帶蒂筋膜瓣包裹復(fù)合自體紅骨髓修復(fù)骨缺損

帶蒂筋膜瓣包裹復(fù)合自體紅骨髓修復(fù)骨缺損

0骨組織工程組合法利用傷口修復(fù)傷口和供體來(lái)源不足等缺陷，限制骨缺損，尤其是大缺陷。正常骨折匹配是連續(xù)的，這是骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞相互作用的結(jié)果。這是骨科臨床上最常見的結(jié)合方法，骨缺損的愈合是間隙愈合。間隙的存在對(duì)骨結(jié)合的影響很多，軟組織的“墊層”延長(zhǎng)了骨移植。實(shí)驗(yàn)證明具有骨潛能的間質(zhì)細(xì)胞向缺損區(qū)生長(zhǎng),移行的速度慢于周圍的結(jié)締組織。許多骨缺損模型中,骨缺損迅速被來(lái)自周圍的結(jié)締組織所充填,骨折端間、骨床與移植骨間存在纖維結(jié)締組織是骨不愈合病理基礎(chǔ)。骨組織工程復(fù)合物是當(dāng)今治療骨缺損研究的熱點(diǎn),但因其不具有血管化,骨髓基質(zhì)干細(xì)胞不能夠獲得及時(shí)充分的營(yíng)養(yǎng)易凋亡,再者骨髓基質(zhì)干細(xì)胞需要體外擴(kuò)增培養(yǎng)易發(fā)生污染,且等待時(shí)間長(zhǎng)、過(guò)程費(fèi)時(shí)以及倫理學(xué)要求等諸多不足,嚴(yán)重制約了其在臨床上應(yīng)用于推廣。國(guó)外學(xué)者將紅骨髓和生成因子復(fù)合即時(shí)植入,用于促進(jìn)骨折愈合已經(jīng)獲得滿意效果。由于不需體外培養(yǎng)過(guò)程,只要在抽取紅骨髓后與支架生成因子復(fù)合并立即植入,被稱為“非細(xì)胞型組織工程化骨”,該方法操作簡(jiǎn)單,臨床實(shí)用性強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)旨在探索利用帶蒂筋膜瓣包裹法構(gòu)建血管化非細(xì)胞型組織工程骨并誘導(dǎo)其骨再生修復(fù)骨缺損的可行性。1動(dòng)物分組、藥物聯(lián)合和網(wǎng)絡(luò)營(yíng)養(yǎng)設(shè)計(jì):同體對(duì)照動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。時(shí)間及地點(diǎn):實(shí)驗(yàn)于2007-12/2009-02在河北北方學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心(BSL-3)及附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心(P3)完成。材料:成年新西蘭大白兔24只,由河北北方學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供,許可證號(hào):SCXK(京2006-0006,雌雄不限,兔齡四五個(gè)月,體質(zhì)量2.0~2.5kg;實(shí)驗(yàn)過(guò)程中動(dòng)物處置符合2006年科技部《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》中的要求。生物支架材料為骨誘導(dǎo)活性材料(osteoinductiveabsorbingmaterial,OAM),購(gòu)于天津生物發(fā)展有限公司,OAM是由多孔磷酸鈣人工骨(porouscalciumphosphatecement,PCPC)作為載體,并與重組人骨形成蛋白2(recombinanthumanbonemorphogeneticprotein2,rhBMP-2)復(fù)合構(gòu)成,為疏水嗜酸性糖蛋白,相對(duì)分子質(zhì)量為18000±500;PCPC呈條塊狀2cm×0.5cm×0.5cm,具有天然多孔的結(jié)構(gòu),孔徑300~400μm,孔隙率大于80%,與骨髓基質(zhì)干細(xì)胞、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bonemorphogeneticprotein,BMP)具有良好的組織相容性,每條含BMP≥10mg,實(shí)現(xiàn)BMP-2緩釋,而且有與人體骨組織礦物質(zhì)相似的Ca、P比例與晶體結(jié)構(gòu),且Ca/P小于1.6,力學(xué)強(qiáng)度可靠且可以在體內(nèi)逐步降解,降解后的鈣參與局部新骨形成或進(jìn)入機(jī)體的鈣磷庫(kù),以正常方式排出體外。