第四章DNA的復制課件

第四章DNA的復制

本章重點回顧遺傳中心法則和DNA的半保留復制以及逆轉錄的過程和機理。

DNA是絕大多數(shù)生物體遺傳信息的載體，繼1953年Watson&Crick提出DNA雙螺旋結構模型后，1958年，Crick提出了“中心法則”(Centraldogma)揭示了遺傳信息的傳遞規(guī)律。遺傳信息傳遞的中心法則

蛋白質翻譯轉錄逆轉錄復制復制DNARNA

生物的遺傳信息以密碼的形式儲存在DNA分子上，表現(xiàn)為特定的核苷酸排列順序。在細胞分裂的過程中，通過DNA復制把親代細胞所含的遺傳信息忠實地傳遞給兩個子代細胞。在子代細胞的生長發(fā)育過程中，這些遺傳信息通過轉錄傳遞給RNA，再由RNA通過翻譯轉變成相應的蛋白質多肽鏈上的氨基酸排列順序，由蛋白質執(zhí)行各種各樣的生物學功能，使后代表現(xiàn)出與親代相似的遺傳特征。

后來人們又發(fā)現(xiàn)，在宿主細胞中一些RNA病毒能以自己的RNA為模板復制出新的病毒RNA，還有一些RNA病毒能以其RNA為模板合成DNA，稱為逆轉錄這是中心法則的補充。

中心法則總結了生物體內遺傳信息的流動規(guī)律，揭示遺傳的分子基礎，不僅使人們對細胞的生長、發(fā)育、遺傳、變異等生命現(xiàn)象有了更深刻的認識，而且以這方面的理論和技術為基礎發(fā)展了基因工程，給人類的生產和生活帶來了深刻的革命。DNA半保留復制的概念

DNA在復制時，兩條鏈解開分別作為模板，在DNA聚合酶的催化下按堿基互補的原則合成兩條與模板鏈互補的新鏈，以組成新的DNA分子。這樣新形成的兩個DNA分子與親代DNA分子的堿基順序完全一樣。由于子代DNA分子中一條鏈來自親代，另一條鏈是新合成的，這種復制方式稱為半保留復制。原核生物DNA聚合反應有關的酶類（1）DNA聚合酶(DNApolymetases)（2）引物酶(peimase)和引發(fā)體(primosome)：啟動RNA引物鏈的合成。

(3）DNA連接酶（DNAligase）（4）DNA解鏈酶(DNAhelicase)(5）單鏈結合蛋白(single-strandbindingprotein,SSB)：結合在解開的DNA單鏈上，防止重新形成雙螺旋。

(6）拓撲異構酶(topoisomerase):兼具內切酶和連接酶活力，能迅速將DNA超螺旋或雙螺旋緊張狀態(tài)變成松馳狀態(tài)，便于解鏈。解旋酶DNA聚合酶III解鏈酶RNA引物引物酶和引發(fā)體DNA聚合酶ISSB3′3′5′3′5′5′RNA引物DNA聚合酶催化的鏈延長反應5′RNA引物子鏈3′3′5′5′3′3′5′5′3′3′5′模板鏈大腸桿菌三種DNA聚合酶比較DNA聚合酶Ⅱ分子量每個細胞的分子統(tǒng)計數(shù)5′-3′聚合酶作用3′-5′核酸外切酶作用5′-3′核酸外切酶作用轉化率DNA聚合酶Ⅰ109，000400+++1120，000100++-0.05400，00010-20++-50比較項目DNA聚合酶

切除引物修復修復復制功能

1999年發(fā)現(xiàn)聚合酶

和

，它們涉及DNA的錯誤傾向修復（erroounerepair）DNA聚合酶的3′-5′外切酶水解位點3′3′5′5′錯配堿基3′-5′核酸外切酶水解位點DNA聚合酶5′-3′外切酶活力

5′-3′核酸外切酶水解位點單鏈缺口5′連接酶連接切口Mg2+連接酶ATP或NAD＋AMP+PPi或NMN+AMPATCGPTTPPPAACCTGAPACPPPPOHTGGATCGPTTPPPAACCTGAPACPPPTGGP缺口3'3'5'5'5'5'3'3'模板鏈模板鏈DNA的雙向和單向復制環(huán)狀

