葡萄糖熒光碳點(diǎn)的制備及發(fā)光特性研究

葡萄糖熒光碳點(diǎn)的制備及發(fā)光特性研究

1熒光標(biāo)記物合成熒光碳點(diǎn)用熒光材料分子對(duì)細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記是一種經(jīng)典的細(xì)胞生物學(xué)研究方法，而傳統(tǒng)的熒光材料并不具備這一點(diǎn)。激發(fā)光譜短缺，激發(fā)光譜光譜半峰（fwhm）寬，有時(shí)為尾，導(dǎo)致光譜峰之間的重疊，因此有必要限制可同時(shí)使用的熒光檢測(cè)數(shù)量。有機(jī)染料易光漂白和光解,光解產(chǎn)物對(duì)生物分子往往具有殺傷作用等等。熒光碳點(diǎn)(Fluorescentcarbondots,CDs),是繼量子點(diǎn)之后又一種新型的熒光納米材料,克服了傳統(tǒng)熒光染料的缺點(diǎn),在生物和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中得到廣泛的應(yīng)用,并被認(rèn)為生物相容性好,毒性低,對(duì)細(xì)胞損傷小,有望代替量子點(diǎn)成為最具有應(yīng)用前景的環(huán)保型熒光納米材料。本實(shí)驗(yàn)以葡萄糖為碳源,己二胺為鈍化劑,采用溶劑熱法合成熒光碳點(diǎn),并將其作為熒光標(biāo)記物與鼠抗人CD3抗體、羊抗鼠IgG抗體鏈接制備兩種水溶性復(fù)合物探針,利用直接或間接標(biāo)記方法對(duì)人血淋巴細(xì)胞進(jìn)行熒光成像,72h后細(xì)胞仍然保持明亮的熒光。結(jié)果表明熒光碳點(diǎn)具有較好的熒光強(qiáng)度和光穩(wěn)定性。2實(shí)驗(yàn)部分2.1catsspe型LS-55型熒光光度計(jì)(美國(guó)PerkinElmer公司);UV-2000型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京瑞利公司);HZQ-D型恒溫振蕩器(哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司);LeicaTCSSPE型激光共聚焦熒光顯微鏡(德國(guó)Leica公司);葡萄糖(北京博奧星生物科技有限公司);聚乙二醇(沈陽(yáng)國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);己二胺(沈陽(yáng)國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);羊抗鼠IgG抗體、鼠抗人CD3和FITC標(biāo)記的鼠抗人CD3抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司);NHS(N-Hydroxysuccinimide)和EDC(N-ethyl-N′-[3-(dimethylamino)propyl]carbodiimidehydrochloride(美國(guó)Fluka公司);其他試劑均為分析純。實(shí)驗(yàn)用水均為18.2MΩ·cm的超純水。2.2實(shí)驗(yàn)方法2.2.1熒光碳點(diǎn)的制備準(zhǔn)確稱取540mg葡萄糖溶于25mL聚乙二醇/水(1∶1,V/V)溶液中,并轉(zhuǎn)移至反應(yīng)釜中,180℃下反應(yīng)3h,取出冷卻至室溫后,再加入450mg己二胺粉末于上述反應(yīng)液中,于120℃烘箱中恒溫反應(yīng)12h進(jìn)行鈍化,即可得到棕褐色熒光碳點(diǎn)溶液,用超純水定容至25mL,該熒光碳點(diǎn)的濃度為0.72mol/L(以碳計(jì))。將制備的碳點(diǎn)溶液用超純水稀釋至0.036mol/L,作為碳點(diǎn)儲(chǔ)備液4℃保存?zhèn)溆谩?.2.2鼠抗人cd3抗體制備將上述制備的水溶性CDs0.25mL濃度0.036mol/L,加入EDC(50mmol)和NHS(5mmol)的磷酸鹽緩沖液0.5mL(PBS,0.01mol/L,pH7.4),室溫活化10min,再加入40μg鼠抗人CD3抗體,37℃搖床反應(yīng)1h。另取制備的水溶性CDs0.25mL濃度0.036mol/L,加入EDC(50mmol)和NHS(5mmol)的磷酸鹽緩沖液0.5mL(PBS,0.01mol/L,pH7.4)溶解,室溫活化10min,再加入20μL濃度為1mg/mL羊抗鼠IgG抗體,37℃搖床反應(yīng)2h。2.2.3人類血液中熒光絲的制備和染色(1)離心20d取靜脈血1—2mL,用人血淋巴細(xì)胞分離液分離靜脈血中的淋巴細(xì)胞,離心2000rpm,20min。