實(shí)驗(yàn)方法:組織工程復(fù)合物制備:將實(shí)驗(yàn)24只兔于放血干預(yù)動(dòng)員第5天,從雙側(cè)股骨大轉(zhuǎn)子處用骨髓穿刺針(含有100U/mL肝素0.2mL的5mL注射器)每側(cè)設(shè)2點(diǎn),分別抽取自體紅骨髓(autologousredbonemarrow,ARBM)各1mL,將條狀OAM放入含ARBM4mL的注射器中充分浸泡混合,制成ARBM非細(xì)胞型組織工程復(fù)合物。用前配置。大段骨缺損動(dòng)物造模及復(fù)合物移植:所有動(dòng)物選取雙側(cè)前臂參加實(shí)驗(yàn),左前臂即對(duì)照組,右前臂即實(shí)驗(yàn)組。氯胺酮注射液10mg/kg耳緣靜脈麻醉下無(wú)菌手術(shù),顯露雙側(cè)橈骨中上段,自橈骨小頭下4cm處開始截除相當(dāng)于直徑長(zhǎng)度四五倍約2cm橈骨干及其骨膜,造成橈骨長(zhǎng)段骨-骨膜完全缺損。對(duì)照組將ARBM組織工程復(fù)合物嵌入骨缺損;實(shí)驗(yàn)組利用顯微外科技術(shù),在兔前肢皮下骨缺損鄰近制備一個(gè)大小合適的帶有無(wú)名血管蒂所屬毛細(xì)血管網(wǎng)的筋膜條瓣,通過(guò)隧道轉(zhuǎn)移到骨缺損處,將其包裹ARBM組織工程復(fù)合物后嵌入骨缺損,將筋膜條兩側(cè)用10-0無(wú)創(chuàng)線固定在斷端骨膜或軟組織上,逐層縫合傷口。術(shù)后連續(xù)3d臀大肌注入硫酸慶大霉素注射液,2mL/只,1次/d。術(shù)后4,8,12,16周4個(gè)時(shí)間段,每個(gè)時(shí)間段各組隨機(jī)取6只動(dòng)物,X射線攝片后處死,取雙側(cè)橈骨進(jìn)行大體觀察和組織學(xué)相關(guān)檢查。動(dòng)物觀察:術(shù)后動(dòng)物的飲食、活動(dòng)和傷口愈合情況。X射線及吸光度檢查:植骨術(shù)后4,8,12,16周時(shí),各組分別連續(xù)攝兔右尺橈骨正位X射線片,每支兔系統(tǒng)選片5張,在骨缺損區(qū)范圍內(nèi)隨機(jī)選取6個(gè)測(cè)試點(diǎn),用Pehamed-Densoquick2型透射吸光度計(jì)測(cè)定其實(shí)際吸光度值及空曝區(qū)最大吸光度值,求兩者的百分比即吸光度比,觀察骨缺損修復(fù)過(guò)程的動(dòng)態(tài)變化。大體形態(tài)和組織學(xué)觀察:術(shù)后4,8,12,16周取骨缺損修復(fù)標(biāo)本做大體觀察,觀察骨缺損修復(fù)程度、骨痂生長(zhǎng)情況。然后鋸下植骨部位,用體積分?jǐn)?shù)為4%的中性甲醛溶液固定,稀鹽酸脫鈣,乙醇逐級(jí)脫水,二甲苯透明,石蠟包埋切片,蘇木精-伊紅染色、VG染色,光鏡下觀察骨缺損修復(fù)成骨及再血管化情況。修復(fù)區(qū)內(nèi)骨形態(tài)計(jì)量分析:將術(shù)后4個(gè)時(shí)間段各組所有組織塊進(jìn)行連續(xù)切片,系統(tǒng)選片,每塊組織選5張。在放大100倍條件下,每張切片上系統(tǒng)隨機(jī)選取5個(gè)視野,在圖像分析儀下進(jìn)行組織形態(tài)分析,測(cè)定術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)新生骨小梁面積占鏡下修復(fù)區(qū)面積的比值,以百分比表示。交界區(qū)血管圖像分析:選取組織工程復(fù)合物與正常骨交界部位,用圖像分析儀測(cè)量單位面積的血管面積。