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文檔簡(jiǎn)介

第四章DNA的復(fù)制

本章重點(diǎn)回顧遺傳中心法則和DNA的半保留復(fù)制以及逆轉(zhuǎn)錄的過程和機(jī)理。

DNA是絕大多數(shù)生物體遺傳信息的載體,繼1953年Watson&Crick提出DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型后,1958年,Crick提出了“中心法則”(Centraldogma)揭示了遺傳信息的傳遞規(guī)律。遺傳信息傳遞的中心法則

蛋白質(zhì)翻譯轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄復(fù)制復(fù)制DNARNA

生物的遺傳信息以密碼的形式儲(chǔ)存在DNA分子上,表現(xiàn)為特定的核苷酸排列順序。在細(xì)胞分裂的過程中,通過DNA復(fù)制把親代細(xì)胞所含的遺傳信息忠實(shí)地傳遞給兩個(gè)子代細(xì)胞。在子代細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育過程中,這些遺傳信息通過轉(zhuǎn)錄傳遞給RNA,再由RNA通過翻譯轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的蛋白質(zhì)多肽鏈上的氨基酸排列順序,由蛋白質(zhì)執(zhí)行各種各樣的生物學(xué)功能,使后代表現(xiàn)出與親代相似的遺傳特征。

后來人們又發(fā)現(xiàn),在宿主細(xì)胞中一些RNA病毒能以自己的RNA為模板復(fù)制出新的病毒RNA,還有一些RNA病毒能以其RNA為模板合成DNA,稱為逆轉(zhuǎn)錄這是中心法則的補(bǔ)充。

中心法則總結(jié)了生物體內(nèi)遺傳信息的流動(dòng)規(guī)律,揭示遺傳的分子基礎(chǔ),不僅使人們對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育、遺傳、變異等生命現(xiàn)象有了更深刻的認(rèn)識(shí),而且以這方面的理論和技術(shù)為基礎(chǔ)發(fā)展了基因工程,給人類的生產(chǎn)和生活帶來了深刻的革命。DNA半保留復(fù)制的概念

DNA在復(fù)制時(shí),兩條鏈解開分別作為模板,在DNA聚合酶的催化下按堿基互補(bǔ)的原則合成兩條與模板鏈互補(bǔ)的新鏈,以組成新的DNA分子。這樣新形成的兩個(gè)DNA分子與親代DNA分子的堿基順序完全一樣。由于子代DNA分子中一條鏈來自親代,另一條鏈?zhǔn)切潞铣傻模@種復(fù)制方式稱為半保留復(fù)制。原核生物DNA聚合反應(yīng)有關(guān)的酶類(1)DNA聚合酶(DNApolymetases)(2)引物酶(peimase)和引發(fā)體(primosome):?jiǎn)?dòng)RNA引物鏈的合成。

(3)DNA連接酶(DNAligase)(4)DNA解鏈酶(DNAhelicase)(5)單鏈結(jié)合蛋白(single-strandbindingprotein,SSB):結(jié)合在解開的DNA單鏈上,防止重新形成雙螺旋。

(6)拓?fù)洚悩?gòu)酶(topoisomerase):兼具內(nèi)切酶和連接酶活力,能迅速將DNA超螺旋或雙螺旋緊張狀態(tài)變成松馳狀態(tài),便于解鏈。解旋酶DNA聚合酶III解鏈酶RNA引物引物酶和引發(fā)體DNA聚合酶ISSB3′3′5′3′5′5′RNA引物DNA聚合酶催化的鏈延長(zhǎng)反應(yīng)5′RNA引物子鏈3′3′5′5′3′3′5′5′3′3′5′模板鏈大腸桿菌三種DNA聚合酶比較DNA聚合酶Ⅱ分子量每個(gè)細(xì)胞的分子統(tǒng)計(jì)數(shù)5′-3′聚合酶作用3′-5′核酸外切酶作用5′-3′核酸外切酶作用轉(zhuǎn)化率DNA聚合酶Ⅰ109,000400+++1120,000100++-0.05400,00010-20++-50比較項(xiàng)目DNA聚合酶

