甘藍型油菜雙隱性核發(fā)育系雄性不育兩株的細胞學(xué)觀察

甘藍型油菜雙隱性核發(fā)育系雄性不育兩株的細胞學(xué)觀察

油菜是世界著名的油料作物之一，其豐富的混合動力具有明顯的雜種優(yōu)勢。油菜雜種優(yōu)勢的利用有多種途徑,其中細胞核雄性不育是其重要途徑之一。目前發(fā)現(xiàn)的油菜細胞核雄性不育類型有單基因顯性核不育、雙基因顯性核不育、單基因隱性核不育、雙基因隱性核不育和多基因隱性核不育,其中雙基因隱性核不育是一類重要的不育源,我國審定的“油研系列”、“蜀雜系列”油菜雜交種就是利用雙基因隱性核不育選育的。這些雜交種已在我國生產(chǎn)上大面積推廣,并取得了巨大的社會經(jīng)濟效益。關(guān)于植物雄性不育花藥發(fā)育的細胞學(xué)觀察,前人已經(jīng)做了大量的研究工作。擬南芥、油菜、白菜、大豆、水稻、高粱等作物都有報道,其研究的重點在于確定花粉敗育的方式和時期。不同作物、不同類型的雄性不育系敗育的時期和特點各不相同。關(guān)于油菜雙基因隱性核不育材料敗育過程,楊光圣等已從顯微結(jié)構(gòu)和超微結(jié)構(gòu)方面進行了觀察,初步明確了其敗育的時期及特點。但有關(guān)該材料花粉母細胞的減數(shù)分裂敗育行為還未見觀察報道。因此,本研究以甘藍型油菜隱性細胞核雄性不育兩用系為材料,利用涂片法和石蠟切片法對其花粉母細胞減數(shù)分裂和小孢子的發(fā)育過程進行觀察,以進一步明確小孢子敗育的時期及特點,為油菜細胞核雄性不育機制的闡明和利用奠定基礎(chǔ)。1材料和方法1.1菜雜交油研4號系97ab系列油菜雙隱性細胞核雄性不育材料為479AB。該材料是利用從貴州油料作物研究所張瑞茂惠贈的油菜雜交種油研4號(系117AB系列雜交種)套袋自交后代中出現(xiàn)的雄性不育株與群體中可育株雜交,并連續(xù)多代兄妹交選育而成。在該群體中,表現(xiàn)不育的479A(基因型為ms1ms1ms2ms2)與表現(xiàn)可育的479B(Ms1ms1ms2ms2)僅存在一對基因差異,為近等基因系。1.2菊花發(fā)育時期的觀察油菜現(xiàn)蕾開花后,在晴朗天氣從早上9點至15點每隔1h取不育株和可育株幼小花蕾,卡諾固定液(3酒精∶1冰醋酸)中固定12～24h后,轉(zhuǎn)入70%酒精,于4℃冰箱保存。先取花蕾的1枚雄蕊壓片,用丙酸—水合氯醛—蘇木精染色,顯微觀察確定每個花蕾花藥發(fā)育的時期;再取出該花蕾中其它花藥用70%、80%、90%、95%、100%酒精逐級脫水(各2h),二甲苯透明,并按常規(guī)石蠟切片程序進行包埋,制成厚度為5μm的連續(xù)切片,用1%甲苯胺藍染色,阿拉伯樹膠干燥封片。2結(jié)果與分析2.1抽開花期的完善從苗期至現(xiàn)蕾期,不育株和可育株沒有明顯的形態(tài)差異;抽薹開花期,不育株和可育株的花朵從表型上較易加以區(qū)分,不育株的花絲短小,花藥小而干癟,其黃色發(fā)白,無粉;可育株花絲較長,花藥飽滿,呈黃色(圖1)。2.2花粉的形成過程可育株的花粉母細胞經(jīng)過正常的減數(shù)分裂和兩次有絲分裂,形成成熟花粉粒。減數(shù)分裂:①終變期:染色體濃縮變粗,有交叉狀,圓形和棒狀的,19個二價體分散在整個核內(nèi),可清楚地看到所有的染色體;②中期Ⅰ:各二價體分散排列在赤道板近旁(圖2A)。③后期Ⅰ:配對的同源染色體彼此分離,走向細胞的兩極(圖2B)。④中期Ⅱ:兩套染色體都排列在細胞的赤道面上,形成互相垂直或平行的赤道板(圖2C)。⑤后期Ⅱ:每個染色體上的2個單體分開,分別走向細胞一級,在細胞內(nèi)可看見4組染色體(圖2D)。⑥末期Ⅱ:在細胞內(nèi)形成4個新細胞核,染色體又解螺旋變?yōu)槿旧|(zhì),緊接著進行胞質(zhì)分裂,同時形成新的細胞壁,產(chǎn)生4個子細胞,即四分體(圖2E)。單核期:小孢子從四分體釋放出來以后,便立即開始花粉壁的形成(圖2F,G)。小孢子具有1個核,有的位于中間(圖2F),有的靠邊(圖2G)。隨著花粉的生長,出現(xiàn)液泡(圖2H),以后細胞內(nèi)含物增多,液泡消失。二核期:單核細胞進行一次有絲分裂形成一個大的營養(yǎng)核和一個小的生殖核,營養(yǎng)核居中,生殖核靠邊(圖2I)。