大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨不同染色方法比較

大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨不同染色方法比較

0小鼠關(guān)節(jié)軟骨關(guān)節(jié)軟骨位于關(guān)節(jié)表面。這是一個(gè)高度特異性的結(jié)合組織，只有少量細(xì)胞。軟骨細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì),基質(zhì)主要由膠原纖維、蛋白聚糖和水組成,是軟骨的主要成分。根據(jù)軟骨細(xì)胞和纖維的形態(tài)結(jié)構(gòu)關(guān)節(jié)軟骨可分4層。Ⅰ層淺表層富含膠原;Ⅱ?qū)又虚g層、Ⅲ層輻射層或稱深層均富含蛋白聚糖;Ⅳ層鈣化軟骨層。國內(nèi)外學(xué)者對關(guān)節(jié)軟骨對軟骨進(jìn)行了大量研究,需要用不同的染色方法對研究結(jié)果進(jìn)行分析,但將多種染色方法同時(shí)用于軟骨研究的較少,為了給軟骨研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù),本實(shí)驗(yàn)采用蘇木精-伊紅染色、番紅O染色、阿爾辛藍(lán)染色、甲苯胺藍(lán)染色、番紅-阿爾辛藍(lán)染色及番紅-固綠6種組織化學(xué)染色方法,對10只大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織進(jìn)行觀察。1小鼠膝關(guān)節(jié)軟骨負(fù)樣的組織化學(xué)染色設(shè)計(jì):組織學(xué)對比觀察。時(shí)間及地點(diǎn):于2008-08/2009-07在山西醫(yī)科大學(xué)臨床第二附屬醫(yī)院骨科實(shí)驗(yàn)室完成。材料:雄性健康Wistar大鼠10只,由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。因月齡大小與潮線有關(guān),小月齡大鼠發(fā)育欠成熟無潮線結(jié)構(gòu)出現(xiàn),大月齡大鼠可觀察到潮線結(jié)構(gòu),所以選取2月齡大鼠5只,4.5月齡大鼠5只,體質(zhì)量270~350g。實(shí)驗(yàn)過程中對動(dòng)物處置符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。主要試劑:實(shí)驗(yàn)方法:標(biāo)本的處理:實(shí)驗(yàn)動(dòng)物全部頸椎脫臼處死,取雙側(cè)膝關(guān)節(jié)作為標(biāo)本。標(biāo)本切取后立即投入40g/L多聚甲醛固定48h,后入20%EDTA二鈉(pH7.15)溶液浸泡,隔天換液一次,連續(xù)脫鈣12d,至組織完全脫鈣。組織化學(xué)染色:標(biāo)本固定、脫鈣后,正中矢狀面剖開,取內(nèi)外側(cè)半關(guān)節(jié),經(jīng)逐級乙醇脫水、二甲苯透明、浸蠟后關(guān)節(jié)切面緊貼包埋盒底部包埋,切片機(jī)先切除約0.7mm,以去除交叉韌帶等組織,達(dá)軟骨負(fù)重區(qū),連續(xù)切片厚4.0~5.0μm。切片常規(guī)脫蠟至水,自來水沖洗后行不同組織化學(xué)染色:常規(guī)蘇木精-伊紅染色:切片入蘇木精浸染5min,水洗,再入伊紅浸染5min,水洗,二甲苯透明,中性樹膠封固。番紅O染色:2.5g番紅O溶于體積分?jǐn)?shù)95%乙醇100mL制成2.5%番紅O乙醇溶液作為母液,使用時(shí)再稀釋為0.5%的番紅O水溶液(20mL母液加80mL蒸餾水)。