第3章 核酸的分離與分析

第三章核酸的分離與分析

第一節(jié)核酸的分離純化一、核酸分離提取的原則與要求二、核酸提取的主要步驟三、質(zhì)粒DNA的分離純化四、基因組DNA的制備五、RNA的提取六、核酸的定量一、核酸分離提取的原則要求總的原則：保證核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性，防止降解，排除其它分子的污染。

如：防止核酸酶，特別是RNase的污染，又如：提取DNA分子時(shí)，應(yīng)去除RNA分子，反之亦然。二、核酸提取的主要步驟1.樣品準(zhǔn)備2.細(xì)胞破碎3.分離純化核酸4.核酸的沉淀濃縮1.樣品準(zhǔn)備新鮮動(dòng)植物組織材料：清洗、去掉雜質(zhì)。少量樣品可用液氮凍結(jié)，然后快速碾磨成粉未狀。動(dòng)物細(xì)胞：胰酶消化，離心沉淀，PBS液漂洗，收集沉淀的細(xì)胞。液體培養(yǎng)的微生物：直接離心沉淀收集菌體。2.細(xì)胞破碎——物理方法、化學(xué)方法、酶法等。物理方法：超聲波法、勻漿法、液氮破碎法等。（注意：物理方法容易導(dǎo)致DNA鏈的斷裂）化學(xué)方法和酶法：去污劑（SDS0.5%~1.25%）和溶菌酶或蛋白酶K溫和裂解。EDTA（5mmol/L)作用：與Mg2+結(jié)合，抑制核酸水解酶.除去RNA，可加入適量RNA酶。3.分離純化核酸關(guān)鍵步驟是去除蛋白質(zhì)，還要避免核酸的降解。酚/氯仿抽提法：酚、氯仿:兩種不同的蛋白質(zhì)變性劑。氯仿還能加速有機(jī)相與液相分層，去除植物色素和蔗糖。異戊醇:減少蛋白質(zhì)變性操作過程中產(chǎn)生的氣泡。

細(xì)胞破碎酚/氯仿水相（DNA、小分子RNA）界面（絮狀蛋白質(zhì)沉淀）有機(jī)相（色素、脂類、糖類）酚/氯仿提取除蛋白質(zhì)原理示意圖細(xì)胞懸浮液細(xì)胞抽提物4.核酸的沉淀濃縮乙醇沉淀法：無水乙醇結(jié)合核酸分子所結(jié)合的水，使核酸沉淀。微量的DNA，可加入中等濃度的單價(jià)陽(yáng)離子促進(jìn)沉淀。如Na+，中和DNA分子上的負(fù)電荷，減少了DNA分子間的同性電荷相斥力。三、質(zhì)粒DNA的分離純化重點(diǎn)考慮如何與基因組DNA相互分開?！觅|(zhì)粒分子量小和閉合環(huán)狀超螺旋結(jié)構(gòu)性質(zhì)。分離方法：堿裂解法、煮沸法、去污劑（Triton/SDS）裂解法、CsCl-EB（氯化銫-溴乙錠）密度梯度平衡離心法、羥基磷灰石柱層析法等。1.堿裂解法：小量制備DNA較好的方法。基本原理：在堿性pH（12-12.5）下，DNA分子均變性，恢復(fù)中性時(shí)，線性染色體DNA由于兩條鏈分開且基因組分子量大，單鏈互相無規(guī)則纏繞，不能準(zhǔn)確復(fù)性而沉淀；質(zhì)粒DNA分子因緊密纏繞在一起，能準(zhǔn)確復(fù)性而留于上清溶液中。2.煮沸法利用DNA加熱變性原理，結(jié)合不同DNA復(fù)性的差異進(jìn)行分離。復(fù)性的超螺旋質(zhì)粒DNA分子以溶解狀態(tài)存在液相中，通過高速離心（12,000

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g）可實(shí)現(xiàn)分離。適于快速提取質(zhì)粒