三核期:此期的花粉具有三個核,即營養(yǎng)核和兩個精核(即雄配子).兩個精核是由生殖細胞進行有絲分裂形成的(圖2J)。2.3認識藥物為藥物顯身體的發(fā)育進程與可育株相比,不育株的花藥只進行了減數(shù)分裂,發(fā)育就此停止而沒有進行有絲分裂。在不育株中也觀察到了減數(shù)分裂的各個時期(圖2K～圖2P),但在后期Ⅰ部分細胞出現(xiàn)了染色體橋(圖2L、M、N),而且最后形成的有四分體和其它超數(shù)的多分孢子,即5分孢子,6分孢子(圖2P),在同一胼胝質(zhì)膜內(nèi)的小孢子大小不等(圖2O)。在同一不育花藥的雄蕊中,各花粉母細胞的發(fā)育進程不同步,分裂相從未分裂的,中期Ⅰ,中期Ⅱ,末期Ⅱ都可同時觀察到(圖2T)。另外,從整體來看不育株的發(fā)育較可育株晚一些.不育株發(fā)育到四分體時可育株已經(jīng)發(fā)育到單核后期甚至二三核期。單核小孢子及以后時期和可育株的也不同,小孢子從四分體釋放出來以后,胼胝質(zhì)很快分解了,但并沒有開始花粉壁的形成,細胞質(zhì)開始降解,最后變成一個無內(nèi)容物的空泡(圖2Q～圖2S)。2.4花粉粒不同發(fā)育時期為確定該不育材料敗育的細胞學(xué)時期,我們通過石蠟切片對不育株和可育株的花藥橫截面從造孢細胞,花粉母細胞,減數(shù)分裂,四分體,一直到成熟花粉粒各時期進行了觀察比較。四分體時期,與可育株相比,除四分體外不育株還形成其它多分體,大小也不等;小孢子釋放后沒有形成細胞壁,而且細胞逐漸降解,隨之藥室也皺縮變形(圖2a、b、c、d)。3小培養(yǎng)區(qū)分鑒定對小東北部的同核減數(shù)分裂的影響關(guān)于油菜雄性不育花藥發(fā)育的細胞學(xué)特征已經(jīng)有一些研究報道。余鳳群和傅廷棟曾根據(jù)雄性不育發(fā)生的時期及解剖學(xué)特點,將其分成無花粉囊敗育型,花粉母細胞敗育型和小孢子敗育型。其中,花粉母細胞敗育又包括花粉母細胞死亡型,擬小孢子型和減數(shù)分裂異常型。雄配子的育性與花粉母細胞減數(shù)分裂過程緊密相關(guān)。減數(shù)分裂是有性生殖生物形成配子的一種特殊的細胞分裂方式,分裂過程中,同源染色體有規(guī)律地分配到配子中,以保持世代之間遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定。本研究中,通過涂片法,我們觀察到油菜隱性核不育系減數(shù)分裂過程中一些新的異常行為。在后期Ⅰ,不育株部分細胞出現(xiàn)了染色體橋;最后形成的有四分體和其它超數(shù)的多分孢子;在同一胼胝質(zhì)膜內(nèi)的小孢子大小不一;在同一不育花藥的雄蕊中,各花粉母細胞的發(fā)育進程不同步等異常現(xiàn)象。這種現(xiàn)象與后期Ⅱ不均等分裂,及末期Ⅱ形成大小不等的核是相關(guān)的,或者說是減數(shù)分裂時染色體及其斷片的不均等分配,末期Ⅱ形成多核和不均等核,繼而圍繞核所形成的小孢子便有大小之分。高粱中,Tsvetova觀察了顯性雄性不育突變體同一花藥中不同花粉母細胞分裂不同步的現(xiàn)象。楊守萍等發(fā)現(xiàn)大豆核不育突變體中染色體落后、染色體橋、染色體不均等分離、形成大小不等的多分體等異?，F(xiàn)象。湯澤生對航天誘導(dǎo)的番茄雄性不育株的研究結(jié)果顯示減數(shù)分裂也有類似異?，F(xiàn)象。呂琳報道了木立蘆薈小孢子母細胞減數(shù)分裂的異常情況。由此可見,小孢子減數(shù)分裂異?？赡苁菍?dǎo)致油菜等一些作物小孢子敗育的重要原因之一。本研究得到的減數(shù)分裂異常的結(jié)果是前人在油菜上所未發(fā)現(xiàn)的,比楊光圣等的研究有更多的發(fā)現(xiàn)。本研究發(fā)現(xiàn)油菜雙隱性細胞核雄性不育小孢子從胼胝質(zhì)中釋放以后,胼胝質(zhì)解體但小孢子沒有開始花粉壁的形成,細胞質(zhì)也進一步解體,這與楊光圣等的研究結(jié)果相一致。盧永根等觀察了水稻花粉及花藥壁發(fā)育的超微結(jié)構(gòu),認為花粉壁發(fā)育異常與小孢子發(fā)育異常都會導(dǎo)致花粉敗育。本實驗采用了常規(guī)的壓片和石蠟切片兩種方法,通過壓片得到的結(jié)果,除了減數(shù)分裂期發(fā)現(xiàn)的異常外,四