0.5%番紅O染液滴染1min,如染色時(shí)間太短染色不充分,染色時(shí)間長于1min則染色效果等同于染色1min,鏡下體積分?jǐn)?shù)95%乙醇分化數(shù)秒,風(fēng)干,二甲苯透明,中性樹膠封固。阿爾辛藍(lán)染色:1%阿爾辛藍(lán)8GX溶于3%醋酸制成pH值2.5的阿爾辛藍(lán)染液;1%阿爾辛藍(lán)8GX溶于0.1mol/L的鹽酸中制成pH值1.0的阿爾辛藍(lán)染液。切片分別入pH值為2.5和pH值為1.0的1%阿爾新藍(lán)染液染色50min,如室溫過低適當(dāng)延長染色時(shí)間,自來水沖洗,二甲苯透明,中性樹膠封固。甲苯胺藍(lán)染色:切片入甲苯胺藍(lán)染液30min,自來水沖洗,冰醋酸分化至胞核清晰,分化時(shí)間不易過長否則容易導(dǎo)致分化過度,再次自來水沖洗,風(fēng)干后二甲苯透明,中性樹膠封固。番紅-阿爾辛藍(lán)染色:0.5%番紅O染液滴染1min,鏡下體積分?jǐn)?shù)95%乙醇分化數(shù)秒,再入1%阿爾辛藍(lán)pH值2.5的染液50min,嚴(yán)格控制番紅染色時(shí)間否則易遮蓋阿爾辛藍(lán)染色,自來水沖洗,二甲苯透明,中性樹膠封固。番紅-固綠染色法:切片入1%固綠浸染1.5min;乙酸分化數(shù)10s;再入0.5%番紅O染液浸染1min;體積分?jǐn)?shù)95%乙醇分化數(shù)秒;自來水沖洗;二甲苯透明;中性樹膠封固。染色結(jié)束后用OlympusIX70顯微鏡,DP71型CCD觀察染色結(jié)果并進(jìn)行圖像采集,觀察經(jīng)不同化學(xué)方法染色后的軟骨負(fù)重區(qū)組織學(xué)形態(tài)。組織化學(xué)染色方法中各種染料在軟骨組織中的著色原理如下:軟骨組織中各種染料的著色原理:主要觀察指標(biāo):正常大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨負(fù)重區(qū)的形態(tài)結(jié)構(gòu)。設(shè)計(jì)、實(shí)施、評估者:設(shè)計(jì)為第二作者,實(shí)施為第一、三作者,評估為第二、四作者。2結(jié)果2.1蘇木精-伊紅染色結(jié)果關(guān)節(jié)軟骨的4層結(jié)構(gòu)清晰,軟骨表面光滑、完整,軟骨細(xì)胞呈柱狀排列,基質(zhì)呈均勻呈嗜堿性染色,軟骨細(xì)胞呈強(qiáng)嗜堿性染色,見圖1。2.2染色后的結(jié)果是班級紅色o4層結(jié)構(gòu)層次清楚,淺表層染色較淡,朝潮線方向染色增強(qiáng),基質(zhì)深層染色最紅,見圖2。2.3阿爾辛藍(lán)染色pH1.0時(shí)阿爾辛藍(lán)染色可見軟骨基質(zhì)呈較淺的藍(lán)色,軟骨細(xì)胞周邊部分被阿爾辛藍(lán)強(qiáng)烈染色,中心部分多呈未染狀態(tài)。pH2.5時(shí)阿爾辛藍(lán)染色較深,見圖3。2.4甲基苯胺藍(lán)染色的結(jié)果組織結(jié)構(gòu)層欠清,細(xì)胞核被染成藍(lán)色,胞核染色清晰,胞漿幾乎不著色,基質(zhì)呈淡藍(lán)紫色,見圖4。2.5亞麻布藍(lán)染色2.6因缺少紅色和綠色染色而得出結(jié)論軟骨基質(zhì)呈均勻的紅色,與單獨(dú)番紅O染色相比紅染較暗,軟骨下骨呈綠色,軟骨組織與骨組織分對比鮮明,見圖6。3間染色的相關(guān)性關(guān)節(jié)軟骨具有支撐質(zhì)量和減少摩擦的作用,它的組織結(jié)構(gòu)和生化成分對維持關(guān)節(jié)的正常功能是必不可少的。目前,國內(nèi)外學(xué)者對關(guān)節(jié)軟骨進(jìn)行了大量的研究,多采用上述染色方法中的一種或幾種。