DNA并進(jìn)行鑒定，也適用于大量提取，對(duì)純度要求高的，可做進(jìn)一步純化處理。3.CsCl-EB密度梯度平衡離心CsCl是一種大分子量的重金屬鹽，長(zhǎng)時(shí)間超速離心時(shí)，在管中形成1～1.8052g/cm3自上而下增加的密度梯度。染色體DNA、質(zhì)粒DNA、RNA以及蛋白質(zhì)等，可在離心管內(nèi)不同位置形成區(qū)帶。RNA可與Cs+結(jié)合，因此密度最大，沉積管底，蛋白質(zhì)漂浮于液面上。四、基因組DNA的制備基因組DNA分子量大，受熱易變性，復(fù)性困難，受剪切力作用易斷裂，因此要采用較溫和的條件和方法。如SDS加上蛋白酶K溫和裂解方法。雜蛋白質(zhì)的去除可用酚/氯仿萃取法。對(duì)植物基因組可能需要注意的是糖類的除去，可選用十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）選擇性沉淀RNA或DNA，也可用四或三甲基溴化銨（TEAB）加上50%乙醇沉淀多糖。五、RNA的提取細(xì)胞中的rRNA、tRNA和mRNA不容易完全分開，可先制得細(xì)胞核、線粒體、核糖體等細(xì)胞器和細(xì)胞質(zhì)，然后再?gòu)闹蟹蛛x某一類RNA。mRNA分子種類繁多，分子量大小不均一、含量少、易降解，分離較為困難?？衫霉丫勖撗跣剀账幔╫ligodT)親和色譜柱分離。RNA的提取要點(diǎn)：①樣品細(xì)胞或組織的有效破碎；②核蛋白復(fù)合體變性解離，釋放出RNA；③對(duì)RNA酶的有效抑制；④將RNA從DNA和蛋白質(zhì)混合物中分離；⑤多糖含量高的樣品還要采取措施有效去除多糖雜質(zhì)。最關(guān)鍵的是抑制RNA酶的活性。六、核酸的定量核酸定性定量分析是指導(dǎo)核酸分離純化的重要手段。常見的方法：紫外分光光度法、熒光分光光度法。紫外分光光度法核酸的最大吸收波長(zhǎng)是260nm，吸收波谷在230nm。根據(jù)測(cè)定，在波長(zhǎng)260nm時(shí)，1OD值的光密度相當(dāng)于雙鏈DNA濃度為50μg／mL；單鏈DNA或RNA為40μg／mL；單鏈寡核苷酸為20μg／mL?？梢源藖碛?jì)算核酸樣品的濃度，檢測(cè)最低限為0.5~1.0μg／mL。通過測(cè)定在260nm和280nm的紫外吸收值的比值來估計(jì)核酸的純度。DNA的比值為1.8，RNA的比值為2.0。若A樣品的比值高于1.8，說明其中的RNA尚未除盡，比值小于1.8則說明殘留酚或蛋白質(zhì)。熒光分光光度法DNA、RNA本身并不產(chǎn)生熒光，但在熒光染料溴化乙錠（EB）嵌入堿基平面之間后，DNA樣品在紫外線照射激發(fā)下，可以發(fā)出紅色熒光，其熒光強(qiáng)度與核酸含量成正比。由此可建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定未知樣品的濃度。第二節(jié)核酸的凝膠電泳

