hplc法測(cè)定補(bǔ)骨脂注射液中補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的含量

hplc法測(cè)定補(bǔ)骨脂注射液中補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的含量

骨補(bǔ)骨脂是豆科植物輔助骨脂psoranecollaboration的干燥成熟果實(shí)。補(bǔ)骨脂注射液是我院應(yīng)用多年的傳統(tǒng)制劑,采用醇提水沉工藝制備,用于支氣管哮喘的治療療效確切。補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素屬呋喃香豆素類,是補(bǔ)骨脂的主要有效成分之一。本實(shí)驗(yàn)建立了補(bǔ)骨脂注射液及原藥材中補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的HPLC含量測(cè)定方法,發(fā)現(xiàn)補(bǔ)骨脂注射液與藥材提取液中補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的濃度比例明顯發(fā)生逆轉(zhuǎn)。有文獻(xiàn)報(bào)道,補(bǔ)骨脂在提取精制過程中,補(bǔ)骨脂素可部分轉(zhuǎn)化成異補(bǔ)骨脂素,在水提醇沉過程中隨著加熱時(shí)間的延長(zhǎng),補(bǔ)骨脂素含量成比例下降,異補(bǔ)骨脂素升高,認(rèn)為兩者之間存在轉(zhuǎn)化。本實(shí)驗(yàn)在補(bǔ)骨脂注射液及原藥材中補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的HPLC法含量測(cè)定方法研究基礎(chǔ)上,對(duì)補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素水溶液及其在不同pH值條件下的熱穩(wěn)定性進(jìn)行了考察,探討補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素濃度變化的可能因素。1設(shè)備和材料1.1測(cè)器、數(shù)據(jù)軟件Waters高效液相色譜儀(996二極管陣列檢測(cè)器、600泵、2010數(shù)據(jù)處理軟件);電子恒溫水浴鍋(廣東省汕頭市醫(yī)用設(shè)備廠);DELTA320pH計(jì)(METLERTOLEDO)。1.2補(bǔ)骨脂藥材鑒定補(bǔ)骨脂素(psoralen)、異補(bǔ)骨脂素(isopsoralen)購(gòu)自中國(guó)生物制品鑒定所。補(bǔ)骨脂藥材由本院藥學(xué)部購(gòu)進(jìn),經(jīng)董玉珍主任藥師鑒定為豆科植物補(bǔ)骨脂PsoralencorylifoliaL.的干燥成熟果實(shí)。補(bǔ)骨脂注射液由本院中藥制劑實(shí)驗(yàn)室制備。所用試劑均為分析純。2實(shí)驗(yàn)方法2.1級(jí)管陣列分離器色譜柱:NucleosilC18柱,柱溫35℃;996二級(jí)管陣列檢測(cè)器,波長(zhǎng)247nm;流動(dòng)相:甲醇-0.1%冰醋酸(55∶45),流速:1mL·min-1,進(jìn)樣量20μL。2.2線性范圍與檢出限精密稱取補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素,用甲醇溶解并配制成含補(bǔ)骨脂素0.02mg·mL-1,異補(bǔ)骨脂素0.05mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)品溶液,分別吸取0.5,1.0,2.0,3.0,4.0,5.0mL,用甲醇稀釋定容至10mL。按上述色譜條件進(jìn)樣20μL,測(cè)量各組分峰面積,以濃度和峰面積進(jìn)行回歸,計(jì)算回歸方程。結(jié)果如下:補(bǔ)骨脂素:A=178023C+35889,r=0.9990,線性范圍:1.1μg~11μg;異補(bǔ)骨脂素:A=161413C+43059,r=0.9991,線性范圍:2.6μg~26μg。2.3藥材溶液供試液的制備精密量取補(bǔ)骨脂注射液4mL,用乙酸乙酯萃取3次,每次5mL,合并3次萃取液,揮干乙酸乙酯,用甲醇定容至10mL,為供試品溶液。精密稱取與20020316批號(hào)補(bǔ)骨脂注射液同批次的補(bǔ)骨脂藥材細(xì)粉(過60目篩)0.1g,置50mL量瓶中,加甲醇近刻度,超聲提取30min,放置12h,定容,搖勻,為藥材醇溶液。吸取上清液2.5mL,稀釋至10mL,為藥材醇溶液供試液。