切除引物修復(fù)修復(fù)復(fù)制功能

1999年發(fā)現(xiàn)聚合酶

,它們涉及DNA的錯(cuò)誤傾向修復(fù)(erroounerepair)DNA聚合酶的3′-5′外切酶水解位點(diǎn)3′3′5′5′錯(cuò)配堿基3′-5′核酸外切酶水解位點(diǎn)DNA聚合酶5′-3′外切酶活力

5′-3′核酸外切酶水解位點(diǎn)單鏈缺口5′連接酶連接切口Mg2+連接酶ATP或NAD+AMP+PPi或NMN+AMPATCGPTTPPPAACCTGAPACPPPPOHTGGATCGPTTPPPAACCTGAPACPPPTGGP缺口3'3'5'5'5'5'3'3'模板鏈模板鏈DNA的雙向和單向復(fù)制環(huán)狀

DNA復(fù)制時(shí)所形成的Q結(jié)構(gòu)起始點(diǎn)復(fù)制叉的推進(jìn)復(fù)制叉起始點(diǎn)起始點(diǎn)起始點(diǎn)復(fù)制叉復(fù)制叉未復(fù)制DNA單向復(fù)制雙向復(fù)制原核細(xì)胞DNA的半不連續(xù)復(fù)制復(fù)制過程

復(fù)制叉的移動(dòng)方向解旋酶DNA聚合酶III解鏈酶RNA引物引物體DNA聚合酶ISSB3′3′5′前導(dǎo)鏈隨后鏈3′5′復(fù)制的起始DNA鏈的延長(zhǎng)DNA鏈終止5′RNA引物3′3′復(fù)制的忠實(shí)性DNA復(fù)制過程是一個(gè)高度精確的過程,據(jù)估計(jì),大腸桿菌DNA復(fù)制5

109堿基對(duì)僅出現(xiàn)一個(gè)誤差,保證復(fù)制忠實(shí)性的原因主要有以下三點(diǎn):

DNA聚合酶的高度專一性(嚴(yán)格遵循堿基配對(duì)原則,但錯(cuò)配率為7

10-6

DNA聚合酶的校對(duì)功能(錯(cuò)配堿基被3’-5’

外切酶切除)

起始時(shí)以RNA作為引物真核細(xì)胞DNA復(fù)制的特點(diǎn)

多個(gè)起點(diǎn)復(fù)制起點(diǎn)起點(diǎn)起點(diǎn)起點(diǎn)起點(diǎn)起點(diǎn)

真核生物的DNA聚合酶端粒(telemere)復(fù)制真核生物的DNA聚合酶DNA聚合酶

分子量亞基數(shù)細(xì)胞內(nèi)分布酶活力百分比外切酶活力DNA聚合酶

110-23,000多個(gè)細(xì)胞核~80%無120,000一個(gè)細(xì)胞核和線粒體2~15%無-400,000一個(gè)細(xì)胞核+10~25%5

-3

外切酶DNA聚合酶

DNA聚合酶

45,000一個(gè)細(xì)胞核10~15%無端粒酶(telomerase)DNA復(fù)制需要引物,但在線形DNA分子末端不可能通過正常的機(jī)制在引物被降解后合成相應(yīng)的片段。如果沒有特殊的機(jī)制合成末端序列,染色體就會(huì)在細(xì)胞傳代中變得越來越短。這一難題是通過端粒酶的發(fā)現(xiàn)才得到了澄清。端粒酶是一種含RNA的蛋白復(fù)合物,實(shí)質(zhì)上是一種逆轉(zhuǎn)錄酶,它能催化互補(bǔ)于RNA模板的DNA片段的合成,使復(fù)制以后的線形DNA分子的末端保持不變。

初步研究表明,人體中生殖細(xì)胞的端粒長(zhǎng)度保持不變,而體細(xì)胞的端粒長(zhǎng)度則隨個(gè)體的老化而逐步縮短。對(duì)此的一個(gè)推論是:人的生殖細(xì)胞具端粒酶的活力,體細(xì)胞則否。這一問題的解決無疑會(huì)有助于對(duì)生命衰老的認(rèn)識(shí)。5′3′AAAACCCCAAAACCCCCCA端粒酶真核和原核DNA細(xì)胞復(fù)制比較第五章DNA損傷、修復(fù)第一節(jié)誘變一、突變1、概念:

DNA分子中的核苷酸序列發(fā)生突然而穩(wěn)定的改變,從而導(dǎo)致DNA的復(fù)制以及后來的轉(zhuǎn)錄和翻譯產(chǎn)物隨之發(fā)生變化,表現(xiàn)出異常的遺傳特性,稱為DNA的突變。突變:DNA損傷和錯(cuò)配得不到修復(fù)而引起的遺傳重組:不同DNA分子之間的交換而引起的

最簡(jiǎn)單的突變是點(diǎn)突變,即一個(gè)單一堿基的改變。點(diǎn)突變可以是轉(zhuǎn)換(嘌呤與嘌呤之間,嘧啶與嘧啶之間互換)或顛換(嘌呤與嘧啶之間發(fā)生互換)。

突變是DNA堿基序列水平上的永久性的、可遺傳的改變。突變產(chǎn)生于DNA復(fù)制或減數(shù)分裂重組過程中的自發(fā)性錯(cuò)誤,或者是由于物理或化學(xué)試劑損傷DNA所致。

沉默突變:如果它發(fā)生在DNA的非編碼區(qū)、非調(diào)節(jié)區(qū)或密碼子的第3個(gè)堿基位置,并不影響摻進(jìn)蛋白質(zhì)中的氨基酸。錯(cuò)義突變:如果改變了基因產(chǎn)物的1個(gè)氨基酸,則是錯(cuò)義突變。錯(cuò)義突變的效應(yīng)可以是無作用的,也可以是致死的,這取決于被影響的氨基酸。無義突變:形成新的終止密碼子的突變是無義突變,結(jié)果會(huì)產(chǎn)生截短了的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。2、突變的類型

移碼突變:插入或缺失涉及一個(gè)或多個(gè)堿基的增加或丟失,這會(huì)引起基因的移碼突變。移碼突變的結(jié)果是所翻譯出的蛋白質(zhì)序列從突變點(diǎn)起至C末端都完全被改變了。癌變:影響細(xì)胞生長(zhǎng)或細(xì)胞死亡過程的突變可以引發(fā)癌變。

DNA突變的類型-T-C-T-G-C-T-G-T-A-C-G--A-G-A-C-G-A-C-A-T-G-C-轉(zhuǎn)換野生型基因

-T-C-G-A-C-T-G-T-A-C-G--A-G-C-T-G-A-C-A-T-G-C-

-T-C-T-T-C-T-G-T-A-C-G--A-G-A-A-G-A-C-A-T-G-C-顛換堿基對(duì)的置換(substitution)移碼突變(framesshiftmutation)

-T-C-T-C-G-C-T-G-T-A-C-G--A-G-A-G-C-G-A-C-A-T-G-C-插入

-T-C-G-C-T-G-T-A-C-G--A-G-C-G-A-C-A-T-G-C-缺失AT二、復(fù)制的忠實(shí)性

DNA復(fù)制過程是一個(gè)高度精確的過程,據(jù)估計(jì),大腸桿菌DNA復(fù)制5

109堿基對(duì)僅出現(xiàn)一個(gè)誤差,保證復(fù)制忠實(shí)性的原因主要有以下三點(diǎn):

DNA聚合酶的高度專一性(嚴(yán)格遵循堿基配對(duì)原則,但錯(cuò)配率為7

10-6

DNA聚合酶的校對(duì)功能(錯(cuò)配堿基被3’-5’

外切酶切除)

起始時(shí)以RNA作為引物DNA聚合酶的校對(duì)功能

5′-核酸外切酶3′-核酸外切酶裂縫聚合中心裂縫內(nèi)部DNA聚合酶的校對(duì)功能聚合酶錯(cuò)配鹼基復(fù)制方向正確核苷酸5′5′5′3′3′3′切除錯(cuò)配核苷酸起始時(shí)以RNA作為引物的作用