電泳：是利用帶電荷物質(zhì)的電場(chǎng)中的遷移速率的不同而將其分離的方法。凝膠電泳：利用了支持介質(zhì)形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)使不同大小的大分子物質(zhì)得以分離并在保留于凝膠中，在不同位置形成條帶。電泳遷移率的大小與物質(zhì)的帶電量與分子量的比值（荷質(zhì)比）相關(guān)。在中性pH或堿性緩沖液中，核酸分子骨架上的磷酸基團(tuán)在水中的解離帶有負(fù)電荷，在電場(chǎng)中由負(fù)極向正極遷移。在均一的凝膠網(wǎng)絡(luò)中，核酸的遷移速率只與分子的大小相關(guān)，使不同分子量者分開，而相同分子量聚集形成條帶。一、瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠作為電泳基質(zhì)有如下優(yōu)點(diǎn)：①形成的凝膠具有大量微孔，其孔徑尺寸取決于它的濃度，如0.75%瓊脂糖的孔徑為800nm，1%瓊脂糖孔徑為150nm；②透明，無紫外吸收；③無毒，熱熔冷凝，制膠方便；④熱可逆性，具有一定強(qiáng)度。瓊脂糖凝膠的制備：將瓊脂糖在所需緩沖液中熔化成清澈、透明的溶液。然后將熔化液倒入膠模中，令其固化。凝固后，瓊脂糖形成一種固體基質(zhì)，其密度取決于瓊脂糖的濃度。不同濃度瓊脂糖凝膠的分離范圍瓊脂糖濃度（%）分離線狀DNA分子的范圍（kbp）0.35~600.61~200.70.8~100.90.5~71.20.4~61.50.2~42.00.1~3凝膠電泳成像圖譜二、聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺（acrylamide，簡(jiǎn)稱Acr）和交聯(lián)劑（crosslinker）N，N-甲叉雙丙烯酰胺（methylene-bisacrylamide，簡(jiǎn)稱Bis）交聯(lián)成的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠。該凝膠孔徑小、透明、彈性好、無紫外吸收，可用于DNA、蛋白質(zhì)等的分離。DNA在聚丙烯酰胺凝膠中的有效分離范圍聚丙烯酰胺濃度（%）有效分離范圍（bp）3.5100~10005.080~5008.060~40012.040~20020.010~100三、凝膠電泳分離后核酸片段的回收及純化方法：電泳洗脫法、DEAE纖維素膜插片法、低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳挖塊法、凍融法、玻璃奶法、QIAEX法等。DEAE纖維素膜插片法簡(jiǎn)便易行，回收率、純度都很高，對(duì)回收500bp~5kb左右大小的DNA片段效果很好。電泳洗脫法對(duì)大于5kb的DNA片段較適合。凍融法、SDS溶液浸出法等方法都極為簡(jiǎn)便，但純度與回收率較差。將低熔點(diǎn)瓊脂糖挖塊與玻璃奶法結(jié)合，可回收到質(zhì)量較好的DNA片段。第三節(jié)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerasechainreaction，

PCR）概念:在引物存在的條件下、以DNA為模板、由DNA聚合酶催化的對(duì)特定基因或DNA序列進(jìn)行體外快速擴(kuò)增的反應(yīng)，故又稱為基因的體外擴(kuò)增法。美國(guó)Cetus公司科學(xué)家K.B.Mullis于1983年發(fā)明一、PCR技術(shù)的基本原理及特點(diǎn)雙鏈DNA分子在臨近沸點(diǎn)的溫度下便會(huì)分離成兩條單鏈的DNA分子，當(dāng)溫度降低時(shí)，DNA聚合酶以單鏈DNA為模板并利用反應(yīng)混合物中的引物和四種脫氧核苷三磷酸（dNTPs）合成新生的DNA互補(bǔ)鏈。PCR擴(kuò)增能力是十分驚人的，理論上講經(jīng)過30次的循環(huán)反應(yīng)，便可使靶DNA得到109倍的擴(kuò)增，但實(shí)際上大約是106~107倍的擴(kuò)增。正因?yàn)镻CR技術(shù)具有如此高的擴(kuò)增敏感性，意味著分子生物學(xué)分析只需要含有痕量DNA的樣品，包括一根頭發(fā)、血跡等。這對(duì)于法醫(yī)學(xué)鑒定具有特別的應(yīng)用價(jià)值。同時(shí)，應(yīng)當(dāng)注意，任何DNA樣品或?qū)嶒?yàn)試劑均應(yīng)仔細(xì)避免發(fā)生污染，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確、可靠。二、PCR反應(yīng)體系與條件優(yōu)化標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系：50μl~100μl體積，包括：模板DNA，底物（dNTP），TaqDNA聚合酶（2.5U），2條引物（各0.25μmol/L），KCl（50mmol/L），Tris·HCl（10mmol/L，pH8.4），MgCl2（1.5mmol/L），明膠或牛血清白蛋白（BSA）（1μg/ml）。1.PCR反應(yīng)模板（1）種類：可來自任何生物的單鏈或雙鏈DNA，也可以是用化學(xué)方法合成的。（2）數(shù)量：一般而言，PCR檢測(cè)可以用納克（ng）級(jí)的DNA克隆模板或微克（μg）級(jí)的基因組DNA，或者是拷貝數(shù)為105的目的DNA片段。（3）純度：對(duì)樣本純度的最基本要求：一是要含有至少一個(gè)包含有待擴(kuò)增片段的完整的分子，二是其他的不純物的濃度不會(huì)抑制酶的活性。傳統(tǒng)的DNA純化方法完全可以滿足PCR反應(yīng)要求。2.PCR反應(yīng)的緩沖液PCR反應(yīng)中緩沖液是一個(gè)重要的影響因素。Mg2＋濃度非常重要，它是PCR反應(yīng)中DNA聚合酶的輔助因子。反應(yīng)體系中許多成分都結(jié)合Mg2＋，包括引物、模板、PCR產(chǎn)物和dNTP。通常，Mg2＋的總濃度必須超過dNTP的總濃度。在一般的PCR反應(yīng)中，1.5~2.0mmol/LMg2＋是比較合適的（對(duì)應(yīng)dNTP濃度為200μmol/L左右）。