DNA復制時所形成的Q結構起始點復制叉的推進復制叉起始點起始點起始點復制叉復制叉未復制DNA單向復制雙向復制原核細胞DNA的半不連續(xù)復制復制過程

復制叉的移動方向解旋酶DNA聚合酶III解鏈酶RNA引物引物體DNA聚合酶ISSB3′3′5′前導鏈隨后鏈3′5′復制的起始DNA鏈的延長DNA鏈終止5′RNA引物3′3′復制的忠實性DNA復制過程是一個高度精確的過程，據(jù)估計，大腸桿菌DNA復制5

109堿基對僅出現(xiàn)一個誤差，保證復制忠實性的原因主要有以下三點:

DNA聚合酶的高度專一性（嚴格遵循堿基配對原則，但錯配率為7

10-6

）

DNA聚合酶的校對功能（錯配堿基被3’-5’

外切酶切除）

起始時以RNA作為引物真核細胞DNA復制的特點

多個起點復制起點起點起點起點起點起點

真核生物的DNA聚合酶端粒（telemere）復制真核生物的DNA聚合酶DNA聚合酶

分子量亞基數(shù)細胞內分布酶活力百分比外切酶活力DNA聚合酶

110-23，000多個細胞核～80%無120，000一個細胞核和線粒體2～15%無-400，000一個細胞核+10～25%5

-3

外切酶DNA聚合酶

DNA聚合酶

45，000一個細胞核10～15%無端粒酶（telomerase）DNA復制需要引物，但在線形DNA分子末端不可能通過正常的機制在引物被降解后合成相應的片段。如果沒有特殊的機制合成末端序列，染色體就會在細胞傳代中變得越來越短。這一難題是通過端粒酶的發(fā)現(xiàn)才得到了澄清。端粒酶是一種含RNA的蛋白復合物，實質上是一種逆轉錄酶，它能催化互補于RNA模板的DNA片段的合成，使復制以后的線形DNA分子的末端保持不變。

初步研究表明，人體中生殖細胞的端粒長度保持不變，而體細胞的端粒長度則隨個體的老化而逐步縮短。對此的一個推論是：人的生殖細胞具端粒酶的活力，體細胞則否。這一問題的解決無疑會有助于對生命衰老的認識。5′3′AAAACCCCAAAACCCCCCA端粒酶真核和原核DNA細胞復制比較第五章DNA損傷、修復第一節(jié)誘變一、突變1、概念：

DNA分子中的核苷酸序列發(fā)生突然而穩(wěn)定的改變，從而導致DNA的復制以及后來的轉錄和翻譯產物隨之發(fā)生變化，表現(xiàn)出異常的遺傳特性，稱為DNA的突變。突變：DNA損傷和錯配得不到修復而引起的遺傳重組：不同DNA分子之間的交換而引起的

最簡單的突變是點突變，即一個單一堿基的改變。點突變可以是轉換（嘌呤與嘌呤之間，嘧啶與嘧啶之間互換）或顛換（嘌呤與嘧啶之間發(fā)生互換）。

突變是DNA堿基序列水平上的永久性的、可遺傳的改變。突變產生于DNA復制或減數(shù)分裂重組過程中的自發(fā)性錯誤，或者是由于物理或化學試劑損傷DNA所致。

沉默突變：如果它發(fā)生在DNA的非編碼區(qū)、非調節(jié)區(qū)或密碼子的第3個堿基位置，并不影響摻進蛋白質中的氨基酸。錯義突變：如果改變了基因產物的1個氨基酸，則是錯義突變。錯義突變的效應可以是無作用的，也可以是致死的，這取決于被影響的氨基酸。無義突變：形成新的終止密碼子的突變是無義突變，結果會產生截短了的蛋白質產物。2、突變的類型

移碼突變：插入或缺失涉及一個或多個堿基的增加或丟失，這會引起基因的移碼突變。移碼突變的結果是所翻譯出的蛋白質序列從突變點起至C末端都完全被改變了。癌變：影響細胞生長或細胞死亡過程的突變可以引發(fā)癌變。