DNA復(fù)制為什么要合成一個(gè)RNA引物,而后又把這個(gè)引物消除呢?這是保證DNA聚合過程高度精確的又一措施。已知DNA聚合酶具有35外切酶功能校對(duì)復(fù)制過程中的核苷酸,也就是說聚合酶在開始形成一個(gè)新的磷酸二酯鍵前,總是檢查前一個(gè)堿基是否正確,這就決定了它不能從頭開始合成。因此先合成一條低忠實(shí)性的多核苷酸來開始DNA的合成,并以核糖核苷酸來表示是“暫時(shí)”的,當(dāng)DNA開始聚合以后再以53外切酶的功能切除,以高忠實(shí)性的脫氧核苷酸取而代之,確保復(fù)制的忠實(shí)性。三、誘變劑的類型與作用

物理誘變劑:紫外線(ultraviolet)和電離輻射(ionizingradiation):紫外線引起相鄰嘧啶堿基產(chǎn)生嘧啶二聚體。

化學(xué)誘變劑:

如堿基類似物(baseanalog):

堿基修飾劑(basemodifier)

嵌入染料(intercalationdye)

烷化劑等

堿基類似物(baseanalog):改變堿基配對(duì)特性的正常堿基衍生物,可誘發(fā)直接誘變。

亞硝酸:使胞嘧啶脫氨變成尿嘧啶(圖F1.2),從而和腺嘌呤配對(duì),引起隨后復(fù)制中發(fā)生G·C向A·T轉(zhuǎn)換。

烷化劑:如甲烷磺酸甲酯(methylmethanesulfonate,MMS)、乙基亞硝基尿(ethylnitrosourea,ENU)及芳基化劑須經(jīng)修復(fù)才能防止給轉(zhuǎn)錄及復(fù)制過程帶來嚴(yán)重破壞

嵌入劑:會(huì)產(chǎn)生插入突變和缺失突變。絕大部分化學(xué)誘變劑是致癌劑,誘發(fā)癌癥四、誘變

直接誘變:直接誘變是起因于DNA中存在穩(wěn)定的、改變了的配對(duì)特性的未修復(fù)的堿基。

間接誘變:一些損傷DNA聚合酶只是為了保證染色體的完整性在損傷對(duì)應(yīng)的位點(diǎn)上插入錯(cuò)誤的堿基,這就叫間接誘變。

第二節(jié)

DNA的損傷

某些物理化學(xué)因子,如紫外線、電離輻射和化學(xué)誘變劑等,都有引起生物突變和致死的作用,其機(jī)理是作用于DNA,造成DNA結(jié)構(gòu)和功能的破壞,稱為DNA的損傷。一、DNA損傷

DNA正常的化學(xué)或物理結(jié)構(gòu)的改變。

外源化學(xué)試劑或射線對(duì)DNA的化學(xué)作用會(huì)導(dǎo)致其化學(xué)或物理結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。這些變化也許會(huì)阻斷復(fù)制或轉(zhuǎn)錄,結(jié)果是致死性的;或者會(huì)通過直接或間接誘變產(chǎn)生突變。DNA的化學(xué)不穩(wěn)定性可產(chǎn)生自發(fā)性損傷如脫氨和脫嘌呤。

堿基的化學(xué)特性的變化會(huì)導(dǎo)致不能配對(duì)或錯(cuò)配(如一個(gè)改變了的A可能會(huì)與C而不是與T配對(duì))。如果這種損傷允許在DNA中保留下來,這一突變就會(huì)通過直接誘變或間接誘變而被固定下來。或者這些化學(xué)改變也可能造成DNA的結(jié)構(gòu)變形從而阻斷復(fù)制、轉(zhuǎn)錄,導(dǎo)致細(xì)胞死亡。因此DNA損傷可以是致突變和(或)致死。

胞嘧啶:會(huì)自發(fā)地水解脫氨變成尿嘧啶。脫嘌呤:作用是在嘌呤的糖苷鍵發(fā)生斷裂的自發(fā)水解反應(yīng),DNA因此失去了嘌呤堿基。脫嘧啶:也可能發(fā)生,但頻率很低。

二、氧化性損傷

在所有需氧細(xì)胞中由于超氧化物、氫過氧化物及最重要的羥基自由基等活性氧(ROS)的存在,會(huì)在正常條件下會(huì)發(fā)生氧化損傷。這些自由基可在許多位點(diǎn)上攻擊DNA,產(chǎn)生一系列特性變化了的氧化產(chǎn)物,如8—氧化鳥嘌呤,2—氧化腺嘌呤和5—羥甲基尿嘧啶(圖F2.1)。電離輻射引起的水輻射分解所產(chǎn)生的羥基自由基會(huì)提高這些氧化產(chǎn)物的水平。三、烷基化

