葡萄糖-精氨酸水熱合成碳量子點及其與dnp和ms-12ssdna間的親和行為

葡萄糖-精氨酸水熱合成碳量子點及其與dnp和ms-12ssdna間的親和行為

0實驗用碳點及其應用碳量點是體積小于10nm的納米球形材料，稱為碳點（cds）。目前制備碳點的方法大致分為:(1)自上而下法,主要有電弧放電法、激光刻蝕法、電化學氧化法等;(2)自下而上法,主要有微波法、超聲法和水熱合成法等。與傳統(tǒng)半導體量子點相比,碳量子點具有無毒或低毒特性,良好的生物相容性和環(huán)境安全性、水溶性以及廉價易得等優(yōu)點,所以在生物標記、熒光探針生物檢測等領域都具有重要的應用價值。在眾多合成方法中,水熱法是一種非常適于實驗室合成碳量子點的方法,該方法制備的碳點表面帶有大量親水性基團(如-OH、-COOH等),另外摻氮型碳點還帶有氨基基團,具有更好的熒光效應;碳點表面的親水基團是碳點功能化的基礎,研究親水性基團與生物分子間的相互作用,對碳點在生物醫(yī)學領域的應用具有基礎探索的重要意義。本實驗以葡萄糖為主要碳源,精氨酸為氮源,采用水熱法合成碳點,并運用TEM、FT-IR、XPS、UV和F-7000熒光分光光度計表征碳點性能,然后運用激光微量熱泳動技術(MST)研究碳點與4種dNTP和單雙鏈DNA分子間的相互作用。這對碳點標記DNA,制備碳點-DNA復合的熒光分子探針等碳點應用具有重要意義。1實驗1.1dna序列葡萄糖(分析純,SIGMA)、精氨酸(分析純,SIGMA)、100mmol/L四種三磷酸脫氧核苷酸分子(dATP、dTTP、dGTP、dCTP)。MST-1/2ssDNA序列(上海生物工程有限公司合成)如表1所示。電熱鼓風干燥箱(上海一恒科技有限公司)、X射線電子能譜儀(Thermo,Esclab250Xi)、F-7000熒光分光光度計(日立,F-7000)、傅里葉紅外光譜儀(FT-IR,Nicolet,6700)、紫外-可見分光光度計(日立,U-3900)、聚合酶鏈式反應儀(PCR,杭州晶格科學儀器有限公司)、透析袋若干(美國spectrumlabs)、透射電鏡(日立,H-7650B)、激光微量熱泳動儀(MST,德國nanotemper)。1.2聚氯四氟乙烯反應劑的合成稱取葡萄糖2g+精氨酸1g置于燒杯中,加入25mL去離子水,充分攪拌溶解后倒入聚氯四氟乙烯不銹鋼反應釜中。將其置于電熱鼓風干燥箱中180℃反應3h。產(chǎn)物使用1000Da的透析袋透析24h,去除未反應的原料和中間小分子產(chǎn)物,然后冷凍干燥,得到的物質(zhì)重新稱重,重溶于超純水中,并對其進行TEM、熒光光譜等測試。1.3碳點溶液的配制將碳點配制成濃度為0.3mg/mL的溶液,固定碳點的溶度。將4種dNTP從100mmol/L開始進行1∶1梯度稀釋成16個梯度,每梯度取5μL樣品與5μL碳點溶液充分混合,室溫靜置5min左右,轉移至毛細管中。將毛細管置于MST儀器中,在LEDpower20%、Laserpower20%及藍光激發(fā)條件下進行MST實驗測試。1.4dsna與退火將上海生物工程有限公司合成的MST-1/2ssDNA配制成濃度為100μmol/L的溶液,取等體積的初始濃度的MST-1ssDNA與MST-2ssDNA混勻,在PCR儀中進行退火形成dsDNA,退火條件如下:94℃3min,90~15℃每隔5℃梯度降溫,每個溫度階段2min。將兩條ssDNA與退火形成的dsDNA從初始濃度開始1∶1梯度稀釋成16個梯度,每梯度各取5μL樣品與5μL濃度為0.3mg/mL的碳點充分混合,室溫靜置5min左右,轉移至毛細管中。將毛細管置于MST儀器中,在LEDpower20%、Laserpower20%及藍光激發(fā)條件下進行MST實驗測試。2結果與討論2.1碳點的紅外光譜表征碳點的TEM圖如圖1(a)所示,從圖中看到黑色碳點分散性很好,粒子尺寸分布均勻,合成的碳點粒子直徑約為9nm,結構呈圓球型(圖1(b))。圖2是碳點的FT-IR光譜,其中3338cm-1處為O-H或者N-H的伸縮振動峰,2935cm-1為羧酸的O-H伸縮振動峰,1767cm-1和1705cm-1為C=O吸收峰,1456cm-1和1371cm-1為伯醇和叔醇的吸收峰,1144cm-1和1039cm-1為C-O或者C-N的伸縮振動峰,760cm-1為雜環(huán)吸收峰。由此可知碳點表面富含羥基、羧基、氨基等親水基團及部分C-N雜環(huán)結構。