甲殼質(zhì)衍生物殼寡糖對(duì)骨折愈合過程中成骨細(xì)胞內(nèi)骨形態(tài)發(fā)生蛋白的影響

甲殼質(zhì)衍生物殼寡糖對(duì)骨折愈合過程中成骨細(xì)胞內(nèi)骨形態(tài)發(fā)生蛋白的影響

骨折愈合是身體組織的再生過程。這是一個(gè)極其復(fù)雜的生理過程，除了個(gè)體的健康狀況、骨折部位、固定方法和其他影響因素外，藥物和各種生長(zhǎng)因子也起著不可忽視的作用。骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)是成骨細(xì)胞分泌的一種重要的細(xì)胞因子,能誘導(dǎo)血管周圍游走的、未分化的間充質(zhì)細(xì)胞分化增殖為骨系細(xì)胞,在骨改建和骨折愈合中具有重要作用。甲殼質(zhì)廣泛存在于海洋動(dòng)物的殼中,是生物學(xué)上僅次于蛋白質(zhì)骨膠的最重要的動(dòng)物結(jié)構(gòu)材料,甲殼質(zhì)衍生物對(duì)人體多種器官及系統(tǒng)均有不同程度的生理調(diào)節(jié)作用。本研究旨在闡明甲殼質(zhì)衍生物殼寡糖對(duì)骨折局部BMP含量的影響,以期為殼寡糖的應(yīng)用提供理論依據(jù)。1材料和方法1.1骨缺損模型的建立選用體質(zhì)量為(2.10±0.39)kg健康新西蘭兔40只,用30g/L戊巴比妥鈉30mg/kg耳緣靜脈注射全麻。在無菌條件操作下,于右橈骨中段背側(cè)肱橈肌肌腱深面縱行切開骨膜約6mm,銳性、環(huán)形剝離骨膜,用特制寬度為3mm單葉手鋸,垂直鋸斷橈骨造成3mm缺損,沖洗縫合骨膜、皮膚。術(shù)后自由活動(dòng),不用外固定,應(yīng)用慶大霉素4萬單位肌注,每天1次,連用5d。隨機(jī)分為兩組,各20只。實(shí)驗(yàn)組在骨缺損模型建立后每日給予殼寡糖(中國(guó)海洋大學(xué)提供)0.28g/kg,每日1次,灌胃給藥;對(duì)照組模型建立后用1.00mL/kg生理鹽水灌胃,每日1次。手術(shù)后9、17、30和42d分別處死動(dòng)物取材,每次每組取5只。1.2骨折愈合試驗(yàn)動(dòng)物處死后以橈骨斷端為中心,上、下各2cm取材,置入50g/L乙二胺四乙酸(EDTA)液中脫鈣15d。常規(guī)梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋,標(biāo)出橈骨長(zhǎng)軸,沿骨長(zhǎng)軸縱切,切片厚7μm,行常規(guī)蘇木精-伊紅染色,觀察骨折愈合情況。行BMP-2(武漢博士德生物工程有限公司提供)免疫組織化學(xué)染色,用VIDIS圖像分析系統(tǒng)測(cè)定免疫組化陽(yáng)性產(chǎn)物的平均吸光度值。1.3統(tǒng)計(jì)處理所有數(shù)據(jù)均采用SPSS軟件包處理,數(shù)據(jù)間比較采用t檢驗(yàn)和F檢驗(yàn)。2結(jié)果2.1斷端層間膠原纖維排列及強(qiáng)度實(shí)驗(yàn)組術(shù)后9d骨折端可見大量膠原纖維形成,斷端間隙變小,大量成骨細(xì)胞出現(xiàn);而對(duì)照組斷端間隙較大,成骨細(xì)胞無或極少。術(shù)后17d實(shí)驗(yàn)組斷端之間膠原纖維被骨小梁代替,成骨細(xì)胞排列整齊,偶見破骨細(xì)胞;對(duì)照組骨折斷端仍表現(xiàn)為排列不整齊的膠原纖維,骨膜下可見散在的成骨細(xì)胞。術(shù)后30d實(shí)驗(yàn)組斷端之間全部為骨小梁填充,將要貫通骨髓腔梁;對(duì)照組斷端之間大部分為骨小梁,但有中間部分未銜接。術(shù)后42d實(shí)驗(yàn)組斷端處骨板編織骨初始形成,骨髓腔貫通;對(duì)照組斷端之間充滿骨小梁,但連接線不清,髓腔將要貫通。