烷化劑可將烷基(如甲基)加入到核酸上各種位點(diǎn)的親電化學(xué)試劑,但其加入位點(diǎn)有別于正常甲基化酶的甲基化位點(diǎn)。常見的烷基化試劑有MMS和ENU(圖F2.2a)。甲基化堿基的典型例子是7—甲基鳥嘌呤、3—甲基腺嘌呤、3—甲基鳥嘌呤和O6—甲基鳥嘌呤(圖F2.2b)。這些損傷中的部分由于會(huì)在DNA復(fù)制及轉(zhuǎn)錄時(shí)干擾DNA解旋,因而可能是致死的。絕大部分是間接誘變損傷;而O6—甲基鳥嘌呤由于可在復(fù)制中與胸腺嘧啶配對(duì),產(chǎn)生直接誘變損傷。四、聚化加合物

紫外線照射可通過DNA鏈上相鄰嘧啶每個(gè)堿基的C5雙鍵和C6碳原子環(huán)化形成一個(gè)環(huán)丁烷環(huán)從而形成環(huán)丁烷嘧啶二聚體(圖F2.3a)。結(jié)果不能與其相對(duì)應(yīng)的鏈進(jìn)行堿基配對(duì),導(dǎo)致DNA局部變性,產(chǎn)生破壞復(fù)制與轉(zhuǎn)錄的大塊損傷。

另一種嘧啶二聚體6,4—光產(chǎn)物,則是由一個(gè)嘧啶上的C6和其相鄰堿基上的C4間生成鍵后形成的(見圖F2.3a中環(huán)上的碳數(shù)字)。當(dāng)煤焦油中的致癌物苯并芘在肝內(nèi)由細(xì)胞色素P—450代謝后,其中的一種代謝物(一種二醇環(huán)氧化物)可與鳥嘌呤殘基共價(jià)結(jié)合(圖F2.3b)。許多其他芳香族烷化劑均能與DNA形成共價(jià)加合物。致癌物黃曲霉毒素Bl(aflatoxirB,)也可與DNA共價(jià)結(jié)合,導(dǎo)入大塊加合物,從而在DNA復(fù)制過程中改變遺傳信息。第三節(jié)

DNA的修復(fù)DNA的修復(fù)主要有以下類型:暗修復(fù)五、錯(cuò)配修復(fù)一、光裂合酶修復(fù)二、烷基轉(zhuǎn)移酶

三、切除修復(fù)四、重組修復(fù)DNA光解酶可切開嘧啶二聚體的環(huán)丁烷恢復(fù)其DNA的原初結(jié)構(gòu)。光解酶含有可吸收藍(lán)光為反應(yīng)提供所需能量的色素分子。

1.光復(fù)活(光裂合酶修復(fù))DNA紫外線損傷的光裂合酶修復(fù)1、形成嘧啶二聚體2、光復(fù)合酶結(jié)合于損傷部位3、酶被可見光激活4、修復(fù)后酶被釋放

烷基轉(zhuǎn)移酶是一種可誘導(dǎo)的蛋白質(zhì),可特異地從鳥嘌呤的O6位置移去一個(gè)烷基,將其轉(zhuǎn)移到蛋白質(zhì)自身,同時(shí)導(dǎo)致該蛋白質(zhì)失活。

2.烷基轉(zhuǎn)移酶

在核苷酸切除修復(fù)中,內(nèi)切核酸酶在損傷部位兩邊切出切口,去除損傷部分而留下一個(gè)缺口,該缺口由DNA聚合酶來填補(bǔ),DNA連接酶將催化最后的磷酸二酯鍵的形成。3.切除修復(fù)

切除修復(fù)是一種普遍存在的修復(fù)機(jī)制,可在一系列的損傷中起修復(fù)作用,并且這種修復(fù)是無差錯(cuò)的。切除修復(fù)有2種形式,即核苷酸切除修復(fù)(nuclotideexcisionrepair,NER)和堿基切除修復(fù)(

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