第十五章基因重組與基因工程

基因重組與基因工程思路：定義基因重組意義（自然）方式：接合、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)座基因重組類型

定義基因工程意義（人工）基本要素原理:分、選、接、轉(zhuǎn)、篩、表臨床第一節(jié)自然界的基因轉(zhuǎn)移和重組

一、定義：

基因重組：指細(xì)胞基因組中DNA順序重新

排列組合的現(xiàn)象。二、意義：基因變種、物種演變、進(jìn)化的基礎(chǔ)三、方式：接合轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)座1．接合:指供體細(xì)胞（細(xì)菌）和受體細(xì)胞（細(xì)菌）

接觸，使DNA從一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)胞的過程。.例:較大質(zhì)粒在細(xì)菌間的轉(zhuǎn)移2．轉(zhuǎn)化：指外源DNA被引入細(xì)胞，導(dǎo)致其遺傳和生物性狀改變的過程。方式：自動(dòng)獲取外源DNA基因重組（自然）人為供給外源DNA基因工程

例：細(xì)菌抗藥性3．轉(zhuǎn)導(dǎo)：以病毒為媒介、將供體菌的DNA片段轉(zhuǎn)移到

受體菌基因組的過程。

例：噬菌體感染宿主菌

4．轉(zhuǎn)座：指可移動(dòng)的DNA序列（游動(dòng)基因）從基因組的一處移動(dòng)到另一處的過程。游動(dòng)基因介導(dǎo)形式

保守性轉(zhuǎn)座

復(fù)制性轉(zhuǎn)座種類插入序列轉(zhuǎn)座子(主)a.插入序列：轉(zhuǎn)座酶基因＋反向重復(fù)序列b.轉(zhuǎn)座子定義：可從染色體一個(gè)位點(diǎn)轉(zhuǎn)移到

另一位點(diǎn)的分散的重復(fù)序列。結(jié)構(gòu)：插入序列＋特殊序列（e.g:抗性基因）

四、類型位點(diǎn)特異重組:由整合酶催化，在兩個(gè)DNA

序列的特異位點(diǎn)間發(fā)生的整合。

2.同源重組(基本重組)

定義：發(fā)生在同源序列間的重組。(依賴DNA間同源性，不是特異性)

機(jī)制：a.產(chǎn)生中間體

b.分解中間體

第二節(jié)基因工程（重組DNA技術(shù)

）

一、定義：指在體外用人工（酶學(xué)）的方法，將目的基因與載體DNA重組，并把重組體DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞，使目的基因擴(kuò)增或表達(dá)的技術(shù)。也稱：重組DNA、重組DNA工藝學(xué)、DNA克隆、基因克隆、重組DNA技術(shù)?？寺。╟lone）：指由同一個(gè)始祖經(jīng)過無性繁殖所形成的副本或拷貝集合?？寺』韩@得同一拷貝的過程。二、意義擴(kuò)增基因、生產(chǎn)蛋白、創(chuàng)造新種

三、基本要素

酶目的基因載體基因宿主

（一）、工具酶限制性核酸內(nèi)切酶

定義：識(shí)別DNA的特異序列,并在識(shí)別位點(diǎn)或其周圍切割DNA雙鏈的一類內(nèi)切酶.

分類：I、II（常用）、III類

命名

II類酶特點(diǎn)識(shí)別點(diǎn)是DNA回文結(jié)構(gòu)

切割方式

粘性末端5’粘端3’粘端平頭末端

配伍末端識(shí)別點(diǎn)不同，末端相同（二）、目的基因

定義：是指所要研究或應(yīng)用的基因。類型：cDNA（互補(bǔ)DNA）

基因組DNA來源:①化學(xué)合成（人工合成）②基因組DNA文庫(kù)(全部基因組DNA的集合)③cDNA文庫(kù)(含全部mRNA信息)④PCR（聚合酶鏈反應(yīng)）

PCR:指在反應(yīng)體系中加入模板、dNTP、

引物、DDDP和緩沖液；經(jīng)多次（25-30）

變性、退火、延伸循環(huán)反應(yīng)；使目

基因擴(kuò)增（指數(shù)增長(zhǎng)）的過程。

（三)基因載體定義：為攜帶目的基因、實(shí)現(xiàn)無性繁殖或表達(dá)成有意義的蛋白質(zhì)而采用的DNA分子。作用：攜帶目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞。特征：1.能自主復(fù)制；拷貝數(shù)高2.有篩選標(biāo)記（如對(duì)抗菌素的抗性，某些基因產(chǎn)物的顯色反應(yīng)等。）便于重組體的篩選和鑒定。3.有克隆位點(diǎn)（外源DNA插入點(diǎn)）;常為多克隆位點(diǎn)（具有多個(gè)單一酶切位點(diǎn)）。4.分子量小，能容納較大的外源DNA。

常見：

質(zhì)粒DNA:pBR323

噬菌體DNA:pUC19粘粒病毒DNA

YAC(酵母人工染色體載體)四、基本原理過程:分、選（切）、接、轉(zhuǎn)、篩、表。1．分離目的基因。（目的基因的獲取）

2．選擇與構(gòu)建基因載體。

(切割目的基因和載體基因，便于連接。）3．連接目的基因與載體。4．重組DNA轉(zhuǎn)入受體菌（細(xì)胞）。5．篩選重組體。（含目的基因的受體菌或細(xì)胞）。6．目的基因的表達(dá)。e.g:質(zhì)粒為載體進(jìn)行DNA克隆五、臨床1.診斷

a.DNA診斷b.DNA診斷的應(yīng)用產(chǎn)前診斷攜帶者診斷

癥狀前診斷預(yù)防易感性診斷器官移植組織配型法醫(yī)2.治療

a.DNA治療（基因治療）e.g:間接體內(nèi)體細(xì)胞基因治療（exvivo）

b.生物制藥基本程序1.選擇治療性基因（目的基因）2.選擇基因載體3.選擇靶細(xì)胞（受體細(xì)胞）4.基因轉(zhuǎn)移（外源基因?qū)胧荏w細(xì)胞）。