國外學(xué)者約從20世紀(jì)40年代開始有關(guān)染色方法的研究,到七八十年代達(dá)到高峰,可能是由于研究趨向成熟此后有關(guān)染色方法的報(bào)道逐漸減少。國內(nèi)有關(guān)關(guān)節(jié)軟骨染色方法及原理的研究甚少。本實(shí)驗(yàn)將6種組織化學(xué)染色方法應(yīng)用于正常大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨的研究,通過染料著色原理來探討各種染色方法的優(yōu)缺點(diǎn),給軟骨研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。通常以蘇木精-伊紅染色為標(biāo)準(zhǔn)來觀察組織的形態(tài)結(jié)構(gòu),因軟骨基質(zhì)中含有大量酸性黏多糖易于和堿性染料蘇木精結(jié)合,因此蘇木精-伊紅染色的切片上基質(zhì)呈嗜堿性染色。軟骨細(xì)胞所處的軟骨陷窩周圍由于富含硫酸軟骨素因此呈強(qiáng)嗜堿性染色。對觀察軟骨細(xì)胞形態(tài)變化較其它方法清楚。番紅O是一種堿性染料即陽離子染料,研究表明番紅O與蛋白聚糖中的多聚陰離子結(jié)合,確切地說與硫酸軟骨素和硫酸角質(zhì)素結(jié)合,不與膠原結(jié)合。番紅O以正染的形式染色時(shí),與多聚陰離子的濃度成正比,因此可間接反映基質(zhì)中蛋白聚糖的含量和分布。國外學(xué)者通過染料實(shí)驗(yàn)得出:番紅O染色的強(qiáng)度曲線與鄰近軟骨固定電荷的密度曲線呈線性相關(guān)(r=0.900~0.995);而且染色分布在切片上始終一致。因此認(rèn)為番紅O是對軟骨基質(zhì)中蛋白聚糖進(jìn)行組織化學(xué)定量的很好的陽離子染料。并且,有利于通過圖像分析系統(tǒng)來反映蛋白聚糖濃度的改變。蛋白聚糖在軟骨不同深度區(qū)域的含量分布不同,在淺表層蛋白聚糖的含量最低,而在未鈣化軟骨的最深部蛋白聚糖的含量最高。本實(shí)驗(yàn)在番紅O染色的切片上清楚地觀察到蛋白聚糖的這一分布特征,Ⅰ層染色較淺、Ⅱ、Ⅲ層染色朝潮線方向染色加深,與國外研究相符。阿爾辛藍(lán)是一種銅酞菁染料,用來染色酸性黏多糖底物和其他陰離子底物,Scott等認(rèn)為染色機(jī)制是陽離子染劑與陰離子底物間通過鹽鍵結(jié)合染色。通過添加鹽和調(diào)節(jié)氫離子濃度優(yōu)先對某些底物染色,pH值影響染色的性狀,利用不同pH值可區(qū)分酸性黏多糖的物質(zhì)類別。pH值為1.0時(shí),阿爾辛藍(lán)僅與蛋白多糖的硫酸根結(jié)合,pH值為2.5時(shí),與蛋白多糖的硫酸根、羧基結(jié)合形成鹽鍵,這一點(diǎn)從作者研究的切片上可以看出:在富含硫酸根的部位如軟骨細(xì)胞所處的軟骨陷窩染色呈深藍(lán)色,基質(zhì)染色呈淺藍(lán)色,而且pH值1.0切片上基質(zhì)的染色較pH值2.5時(shí)染色較淺。甲苯胺藍(lán)是一種吩噻嗪類異染性陽離子染料,即在一定條件下染酸性物質(zhì)時(shí),染色結(jié)果與染料固有的顏色不同。常用來顯示組織切片上的細(xì)胞核和黏多糖,以異染形式在基質(zhì)主要與硫酸根、在細(xì)胞核與磷酸鹽和醛基通過靜電引力相結(jié)合,但pH1.0時(shí)磷酸基不被離子化,不參與染色。有研究表明在pH值3.0~3.6甲苯胺藍(lán)僅對軟骨基質(zhì)以異染的形式著色。認(rèn)為軟骨基質(zhì)的異染性是由于酸性黏多糖的存在,主要指硫酸軟骨素。作者在研究中發(fā)現(xiàn)甲苯胺藍(lán)在染細(xì)胞核時(shí)呈深藍(lán)色,染基質(zhì)時(shí)呈淡紫藍(lán)色與上述研究相符。