DNA突變的類型-T-C-T-G-C-T-G-T-A-C-G--A-G-A-C-G-A-C-A-T-G-C-轉換野生型基因

-T-C-G-A-C-T-G-T-A-C-G--A-G-C-T-G-A-C-A-T-G-C-

-T-C-T-T-C-T-G-T-A-C-G--A-G-A-A-G-A-C-A-T-G-C-顛換堿基對的置換(substitution)移碼突變(framesshiftmutation)

-T-C-T-C-G-C-T-G-T-A-C-G--A-G-A-G-C-G-A-C-A-T-G-C-插入

-T-C-G-C-T-G-T-A-C-G--A-G-C-G-A-C-A-T-G-C-缺失AT二、復制的忠實性

DNA復制過程是一個高度精確的過程，據(jù)估計，大腸桿菌DNA復制5

109堿基對僅出現(xiàn)一個誤差，保證復制忠實性的原因主要有以下三點:

DNA聚合酶的高度專一性（嚴格遵循堿基配對原則，但錯配率為7

10-6

）

DNA聚合酶的校對功能（錯配堿基被3’-5’

外切酶切除）

起始時以RNA作為引物DNA聚合酶的校對功能

5′-核酸外切酶3′-核酸外切酶裂縫聚合中心裂縫內部DNA聚合酶的校對功能聚合酶錯配鹼基復制方向正確核苷酸5′5′5′3′3′3′切除錯配核苷酸起始時以RNA作為引物的作用

DNA復制為什么要合成一個RNA引物，而后又把這個引物消除呢？這是保證DNA聚合過程高度精確的又一措施。已知DNA聚合酶具有35外切酶功能校對復制過程中的核苷酸，也就是說聚合酶在開始形成一個新的磷酸二酯鍵前，總是檢查前一個堿基是否正確，這就決定了它不能從頭開始合成。因此先合成一條低忠實性的多核苷酸來開始DNA的合成，并以核糖核苷酸來表示是“暫時”的，當DNA開始聚合以后再以53外切酶的功能切除，以高忠實性的脫氧核苷酸取而代之，確保復制的忠實性。三、誘變劑的類型與作用

物理誘變劑：紫外線(ultraviolet)和電離輻射(ionizingradiation):紫外線引起相鄰嘧啶堿基產生嘧啶二聚體。

化學誘變劑:

如堿基類似物(baseanalog)：

堿基修飾劑(basemodifier)

嵌入染料(intercalationdye)

烷化劑等

堿基類似物(baseanalog)：改變堿基配對特性的正常堿基衍生物，可誘發(fā)直接誘變。

亞硝酸：使胞嘧啶脫氨變成尿嘧啶（圖F1．2），從而和腺嘌呤配對，引起隨后復制中發(fā)生G·C向A·T轉換。

烷化劑：如甲烷磺酸甲酯（methylmethanesulfonate，MMS）、乙基亞硝基尿（ethylnitrosourea，ENU）及芳基化劑須經修復才能防止給轉錄及復制過程帶來嚴重破壞

嵌入劑：會產生插入突變和缺失突變。絕大部分化學誘變劑是致癌劑，誘發(fā)癌癥四、誘變

直接誘變：直接誘變是起因于DNA中存在穩(wěn)定的、改變了的配對特性的未修復的堿基。

間接誘變：一些損傷DNA聚合酶只是為了保證染色體的完整性在損傷對應的位點上插入錯誤的堿基，這就叫間接誘變。

第二節(jié)

DNA的損傷

某些物理化學因子，如紫外線、電離輻射和化學誘變劑等，都有引起生物突變和致死的作用，其機理是作用于DNA，造成DNA結構和功能的破壞，稱為DNA的損傷。一、DNA損傷

DNA正常的化學或物理結構的改變。

外源化學試劑或射線對DNA的化學作用會導致其化學或物理結構發(fā)生變化。這些變化也許會阻斷復制或轉錄，結果是致死性的；或者會通過直接或間接誘變產生突變。DNA的化學不穩(wěn)定性可產生自發(fā)性損傷如脫氨和脫嘌呤。