隨機(jī)測(cè)定每張切片5個(gè)區(qū)域內(nèi)血管面積(μm2),用測(cè)定的血管面積除以區(qū)域面積,得出數(shù)據(jù)為單位面積內(nèi)的血管面積,以百分比表示。主要觀察指標(biāo):(1)動(dòng)物觀察。(2)X射線檢查。(3)大體形態(tài)和組織學(xué)觀察。(4)修復(fù)區(qū)內(nèi)骨形態(tài)計(jì)量分析。(5)交界區(qū)血管圖像計(jì)量分析。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:數(shù)據(jù)用表示,定量變量組間所得數(shù)據(jù)比較,采用SPSS11.5軟件行方差分析和t檢驗(yàn)。2結(jié)果2.1動(dòng)物切口感染動(dòng)物5例均為單側(cè)肢體(對(duì)照組3例,實(shí)驗(yàn)組2例)傷口有紅腫和滲出,10d后對(duì)照組2例死亡,另外3例傷口感染裂開,手術(shù)區(qū)外露,實(shí)驗(yàn)組2例繼續(xù)參與實(shí)驗(yàn),對(duì)照組1例植入物脫出,退出實(shí)驗(yàn)。又補(bǔ)充3只實(shí)驗(yàn)兔后,傷口無(wú)異常,除實(shí)驗(yàn)組2例感染外,所有動(dòng)物傷口12d拆線Ⅰ期愈合。術(shù)后第2~4天實(shí)驗(yàn)兔精神差,第8~12天動(dòng)物前肢由開始重度跛行變?yōu)檩p度跛行,運(yùn)動(dòng)由開始不活動(dòng)變?yōu)榛顒?dòng)少,采食由開始拒食轉(zhuǎn)為少食,而后采食增加,運(yùn)動(dòng)增多,步態(tài)轉(zhuǎn)好,第16~19天恢復(fù)術(shù)前狀態(tài)。2.2術(shù)后骨髓內(nèi)固定對(duì)照組:術(shù)后4周,可見植入物紋理清楚,密度稍低,與橈骨斷端之間隙清晰可見。8周時(shí),植入物紋理模糊,密度較低,截骨斷面與植入物之間隙不明顯,無(wú)外骨痂形成。12周時(shí),有少量外骨痂形成并包裹植入物。16周時(shí),周邊有少許不規(guī)則外骨痂生成并初步形成骨干結(jié)構(gòu),骨皮質(zhì)不連續(xù),髓腔不通。實(shí)驗(yàn)組:術(shù)后4周,即見植入物紋理模糊,密度減低,截骨斷面與植入物之間隙已不明顯,有少許外骨痂形成。8周時(shí),植入物密度逐漸增高,截骨斷面與植入物之間隙基本消失,有較整齊的板層狀骨痂形成。12周時(shí),初步形成骨干結(jié)構(gòu),骨皮質(zhì)連續(xù),部分髓腔再通。16周時(shí),正常骨干結(jié)構(gòu)形成,骨髓腔完全再通。吸光度比測(cè)量結(jié)果:兩組之間術(shù)后2周無(wú)差異,自第4周起兩組之間同一時(shí)間點(diǎn)和同組術(shù)后不同時(shí)間吸光度比之間比較差異均有顯著性意義(P<0.05),見表1。2.3術(shù)后骨瘤組織病理學(xué)觀察大體形態(tài)觀察:對(duì)照組:術(shù)后第4,8周,植入物與尺骨斷端之間有纖維結(jié)締組織連接。第12周,除少量骨痂包裹植入物外,截骨斷面與植入物之間隙已不明顯。16周時(shí)少許不規(guī)則外骨痂包裹植入物,與骨干形成一個(gè)整體。實(shí)驗(yàn)組:術(shù)后第4周,帶蒂筋膜瓣與植入物生長(zhǎng)為一體,形成類似骨膜樣組織,剝開此組織,植入物與尺骨斷端之間有少許纖維結(jié)締組織連接。第8周,少量骨痂包裹植入物。第12周時(shí)適量外骨痂完全包裹植入物,與骨干形成一個(gè)整體。16周時(shí)骨缺損區(qū)骨皮質(zhì)連續(xù),骨干結(jié)構(gòu)得以重塑。組織學(xué)觀察:對(duì)照組:術(shù)后第4周,鏡下見纖維結(jié)締組織長(zhǎng)入植入物內(nèi)部,有散在的軟骨細(xì)胞團(tuán)形成。第8周時(shí)有纖維結(jié)締組織和新生骨小梁結(jié)構(gòu),未見血管結(jié)構(gòu)和明顯淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。