另稱取補(bǔ)骨脂藥材細(xì)粉100g,按照補(bǔ)骨脂注射液提取工藝操作,用乙醇浸泡、除醇、冷藏、分層,取水溶性部位制成50mL藥材水溶液。精密量取4mL,以下操作同供試品溶液的制備,制得藥材水溶液供試液。供試品溶液和藥材供試液分別過濾,進(jìn)樣20μL,測(cè)量峰面積,代入回歸方程,計(jì)算補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素含量及濃度比。結(jié)果見表1。2.4各組分檢測(cè)精密稱取20011014批號(hào)樣品5份,按供試品溶液的制備與測(cè)定項(xiàng)下操作,分別測(cè)定各組分含量,計(jì)算各組分平均值和RSD,各組分RSD=4.3%。2.5加樣回收率測(cè)定精密稱取補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素,配制成含補(bǔ)骨脂素13.57μg·mL-1,異補(bǔ)骨脂素31.07μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液,吸取2.5mL,取20011014批號(hào)補(bǔ)骨脂注射液吸取2.0mL,混合均勻,按供試品溶液的制備與測(cè)定項(xiàng)下操作,制備成加樣回收率供試品液,同法測(cè)定各組分含量,計(jì)算加樣回收率,結(jié)果見表2。2.6熱穩(wěn)定性評(píng)價(jià)2.6.1測(cè)定項(xiàng)目的制備量取含一定量的補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素標(biāo)準(zhǔn)品水溶液和“2.3”項(xiàng)下制備的補(bǔ)骨脂藥材水溶液各2mL于具塞刻度試管共多份,于100℃水浴加熱不同時(shí)間,取出后用常水冷卻至室溫,按“2.3”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法提取制備并測(cè)定,平行操作并測(cè)定二次。各溶液中的補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素濃度比見表3,表4。比較不同加熱時(shí)間補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素濃度,各組無顯著差異。表明單純加熱處理不足以導(dǎo)致補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素之間的轉(zhuǎn)化或降解。2.6.2提取制備測(cè)定配制一定濃度的補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素標(biāo)準(zhǔn)品水溶液,分為8份,用酸堿將溶液調(diào)整為不同pH值,于100℃水浴加熱2h,取出后用常水冷卻至室溫,各量取5.0mL,按“2.3”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法提取制備并測(cè)定,平行操作并測(cè)定二次。各溶液中的補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素濃度比見表5。比較不同pH值條件下加熱相同時(shí)間補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素濃度比差異,結(jié)果與原液(pH=6.36)比較pH值為3.06,4.94,7.94時(shí)各組濃度比差異不顯著;pH值為6.97時(shí),補(bǔ)骨脂素相對(duì)異補(bǔ)骨脂素濃度降低,pH值為4.09,8.98,10.09時(shí)補(bǔ)骨脂素相對(duì)異補(bǔ)骨脂素濃度升高。3補(bǔ)骨脂注射液補(bǔ)骨脂素與異補(bǔ)骨脂素同屬呋喃香豆素類的同分異構(gòu)體,補(bǔ)骨脂素為線型結(jié)構(gòu)(6,7-呋喃香豆素),異補(bǔ)骨脂素為角型結(jié)構(gòu)(7,8-呋喃香豆素)。呋喃香豆素類結(jié)構(gòu)中的呋喃環(huán)與內(nèi)酯環(huán)為不穩(wěn)定結(jié)構(gòu),對(duì)酸堿、光等不穩(wěn)定。補(bǔ)骨脂注射液中補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的濃度比例與原藥材提取液中的濃度比例明顯發(fā)生逆轉(zhuǎn)。推測(cè)在提取制備過程中隨著加熱時(shí)間的延長(zhǎng),兩者之間存在轉(zhuǎn)化。研究結(jié)果表明單純