番紅-阿爾辛藍(lán)染色:阿爾辛藍(lán)染色對固定和快速脫鈣的靈敏度使得阿爾辛藍(lán)對證明關(guān)節(jié)軟骨蛋白聚糖量變的研究成為一種不可靠的方法。阿爾辛藍(lán)染色應(yīng)當(dāng)伴隨生物測量或者與番紅O正染色結(jié)合對結(jié)果作出全面解釋。作者在研究中將這兩種染色方法結(jié)合起來,更全面地反映了軟骨的染色特點(diǎn)。番紅-固綠染色:固綠為酸性染料,是最大分子的陰離子染料,可溶于水或乙醇,與結(jié)構(gòu)較疏松的膠原纖維能較牢固結(jié)合,不易褪色。鈣化軟骨層與軟骨下骨具有相同的無機(jī)成分,且連接緊密,但兩者的有機(jī)成分(膠原蛋白類型)不同,鈣化軟骨層為Ⅱ型膠原,軟骨下骨膠原含量豐富主要是Ⅰ型膠原,組織切片上軟骨嗜堿性,骨嗜酸性。故用番紅-固綠染色后軟骨與嗜堿性染料番紅結(jié)合呈紅色,軟骨下骨與嗜酸性染料固綠結(jié)合呈綠色,形成鮮明對比將軟骨組織與骨組織區(qū)分開。番紅-固綠染色是國外研究關(guān)節(jié)疾病反映軟骨變化比較常用的一種染色方法,國內(nèi)對軟骨的研究亦有應(yīng)用但相對較少。對于軟骨損傷嚴(yán)重的疾病用番紅-固綠染色可以更直觀地觀察到軟骨與軟骨下骨和骨組織間的關(guān)系。潮線:本實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的年齡從2~4.5個(gè)月齡不等,2月齡大鼠的組織切片上觀察不到潮線,可能是由于動(dòng)物發(fā)育欠成熟,而4月齡左右大鼠的組織切片上可清楚地觀察到波浪狀潮線。最初潮線被認(rèn)為是一條嗜蘇木精的約10μm厚的單線結(jié)構(gòu),經(jīng)典描述是:分離鈣化和未鈣化的軟骨行蘇木精-伊紅染色時(shí)一條波浪狀嗜堿性線,且被認(rèn)為是一種特殊的結(jié)構(gòu)并非人為構(gòu)造。之后的研究表明潮線含有特殊的糖蛋白,并有一個(gè)電鏡可觀察到的獨(dú)特組織學(xué)三層結(jié)構(gòu)出現(xiàn)。作者研究結(jié)果提示光鏡下蘇木精-伊紅、番紅O、甲苯胺藍(lán)染色均可觀察到潮線,分別為藍(lán)色、紅色和藍(lán)色,番紅O和甲苯胺藍(lán)染色強(qiáng)度朝潮線方向增強(qiáng)。番紅O染色對潮線的觀察優(yōu)于其他的染色方法。阿爾辛藍(lán)對潮線不顯示陽染,可能由于其生色團(tuán)相對大且平坦,與潮線不發(fā)生明顯相互作用。由于軟骨基質(zhì)含大量陰離子基團(tuán),故對軟骨的染色多采用陽離子染料,其中甲苯胺藍(lán)染色顯示的結(jié)構(gòu)與番紅O染色相似,可能的原因是番紅O象甲苯胺藍(lán)一樣以非常相似的方式與相同的分子相互作用,但切片上甲苯胺藍(lán)染色顯示的軟骨層次不如番紅O染色清楚,可能的原因是對番紅O不著色而對甲苯胺藍(lán)著色的醛基在膠原或蛋白聚糖分布均一,因此甲苯胺藍(lán)染色層次欠清。Poole,Bulstra等研究表明陽離子染料如甲苯胺藍(lán)、番紅O均可用來從組織切片上對蛋白聚糖進(jìn)行半定量分析,可反映基質(zhì)的變化。由于甲苯胺藍(lán)的異染性,不適合重復(fù)性研究,用番紅O染色可重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,因此多采用番紅O染色反映基質(zhì)中蛋白聚糖含量和分布的變化。雖然番紅O傳統(tǒng)上被認(rèn)為是一種異染性染料,然而,經(jīng)乙醇處理后可能破壞了異染性染料間的相互作用,因此,染料能以近乎正染的形式對蛋白聚糖著色。正染即染料只有一個(gè)最大吸收光譜。如果染料有一個(gè)以上清楚的吸收峰則為異染,異染時(shí)的染色不能與蛋白聚糖的濃度成比例。這種說法解釋了在現(xiàn)有