堿基的化學特性的變化會導致不能配對或錯配（如一個改變了的A可能會與C而不是與T配對）。如果這種損傷允許在DNA中保留下來，這一突變就會通過直接誘變或間接誘變而被固定下來。或者這些化學改變也可能造成DNA的結構變形從而阻斷復制、轉錄，導致細胞死亡。因此DNA損傷可以是致突變和（或）致死。

胞嘧啶：會自發(fā)地水解脫氨變成尿嘧啶。脫嘌呤：作用是在嘌呤的糖苷鍵發(fā)生斷裂的自發(fā)水解反應，DNA因此失去了嘌呤堿基。脫嘧啶：也可能發(fā)生，但頻率很低。

二、氧化性損傷

在所有需氧細胞中由于超氧化物、氫過氧化物及最重要的羥基自由基等活性氧（ROS）的存在，會在正常條件下會發(fā)生氧化損傷。這些自由基可在許多位點上攻擊DNA，產生一系列特性變化了的氧化產物，如8—氧化鳥嘌呤，2—氧化腺嘌呤和5—羥甲基尿嘧啶（圖F2．1）。電離輻射引起的水輻射分解所產生的羥基自由基會提高這些氧化產物的水平。三、烷基化

烷化劑可將烷基（如甲基）加入到核酸上各種位點的親電化學試劑，但其加入位點有別于正常甲基化酶的甲基化位點。常見的烷基化試劑有MMS和ENU（圖F2．2a）。甲基化堿基的典型例子是7—甲基鳥嘌呤、3—甲基腺嘌呤、3—甲基鳥嘌呤和O6—甲基鳥嘌呤（圖F2．2b）。這些損傷中的部分由于會在DNA復制及轉錄時干擾DNA解旋，因而可能是致死的。絕大部分是間接誘變損傷；而O6—甲基鳥嘌呤由于可在復制中與胸腺嘧啶配對，產生直接誘變損傷。四、聚化加合物

紫外線照射可通過DNA鏈上相鄰嘧啶每個堿基的C5雙鍵和C6碳原子環(huán)化形成一個環(huán)丁烷環(huán)從而形成環(huán)丁烷嘧啶二聚體（圖F2．3a）。結果不能與其相對應的鏈進行堿基配對，導致DNA局部變性，產生破壞復制與轉錄的大塊損傷。

另一種嘧啶二聚體6，4—光產物，則是由一個嘧啶上的C6和其相鄰堿基上的C4間生成鍵后形成的（見圖F2．3a中環(huán)上的碳數(shù)字）。當煤焦油中的致癌物苯并芘在肝內由細胞色素P—450代謝后，其中的一種代謝物（一種二醇環(huán)氧化物）可與鳥嘌呤殘基共價結合（圖F2．3b）。許多其他芳香族烷化劑均能與DNA形成共價加合物。致癌物黃曲霉毒素Bl（aflatoxirB，）也可與DNA共價結合，導入大塊加合物，從而在DNA復制過程中改變遺傳信息。第三節(jié)

DNA的修復DNA的修復主要有以下類型:暗修復五、錯配修復一、光裂合酶修復二、烷基轉移酶

三、切除修復四、重組修復DNA光解酶可切開嘧啶二聚體的環(huán)丁烷恢復其DNA的原初結構。光解酶含有可吸收藍光為反應提供所需能量的色素分子。

1．光復活（光裂合酶修復）DNA紫外線損傷的光裂合酶修復1、形成嘧啶二聚體2、光復合酶結合于損傷部位3、酶被可見光激活4、修復后酶被釋放

烷基轉移酶是一種可誘導的蛋白質，可特異地從鳥嘌呤的O6位置移去一個烷基，將其轉移到蛋白質自身，同時導致該蛋白質失活。

2．烷基轉移酶

在核苷酸切除修復中，內切核酸酶在損傷部位兩邊切出切口，去除損傷部分而留下一個缺口，該缺口由DNA聚合酶來填補，DNA連接酶將催化最后的磷酸二酯鍵的形成。3．切除修復

切除修復是一種普遍存在的修復機制，可在一系列的損傷中起修復作用，并且這種修復是無差錯的。切除修復有2種形式，即核苷酸切除修復（nuclotideexcisionrepair，NER）和堿基切除修復（