2.2術(shù)后第30天對(duì)照組BMP含量在術(shù)后9、17、30d時(shí)呈上升趨勢(shì),42d時(shí)降低,BMP表達(dá)高峰出現(xiàn)在術(shù)后第30天;實(shí)驗(yàn)組BMP含量在術(shù)后9、17d高于對(duì)照組,差異有顯著性(t=15.579、28.817,P<0.01),而術(shù)后30、42d時(shí)與對(duì)照組比較,差異無顯著性(t=1.908、2.415,P>0.05),BMP表達(dá)高峰出現(xiàn)在手術(shù)后第17天。見表1。3殼寡糖對(duì)骨折愈合過程中bmp的表達(dá)骨折愈合是機(jī)體結(jié)締組織的一種再生修復(fù)過程,大體可分為4個(gè)階段:血腫形成期、纖維骨痂形成期、骨性骨痂形成期及骨痂塑形改建期。在血腫形成期,骨折端發(fā)生炎性反應(yīng),血腫周圍的吞噬細(xì)胞、毛細(xì)血管和幼稚的結(jié)締組織長(zhǎng)入血腫;在纖維骨痂形成期,肉芽機(jī)化形成透明軟骨,巨噬細(xì)胞增生刺激大量纖維細(xì)胞產(chǎn)生膠原;在骨性骨痂形成期,開始形成骨小梁,類骨組織沉著,成骨細(xì)胞生長(zhǎng);在骨痂塑形改建期,類骨組織沉著成編織骨或骨板,破骨細(xì)胞聚積成切割錐穿通骨折端,斷端間髓腔貫通。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)兔骨折后對(duì)創(chuàng)傷的反應(yīng)以及骨愈合的組織學(xué)分期,將實(shí)驗(yàn)分成4個(gè)時(shí)間段,以期反映整個(gè)骨折愈合中BMP的表達(dá)情況。本文蘇木精-伊紅染色結(jié)果表明,實(shí)驗(yàn)組在術(shù)后9d即產(chǎn)生了豐富的膠原纖維,出現(xiàn)大量的成骨細(xì)胞,在術(shù)后17d,骨折斷端間已基本全部被骨小梁填充,骨小梁周圍成骨細(xì)胞排列整齊;而對(duì)照組在術(shù)后17d膠原纖維排列仍不整齊,骨膜下僅有散在的成骨細(xì)胞,說明殼寡糖可促使成骨細(xì)胞的活性增高并且時(shí)相提前,新生骨質(zhì)的產(chǎn)生增多,從而使得骨折提前愈合。BMP由成骨細(xì)胞分泌,是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β超家族中的一組多功能細(xì)胞因子。其主要生物學(xué)作用是誘導(dǎo)未分化的間充質(zhì)細(xì)胞、骨髓基質(zhì)細(xì)胞、骨膜細(xì)胞分化增殖為成骨細(xì)胞及軟骨細(xì)胞,在骨改建和骨折愈合中具有重要作用。張永剛等在兔橈骨骨折模型上進(jìn)行了BMP基因表達(dá)的定量和定位研究,結(jié)果顯示,在骨折修復(fù)過程中,BMP的表達(dá)具有明顯的時(shí)相性。在骨折修復(fù)早期,BMPmRNA表達(dá)量明顯增高,峰值出現(xiàn)于骨折后2周,第4周驟然回降,以后逐漸降至正常水平。其原因?yàn)?骨折早期在創(chuàng)傷等因素刺激下,骨折端局部骨膜中成骨細(xì)胞及周圍的間充質(zhì)細(xì)胞增生,使局部BMP高表達(dá)細(xì)胞增加,BMP合成、分泌增加;骨折修復(fù)晚期,隨著成熟骨細(xì)胞的增加,成軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞減少,BMP合成減少,骨誘導(dǎo)作用減弱,直至達(dá)到維持正常骨代謝的平衡水平。本文結(jié)果顯示,對(duì)照組BMP的表達(dá)符合上述規(guī)律,即在30d前BMP表達(dá)逐漸升高,30d時(shí)表達(dá)處于高峰,之后逐漸降低。而實(shí)驗(yàn)組BMP表達(dá)高峰出現(xiàn)在手術(shù)后17d,同時(shí)