3.底物（脫氧核糖核苷三磷酸，dNTPs）濃度PCR反應(yīng)中，dNTP濃度應(yīng)在20~200μmol/L，高濃度dNTP可加快反應(yīng)速度，但同時(shí)會(huì)增加堿基的錯(cuò)誤摻入率和實(shí)驗(yàn)成本；低濃度dNTP雖會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)速度下降，但可提高實(shí)驗(yàn)的精確性。4種dNTP在使用時(shí)必須以等當(dāng)量濃度配制，以減少錯(cuò)配誤差。此外，由于dNTP可能與Mg2+結(jié)合，因此應(yīng)注意二者濃度之間的關(guān)系。4.PCR反應(yīng)的DNA聚合酶100μl反應(yīng)體系中，一般所需TaqDNA聚合酶的用量為0.5~5U。根據(jù)擴(kuò)增片段的長(zhǎng)短及其復(fù)雜程度（G＋C含量）不同而有所區(qū)別。使用TaqDNA聚合酶濃度過高，會(huì)引起非特異產(chǎn)物的擴(kuò)增；濃度過低則合成產(chǎn)物量減少。5.PCR反應(yīng)的引物（1）引物設(shè)計(jì)原則PCR引物通常長(zhǎng)15~25堿基，其中G＋C約占50%。引物之間不能互配形成雙鏈結(jié)構(gòu)，引物內(nèi)部也不能形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。引物的3’末端必須與目的片段完全相配。引物的5’末端可以不與目的片段互補(bǔ)，可以包含內(nèi)切酶位點(diǎn)或啟動(dòng)子序列，但在下一輪反應(yīng)中，這些序列會(huì)被同樣合成。（2）引物Tm加熱可以打開雙鏈結(jié)構(gòu)，當(dāng)一半分子為單鏈而另外一半分子仍處于雙鏈狀態(tài)時(shí)的溫度稱為該雙鏈DNA的熔解溫度，即Tm。由于G·C堿基對(duì)間的氫鍵數(shù)較A·T堿基對(duì)間的多，故G·C含量高的DNA的Tm值也較高。PCR反應(yīng)中引物濃度一般為0.1~0.5μmol/L，引物濃度偏高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異性產(chǎn)物擴(kuò)增，同時(shí)會(huì)增加引物之間形二聚體的幾率。6.PCR反應(yīng)條件的選擇94℃，30秒可使各種復(fù)雜的DNA分子完全變性。復(fù)性溫度的選擇，可以根據(jù)引物的長(zhǎng)度及其G＋C含量確定。長(zhǎng)度在15~25bp之間時(shí)，退火溫度可通過Tm=4（G＋C）＋2（A＋T）計(jì)算得到。退火時(shí)間設(shè)置為30秒鐘。PCR反應(yīng)的延伸溫度建議選擇的72℃，此時(shí)，TaqDNA聚合酶具有最高活性。PCR延伸反應(yīng)的時(shí)間，可根據(jù)待擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度而定，一般1kb以內(nèi)的片段，延伸時(shí)間1分鐘即可，擴(kuò)增10kb片段時(shí)，其延伸時(shí)間可達(dá)到15分鐘。PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度。理論上20~25次循環(huán)之后，PCR產(chǎn)物的積累即可達(dá)到最大值。三、PCR技術(shù)拓展與應(yīng)用包括錨定PCR（anchoredPCR），反向PCR（reversePCR），不對(duì)稱PCR（asymmetricPCR），RT-PCR和多重PCR（multiplexPCR）等。1.反向PCR反向PCR（reversePCR）用于擴(kuò)增位于靶DNA區(qū)段之外的兩側(cè)的未知DNA序列。圖3-9反向PCR示意圖2.不對(duì)稱PCR不對(duì)稱PCR技術(shù)（asymmetricPCR）可用于制備單鏈模板DNA。方法中的兩種引物濃度相差100倍，其它方面與標(biāo)準(zhǔn)PCR并沒有本質(zhì)的區(qū)別。低濃度引物的叫限制引物，一般為0.5~1.0pmol。在限制引物被用完之前，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物當(dāng)中主要是雙鏈DNA，而且以指數(shù)方式上升。大約25個(gè)循環(huán)后，只剩下的高濃度的引物。此時(shí)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物則只有雙鏈DNA中的某一條鏈，以線性而非指數(shù)方式增加。3.RT-PCRPCR技術(shù)用于擴(kuò)增被反轉(zhuǎn)錄成cDNA形式的特定RNA序列，稱為RT-PCR。4.多重PCR（multiplexPCR）同一反應(yīng)體系中加入多對(duì)引物，擴(kuò)增同一模板的幾個(gè)區(qū)域。主要應(yīng)用領(lǐng)域是檢測(cè)特定序列的存在或缺失。若待檢測(cè)的基因片段存在，經(jīng)PCR可以產(chǎn)生擴(kuò)增區(qū)帶；而如果該段缺失，則PCR反應(yīng)后不出現(xiàn)擴(kuò)增區(qū)帶。第四節(jié)核酸分子雜交技術(shù)根據(jù)核酸變性和復(fù)性的性質(zhì)，應(yīng)用核酸探針檢測(cè)靶基因或靶序列的技術(shù)方法，是分子生物學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用最為廣泛的技術(shù)之一。具有靈敏度高、快捷、簡(jiǎn)便易行等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于基因克隆的篩選、酶切圖譜的制作、基因序列的定量和定性分析以及基因突變的檢測(cè)等。一、核酸雜交的原理利用具有同源性的兩條核酸單鏈在一定的條件下退火，可按堿基互補(bǔ)原則形成雙鏈，如果這兩條鏈的來源不同，則形成雜交分子。核酸分子雜交實(shí)驗(yàn)通常包括兩步：