第12周,骨斷端之間有少許纖維結(jié)締組織,植入物表層即骨痂表層有散在血管結(jié)構(gòu)、纖維性骨痂形成,植入物內(nèi)部即骨痂深層骨小梁及血管結(jié)構(gòu)較少。16周時(shí)骨斷端之間仍有纖維結(jié)締組織相連,植入物內(nèi)血管長(zhǎng)入較少和發(fā)育較成熟的骨小梁,骨髓腔未通。實(shí)驗(yàn)組:術(shù)后第4周,鏡下見纖維結(jié)締組織長(zhǎng)入植入物內(nèi)部并有血管長(zhǎng)入,有散在發(fā)育中骨小梁和軟骨細(xì)胞團(tuán)形成,未見明顯淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。第8周,植入物內(nèi)部有較豐富血管長(zhǎng)入并有發(fā)育較成熟的骨小梁骨及軟骨組織形成。12周時(shí)血管豐富及大量成熟骨小梁形成,骨髓腔部分再通。16周時(shí)植入物已吸收降解,完全由新骨替代,新骨中散在少量軟骨,成熟骨結(jié)構(gòu)形成,骨髓腔再通,已不見植入物殘骸。2.4兩組樣本實(shí)時(shí)時(shí)間點(diǎn)評(píng)分根據(jù)Lane-Sandhu骨移植物組織學(xué)評(píng)分法,對(duì)兩組樣本各時(shí)間段同一時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行評(píng)分。經(jīng)方差分析,術(shù)后4,8,12,16周實(shí)驗(yàn)組的骨小梁的體積明顯多于對(duì)照組(P<0.05),見表2。2.5表3顯示了邊界區(qū)域血管圖像的測(cè)量3帶蒂肌力瓣包裹非細(xì)胞型組織工程化骨的修復(fù)應(yīng)用膜誘導(dǎo)技術(shù),即利用顯微外科技術(shù)在骨缺損鄰近制備一個(gè)帶有無(wú)名血管蒂所屬毛細(xì)血管網(wǎng)的筋膜瓣,使其包裹組織工程復(fù)合體防止其散漏并充填骨缺損,首先筋膜瓣覆蓋骨缺損將其作為骨端骨膜再生的支架,機(jī)械性地阻礙了纖維結(jié)締組織和周圍軟組織進(jìn)入骨缺損部位,保持骨缺損部位有以相對(duì)穩(wěn)定的環(huán)境。通過(guò)X射線攝片及解剖大體形態(tài)觀察,從早期4周時(shí)實(shí)驗(yàn)組的帶蒂筋膜瓣與植入物生長(zhǎng)為一體,形成類似骨膜樣組織,截骨斷面與植入物之間隙已不明顯,有少許外骨痂形成,其余各時(shí)間點(diǎn)連接處成骨作用明顯好于對(duì)照組;術(shù)后16周組織學(xué)觀察實(shí)驗(yàn)組由于有膜誘導(dǎo)即筋膜瓣阻擋作用,骨斷端之間始終未發(fā)現(xiàn)周圍的纖維結(jié)締組織夾墊,最終新骨將骨缺損兩端橋接,且外觀骨塑性良好;相反,對(duì)照組骨缺損兩端始終有來(lái)自周圍的纖維結(jié)締組織充填連接骨斷端,且骨塑性外觀較差。充足的血液供應(yīng)是保證組織工程化骨體內(nèi)存活的決定性因素。筋膜組織學(xué)本身具有良好的通透性和豐富的毛細(xì)血管網(wǎng),可使體液內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)入缺損部位,給骨細(xì)胞的再生提供一定的營(yíng)養(yǎng)。帶蒂筋膜瓣除了保留筋膜自身血供根源外,在顯微鏡下觀察還帶有無(wú)名血管蒂所屬血管網(wǎng),使筋膜瓣血液循環(huán)更豐富。其包裹復(fù)合物在構(gòu)建組織工程化骨的同時(shí)建立其血液供應(yīng),形成血管化的非細(xì)胞型組織工程骨,可使血液中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)入缺損部位,保證植入OAM內(nèi)部的ARBM中骨髓基質(zhì)干細(xì)胞能夠獲得及時(shí)充分的營(yíng)養(yǎng),延長(zhǎng)細(xì)胞壽命減少凋亡率,使骨缺損得以修復(fù)。