圖3為碳點的XPS能譜圖,使用XPSPEAK軟件對圖3中的N1s峰與C1s峰分別進行分峰擬合得到N1s高分辨圖譜(圖4(a))和C1s高分辨圖譜(圖4(b))。N1s峰分為398.45eV、399.60eV、401.5eV三個峰值,分別對應五元雜環(huán)吡啶型氮化物、六元雜環(huán)吡咯型氮化物及N部分取代石墨結構中C位置形成的石墨狀化合物等結構;C1s峰分為284.61eV、285.64eV、286.52eV和288.24eV四個峰,分別對應著C=C、C-N、C-O和C=O等化學鍵結構。據(jù)此推測合成的碳點的表面含有大量的含氧和含氮的基團,這些基團應該為羧基、羥基和氨基等,這與碳量子點紅外光譜表征得到的碳量子點表面帶有的基團一致。圖5(a)為碳點在水溶液中的紫外-可見吸收光譜和在370nm激發(fā)下的熒光光譜。吸收光譜上紫外區(qū)存在很強的吸收,并在276nm處有1個明顯的吸收峰值,葡萄糖和精氨酸水溶液各自的吸收波譜在276nm處均無吸收峰,即該吸收峰的存在是由碳點存在而造成的。同時在370nm激發(fā)下獲得的熒光發(fā)射光譜上發(fā)現(xiàn)碳點在445.4nm處存在峰值,此時碳點發(fā)射明亮的藍色熒光,熒光光譜半峰寬為85nm。碳點用不同的激發(fā)波長激發(fā)獲得的熒光發(fā)射波譜見圖5(b),發(fā)現(xiàn)碳點的最佳激發(fā)波長并不在碳點的吸收峰值276nm處,而是在370nm附近,并且碳點的熒光光譜峰位在270~330nm內(nèi)隨著激發(fā)波長的增加有藍移趨勢,而在330~450nm內(nèi)隨著激發(fā)波長的增加逐漸紅移。圖5(a)中內(nèi)插的(c)圖為碳點溶液在自然光下拍攝的照片,溶液呈黃色,(d)圖為同樣的樣品在365nm紫外燈照射下拍攝的照片,溶液由自然光下的黃色轉變?yōu)樗{色溶液,這與熒光光譜中得到的結果一致。2.2碳點與dntp的k擬合分析熒光標記分子的熱泳動測定是通過監(jiān)測毛細管內(nèi)的熒光分布F實現(xiàn)的。毛細管中熒光分布與熒光分子濃度相對應。定量碳點(A)濃度不變,T(dNTP)以不同濃度滴定A可以獲得一系列的熱泳曲線(圖6(a))。通過歸一化熒光Fnorm=Fhot/Fcold來繪制Fnorm對T不同濃度的對數(shù)曲線,獲得S形的結合曲線,從而通過MST儀器數(shù)據(jù)分析軟件擬合可以得到解離常數(shù)Kd值等。Kd定義為Kd=[A]*[T]/[AT],其中[A]、[T]及[AT]分別為分子A、T和AT復合分子的濃度;Kd值越高說明二者間的親和力越弱。碳點與dNTP的Kd擬合S型曲線如圖6(b)所示,可知碳點與dATP、dTTP、dGTP、dCTP分子的結合解離常數(shù)(Kd)值分別為2.59mmol/L、2.62mmol/L、1.75mmol/L、23.8mmol/L。水熱法制備的碳點表面富含的羧基、羥基、氨基等親水性基團如圖7(a)所示,這些親水性基團含有電負性大的結構,在水溶液中易與其他結構形成氫鍵。dNTP是聚合酶鏈式反應中DNA擴增的原料,雙鏈DNA形成是通過堿基互補配對完成的,堿基互補配對又是以氫鍵形式結合的,即4種dNTP分子(圖7(b))也具有易形成氫鍵的性質(zhì),據(jù)此推測碳點表面基團與dNTP結構易形成微弱的氫鍵結合,其結合強弱除與dNTP本身分子結構有關,還和碳點表面各基團含量有關。碳點與MST-1ssDNA、MST-2ssDNA和dsDNA間MST測試后軟件Kd擬合的S曲線如圖8所示,依據(jù)MST儀器自帶數(shù)據(jù)分析軟件計算擬合出碳點與兩條互補的單鏈MST-1、MST-2分子間結合解離常數(shù)分別為4.75μmol/L、17.7μmol/L;單鏈DNA是柔性結構與碳點表面基團形成氫鍵的位點,造成兩條互補單鏈DNA與碳點的解離常數(shù)不同的原因是兩條互補單鏈DNA上堿基序列排布不同,MST-1由堿基A、T、C組成而MST-2由堿基A、T、G構成;這與前面測定的4種dNTP與碳點親和強弱相對應。而雙鏈DNA與碳點的分子間親和力很弱,造成此現(xiàn)象的原因是退火后形成的雙鏈DNA結構穩(wěn)定,沒有多余氫鍵位點與碳點結合。由此可知碳點與dNTP、ssDNA間存在微弱的氫鍵結合,結合強弱與分子結構有關。3碳點與dntp、單雙鏈dna分子間的相互作用本實驗成功以葡萄糖與精氨酸為碳源,采用水熱法合成了碳點,多種表征手段