核酸印跡（nucleicacidblotting）轉(zhuǎn)移：將核酸樣品轉(zhuǎn)移到固體支持物濾膜上。主要有電泳凝膠核酸印跡法、斑點(diǎn)和狹線印跡法（dotandslotblotting）、菌落和噬菌斑印跡法（colonyandplaqueblotting）；雜交反應(yīng)：將具有核酸印跡的濾膜與帶有放射性標(biāo)記或其它標(biāo)記的DNA或RNA探針進(jìn)行雜交。所以有時(shí)也稱這類核酸分子雜交為印跡雜交。二、核酸探針的制備核酸分子探針:是指特定的已知核酸片段，能與互補(bǔ)核酸序列退火雜交，因此可以用于待測(cè)核酸樣品中特定基因順序的探測(cè)。要實(shí)現(xiàn)對(duì)核酸探針分子的有效探測(cè)，必須將探針分子用一定的示蹤物（即標(biāo)記物）進(jìn)行標(biāo)記。探針的種類及其選擇根據(jù)來源及其性質(zhì):

基因組DNA探針：（----）

cDNA探針：

RNA探針：人工合成的寡核苷酸探針注意:并不是任意一段核酸片度都可以作為探針的。探針的選擇正確與否，會(huì)直接影響雜交結(jié)果的分析。各種標(biāo)記物及其選擇一種理想的探針標(biāo)記物，應(yīng)具備以下幾種特性：①標(biāo)記前后探針的基本結(jié)構(gòu)不變，標(biāo)記物不影響探針的化學(xué)性質(zhì)、雜交特異性、Tm值等；②可以通過采取一定措施達(dá)到較高的靈敏度（如延長(zhǎng)曝光時(shí)間或用增感屏來增加訊號(hào)的強(qiáng)度）；③特異性強(qiáng)、本底低，重復(fù)性好，并且操作簡(jiǎn)單、省時(shí)；④穩(wěn)定、安全、經(jīng)濟(jì)、無污染。目前用于分子雜交的探針標(biāo)記物已有20多種，可分為放射性和非放射性兩大類。①容易造成放射性污染；②當(dāng)標(biāo)記活性極高時(shí)，放射線會(huì)造成核酸分子結(jié)構(gòu)的破壞；③多數(shù)放射性核素的半衰期都比較短，必須隨用隨標(biāo)記，標(biāo)記后立即使用，不能長(zhǎng)期存放（3H與14C除外）。1.放射性核素

放射性核素的靈敏度極高，可檢測(cè)到10