取出淋巴細(xì)胞,用0.01mol/LPBS洗2次,離心2000rpm,20min。棄上清液。取1μL該細(xì)胞液涂敷熒光片(12孔),自然干燥后,放入冷丙酮中固定10min(丙酮先放入4℃冰箱中)取出,干燥后放入-80℃冰箱中待用。(2)碳點(diǎn)鏈接的細(xì)胞培養(yǎng)將制備的細(xì)胞涂片從冰箱中取出,快速吹干,每孔加入封閉液20μL,將其放入濕盒中,再放入37℃培養(yǎng)箱中孵育30min。取出細(xì)胞涂片,先用0.01mol/LPBS沖掉封閉液,再將細(xì)胞涂片放入冷PBS液體中浸泡5min。取出細(xì)胞涂片,用細(xì)條濾紙將孔周圍液體吸干。直接標(biāo)記中每孔加入20μL碳點(diǎn)鏈接的鼠抗人CD3抗體或FITC標(biāo)記的鼠抗人CD3抗體后,將其放入37℃培養(yǎng)箱中孵育2h。間接標(biāo)記中將碳點(diǎn)鏈接的二抗滴于已經(jīng)和一抗結(jié)合的細(xì)胞上,然后在37℃培養(yǎng)箱中孵育2h。熒光顯微鏡成像前用PBS緩沖液洗滌至熒光片上沒(méi)有CDs的底色。3結(jié)果與討論3.1cds的吸收光譜圖1為合成的CDs的紫外吸收與熒光發(fā)射光譜。由圖1可知,曲線a為CDs的吸收光譜,CDs在350nm左右出現(xiàn)了明顯的特征吸收峰;曲線b為CDs的熒光光譜,在350nm波長(zhǎng)激發(fā)下,CDs在451nm處得到一個(gè)很強(qiáng)的發(fā)射峰,這與在紫外燈下CDs發(fā)射的明亮藍(lán)青色熒光(c)一致。3.2關(guān)于cds的表面圖2為鏈接前后CDs的熒光光譜。從圖2中可見(jiàn),CDs-CD3復(fù)合探針(曲線a)較CDs的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)(曲線b),是因?yàn)镃D3抗體包被在CDs的表面,減少了CDs的表面缺陷,使得CDs的熒光產(chǎn)率的增加。而鏈接IgG抗體的CDs的熒光強(qiáng)度反而降低(曲線c),這可能是IgG抗體與CDs表面的氨基作用較強(qiáng),在一定程度上破壞了氨基對(duì)CDs的鈍化修飾。同時(shí)鏈接前后CDs的發(fā)射波長(zhǎng)幾乎沒(méi)有變化,說(shuō)明CDs-CD3和CDs-IgG兩種復(fù)合探針保持了原有水溶性碳點(diǎn)的熒光發(fā)射特性。3.3cds-cd3標(biāo)記多態(tài)性細(xì)胞的生長(zhǎng)人血淋巴細(xì)胞可以通過(guò)細(xì)胞表面抗原與抗體之間的特異性作用實(shí)現(xiàn)標(biāo)記。與間接法相比,直接法標(biāo)記步驟簡(jiǎn)單。圖3(a)是人血淋巴細(xì)胞被藍(lán)光激發(fā)的顯微照片。從圖中可以看出,人血淋巴細(xì)胞本身并不發(fā)光。(b)是沒(méi)有鏈接抗體的CDs與細(xì)胞共同孵育后,細(xì)胞表面也呈現(xiàn)少量的熒光,說(shuō)明直接標(biāo)記法具有非特異性的吸附。(c)是FITC-CD3標(biāo)記的人血淋巴細(xì)胞顯微照片。(d)是CDs-CD3復(fù)合探針標(biāo)記的人血淋巴細(xì)胞在藍(lán)光激發(fā)下的照片,可以清楚觀察到人血淋巴細(xì)胞被CDs-CD3復(fù)合探針特異性標(biāo)記,并呈現(xiàn)出明亮清晰的藍(lán)青色熒光圖像。3.4細(xì)胞標(biāo)記和人血淋巴細(xì)胞檢測(cè)間接法是將結(jié)合一抗的人血淋巴細(xì)胞與CDs-IgG復(fù)合探針發(fā)生偶聯(lián),通過(guò)一抗和二抗之間的相互作用實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞標(biāo)記的目的。圖4c為CDs-IgG復(fù)合探針與結(jié)合了一抗的人血淋巴細(xì)胞經(jīng)共同孵育后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記的照片,呈現(xiàn)出明亮的藍(lán)青色熒光。而沒(méi)有加一抗的人血淋巴細(xì)胞在暗場(chǎng)下檢測(cè)不到CDs的藍(lán)青色熒光,如圖4a和b?？梢?jiàn)間接標(biāo)記法比直接法具有較好的特異性。3.5細(xì)胞熒光照片圖5為不同時(shí)間下CDs-IgG復(fù)合探針標(biāo)記的人血淋巴細(xì)胞熒光照片。從照片中可以看出,標(biāo)記的固定細(xì)胞在4℃冰箱中即使放置72h后在熒光顯微鏡下觀察,細(xì)胞仍然