料喂養(yǎng)8周起，大鼠的紅細(xì)胞變形指數(shù)升高，此變化可持續(xù)到16周；紅細(xì)胞聚集指數(shù)未見(jiàn)明顯變化。3.高脂飼料對(duì)大鼠血清no、et平衡的影響見(jiàn)表4。正常狀態(tài)下，內(nèi)皮細(xì)胞合成釋放的ET和NO處于動(dòng)態(tài)平衡之中。高脂血癥可促進(jìn)ET的合成和釋放，破壞NO和ET平衡。如表4所示，高脂飼料喂養(yǎng)4周起，大鼠的血清NO含量有降低的趨勢(shì)，血漿內(nèi)皮素明顯升高，ET/NO的比值明顯升高，此變化可持續(xù)到16周；提示高脂飼料喂養(yǎng)可導(dǎo)致血管內(nèi)皮出現(xiàn)損傷。血清血脂及血脂指標(biāo)中醫(yī)學(xué)理論認(rèn)為，長(zhǎng)期嗜食高粱厚味，必致臟腑功能受損，特別是損及脾胃功能，脾失健運(yùn)則升清降濁無(wú)權(quán)，留滯為痰，痰濕內(nèi)阻，血行不暢，則易導(dǎo)致瘀血內(nèi)生，痰瘀互結(jié)，遏阻清陽(yáng)；清陽(yáng)不升，濁陰不降則發(fā)生眩暈、疼痛。其暈、痛的形成與痰濁血瘀關(guān)系密切。元代朱丹溪提出“無(wú)痰不作?！?，痰飲阻遏清陽(yáng)則眩暈，血瘀阻滯脈絡(luò)則疼痛。痰飲、血瘀又互為因果，痰飲內(nèi)阻，血行不暢易致瘀血內(nèi)生；血瘀阻絡(luò)，氣化不行，留滯而為痰飲?？梢?jiàn)高脂血癥常以痰濁血瘀為主要病機(jī)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)2、4、8、16周高脂血癥大鼠造模過(guò)程中的血脂、血液流變學(xué)及血管內(nèi)皮損傷等影響因子的動(dòng)態(tài)觀察，發(fā)現(xiàn)其各指標(biāo)都有不同的變化特點(diǎn)，這些發(fā)現(xiàn)對(duì)探討中醫(yī)的痰濁與血瘀證的相關(guān)關(guān)系的生物學(xué)基礎(chǔ)提供了有意義的資料。現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合研究發(fā)現(xiàn)，痰濁證患者的血清TC、TG、LDL-c含量明顯高于非痰濁組患者和正常人,認(rèn)為血脂水平與痰濁密切相關(guān)，血清TC、TG、LDL-c含量升高可以作為痰濁證微觀辨證及判別治療痰濁證藥物療效和病程進(jìn)展的微觀指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)中，大鼠血清總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-c）在高脂飲食2周即呈顯著性升高，甘油三酯（TG）增高較為緩慢，在高脂飲食16周時(shí)增高才出現(xiàn)顯著性差異。HDL-c水平在高脂飲食喂飼16周時(shí)顯著升高，可能是由于血清膽固醇的升高，從而引起機(jī)體HDL-c的保護(hù)性升高，清除機(jī)體內(nèi)過(guò)高的膽固醇，但由于HDL-c升高的程度沒(méi)有LDL-c、TG升高幅度大，因此反映血管動(dòng)脈粥樣硬化程度的重要指標(biāo)——致動(dòng)脈粥樣硬化指數(shù)LDL/HDL、TG/HDL從高脂飲食2周起即明顯升高，且持續(xù)到第16周。提示脂質(zhì)代謝紊亂是“痰濁”的物質(zhì)基礎(chǔ)。血液流變學(xué)改變是血瘀證發(fā)生的重要病理基礎(chǔ)，血液流變性異常是“痰瘀痹阻”的客觀指標(biāo)，可作為血瘀證微觀辨證的依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)中，大鼠全血黏度、血漿黏度在高脂飲食8周即呈顯著性升高，紅細(xì)胞變形指數(shù)在高脂飲食8周呈顯著性降低。這些血液流變學(xué)指標(biāo)的改變，反映血液在機(jī)體出現(xiàn)血瘀證候時(shí)，呈現(xiàn)“濃、黏、凝、聚”的狀態(tài)。血管內(nèi)皮舒縮功能對(duì)于血液流動(dòng)性和流變性都起著決定性的作用。其影響因子很多，其中，ET作為最強(qiáng)烈的收縮因子，NO作為最強(qiáng)烈的舒張因子，兩者處于一種動(dòng)態(tài)平衡之中，兩者的比值對(duì)血管內(nèi)皮功能起著重要的調(diào)節(jié)作用。高脂飼料喂飼4周時(shí)，大鼠的血清NO含量有降低的趨勢(shì)，ET明顯升高，ET/NO的比值明顯升高，此變化可持續(xù)到16周，提示高脂飼料喂養(yǎng)可導(dǎo)致血管內(nèi)皮出現(xiàn)損傷。綜合分析本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高脂飼料喂養(yǎng)大鼠2周后可見(jiàn)血清TC和LDL-c含量的升高，致動(dòng)脈粥樣硬化指數(shù)上升，4周后可見(jiàn)血清NO含量有下降的趨勢(shì)，血漿ET含量明顯升高，ET/NO明顯升高。8周后可見(jiàn)全血黏度、血漿黏度升高，紅細(xì)胞變形指數(shù)降低。從發(fā)展過(guò)程來(lái)看，是血脂異常引起血管內(nèi)皮損傷，然后引起血液流變性方面的改變。過(guò)食肥甘厚味，引起血液中有形成分血脂的異常，符合中醫(yī)對(duì)“痰濁為病”的認(rèn)識(shí)。痰濁阻絡(luò)，“濕濁”進(jìn)入營(yíng)血,循行經(jīng)脈,流走全身,日久則可形成“痰凝”,阻于血脈,影響氣血運(yùn)行,導(dǎo)致血瘀，最終痰瘀同病，血液表現(xiàn)出血管內(nèi)皮舒縮的調(diào)節(jié)因子表達(dá)異常及“黏、濃、凝、聚”的血液流變學(xué)改變。痰濁與血脂水平相關(guān)，而血瘀證表現(xiàn)的血液“黏”又反映為血液黏度、紅細(xì)胞變形