通過(guò)選取組織工程復(fù)合物與正常骨交界部位,用圖像分析儀測(cè)量單位面積的血管面積來(lái)動(dòng)態(tài)觀察組織工程化骨在體內(nèi)血管化的進(jìn)程,發(fā)現(xiàn)兩組各時(shí)間段同一時(shí)間點(diǎn),筋膜瓣包裹實(shí)驗(yàn)組與無(wú)筋膜瓣包裹對(duì)照組相比,在單位面積內(nèi)血管的數(shù)量及質(zhì)量上都較對(duì)照組相比有明顯的優(yōu)勢(shì),差異均有顯著性意義(P<0.05),提示帶蒂筋膜瓣包裹對(duì)組織工程化骨的血管化進(jìn)程有明顯的促進(jìn)作用。從X射線片、大體形態(tài)觀察和組織學(xué)切片多種方法檢測(cè)兩組各時(shí)間段同一時(shí)間點(diǎn)無(wú)論植入物內(nèi)部血管的長(zhǎng)入、骨小梁及軟骨組織形成的數(shù)量和速度,還是成熟骨結(jié)構(gòu)的形成、骨干結(jié)構(gòu)的重塑、骨髓腔的再通、植入物的吸收降解,證實(shí)帶蒂筋膜瓣構(gòu)建血管化非細(xì)胞型組織工程骨體內(nèi)成骨的能力和修復(fù)骨缺損的效果明顯優(yōu)于無(wú)筋膜瓣對(duì)照組,通過(guò)吸光度測(cè)定和修復(fù)區(qū)內(nèi)骨形態(tài)計(jì)量分析筋膜瓣實(shí)驗(yàn)組所形成的骨組織中心未見骨壞死或空隙狀未成骨區(qū),統(tǒng)計(jì)學(xué)分析差異均有顯著性意義(P<0.05)。帶蒂筋膜瓣包裹非細(xì)胞型組織工程化骨修復(fù)骨缺損的優(yōu)點(diǎn):(1)采取ARBM,利用骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(種子細(xì)胞)具有成骨和血管再生雙重特點(diǎn),與含BMP(骨生長(zhǎng)因子)的OAM(載體)均勻混合成非細(xì)胞型組織工程復(fù)合物。獨(dú)特的結(jié)合方式,在控制BMP釋放,提供骨髓基質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)的支架,增強(qiáng)其在骨缺損局部聚積,保證骨髓基質(zhì)干細(xì)胞和BMP濃度而不讓流失的同時(shí),BMP誘導(dǎo)下不僅可提高ARBM單位體積內(nèi)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞、成骨細(xì)胞的數(shù)量和活性,還能夠在體內(nèi)、體外高效誘導(dǎo)血管周圍大量游走的間充質(zhì)細(xì)胞或骨髓基質(zhì)細(xì)胞增殖,轉(zhuǎn)化為軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞,通過(guò)以軟骨化骨為主膜內(nèi)化骨為輔形成新骨,載體在修復(fù)早期起到機(jī)械支撐和增加力學(xué)強(qiáng)度,后期逐漸經(jīng)生物降解而形成新骨,起到了良好的骨誘導(dǎo)、骨傳導(dǎo)和骨支撐三重作用。(2)血管化組織工程骨本身就有自主成骨及誘導(dǎo)血管再生的能力,與宿主骨連接處愈合快而牢固;筋膜瓣實(shí)驗(yàn)組大體形態(tài)和組織學(xué)觀察,無(wú)論植入物與橈骨斷端之間連接強(qiáng)度,外骨痂形成程度,還是植入物內(nèi)部即骨痂深層成熟骨小梁形成,均與無(wú)筋膜瓣對(duì)照組相比所需骨性愈合時(shí)間明顯縮短。(3)復(fù)合物移植后筋膜管內(nèi)骨再生現(xiàn)象明顯,移植骨內(nèi)部塑形快,能較快地適應(yīng)宿主骨的力學(xué)環(huán)境;在實(shí)驗(yàn)研究中觀察到筋膜管內(nèi)的骨形成,是從骨端開始生長(zhǎng),而來(lái)源于缺損以外的組織不會(huì)穿透此膜進(jìn)入骨缺損區(qū),膜技術(shù)的應(yīng)用一方面阻礙了周圍組織長(zhǎng)入骨缺損區(qū),為骨再生提供了空間,另一方面,筋膜管還有收集骨髓基質(zhì)干細(xì)胞、骨端產(chǎn)生的BMP等成骨因子,提高其密度或濃度的作用,筋膜管內(nèi)的環(huán)境有利于骨缺損區(qū)和膜下的軟骨成骨,導(dǎo)致移植后骨再生明顯。由于應(yīng)力的刺激和組織工程骨血管化作用以及膜和膜下豐富血