間接方式病毒載體5.篩選外源基因（利用標(biāo)記物）6.回輸體內(nèi)（以不同方式回輸獲得治療性基因修飾后的細(xì)胞）（一）、目的基因的獲取途經(jīng)1.化學(xué)合成法。

DNA合成儀2.基因組DNA文庫(kù)中篩選。限制性內(nèi)切酶3.cDNA文庫(kù)中篩選。用于分離編碼蛋白的基因4.PCRdNTP目的基因酶、引物、模板（二）、克隆載體的選擇和構(gòu)建

a.常用載體：質(zhì)粒、噬菌體、病毒DNA。

b.目的基因離開染色體不能復(fù)制，需在載體(染色體）才能復(fù)制。

c.根據(jù)操作基因的性質(zhì)、目的對(duì)載體和目的基因進(jìn)行切割。（三）、外源基因與載體的連接原理：目的基因+載體重組DNA分子DNA連接酶方式：粘性末端自然同一酶切點(diǎn)的連接（主）不同酶切點(diǎn)的連接人工同聚物加尾連接人工接頭連接平頭連接相同或不同酶切后連接（四）、重組體DNA導(dǎo)入受體菌方式：轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)染感染受體菌條件：安全宿主菌 限制酶和重組酶缺陷 處于感受態(tài)過程：無性繁殖。重組DNA導(dǎo)入受體菌，隨受體菌生長(zhǎng)、繁殖，重組DNA分子得以復(fù)制、擴(kuò)增的過程。（五）、重組體的篩選篩選（選擇）：將培養(yǎng)基中眾多的轉(zhuǎn)化菌落（菌斑）分開，并鑒定出帶有目的基因的菌落的過程。方法：直接法抗藥性標(biāo)志選擇

標(biāo)志補(bǔ)救分子雜交法非直接法免疫化學(xué)法酶聯(lián)免疫檢測(cè)法（六）、克隆基因的表達(dá)重組DNA技術(shù)目的：獲得大量目的基因基本目的目的基因表達(dá)（蛋白質(zhì)表達(dá)）醫(yī)藥應(yīng)用蛋白表達(dá)體系表達(dá)載體的構(gòu)建受體細(xì)胞的建立表達(dá)產(chǎn)物的分離、純化意義：合成有藥用價(jià)值的蛋白或多肽方式：原核表達(dá)體系

真核表達(dá)體系第十四章基因重組與基因工程第一節(jié)自然界的基因轉(zhuǎn)移和重組

一、基因重組定義：指細(xì)胞基因組中DNA順序重新

排列組合的現(xiàn)象。二、基因重組類型：位點(diǎn)特異重組、同源重組三、方式：接合、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)座四、基本概念接合:指供體細(xì)胞（細(xì)菌）和受體細(xì)胞（細(xì)菌）接觸，使DNA從一個(gè)細(xì)胞（細(xì)菌）轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)胞（細(xì)菌）的過程。轉(zhuǎn)化：指外源DNA被引入細(xì)胞，導(dǎo)致其遺傳和生物性狀改變的過程。轉(zhuǎn)導(dǎo)：以病毒為媒介、將供體菌的DNA片段轉(zhuǎn)移到受體菌基因組的過程。轉(zhuǎn)座：游動(dòng)基因從基因組的一處移動(dòng)到另一處的過程。

第二節(jié)基因工程一、基因工程定義：指在體外用人工的方法，將目的基因與載體DNA重組，并把重組體DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞，使目的基因擴(kuò)增和表達(dá)的技術(shù)。限制性核酸內(nèi)切酶定義：識(shí)別DNA的特異序列,并在識(shí)別位點(diǎn)或其周圍切割DNA雙鏈的一類內(nèi)切酶。目的基因定義：是指所要研究或應(yīng)用的基因?；蜉d體定義：為攜帶目的基因、實(shí)現(xiàn)無性繁殖或表達(dá)成有意義的蛋白質(zhì)而采用的DNA分子。二、基因工程過程:分、選、接、轉(zhuǎn)、篩、表。分離目的基因、選擇與構(gòu)建基因載體、連接目的基因與載體、重組DNA轉(zhuǎn)入受體菌（細(xì)胞）、篩選重組體、目的基因的表達(dá)。

一、接合作用（conjugation)

當(dāng)細(xì)胞與細(xì)胞、或細(xì)菌通過菌毛相互接 觸時(shí)，質(zhì)粒DNA從一個(gè)細(xì)胞（細(xì)菌）轉(zhuǎn)移至 另一細(xì)胞（細(xì)菌）的DNA轉(zhuǎn)移稱為接合作用。

二、轉(zhuǎn)化作用（transformation)

通過自動(dòng)獲取或人為地供給外源DNA，

使細(xì)胞或培養(yǎng)的受體細(xì)胞獲得新的遺傳表型。

三、轉(zhuǎn)導(dǎo)作用（transduction)

當(dāng)病毒從被感染的細(xì)胞（供體） 釋放出來，再次感染另一細(xì)胞（受體） 時(shí)，發(fā)生在供體細(xì)胞與受體細(xì)胞之間 的DNA轉(zhuǎn)移及基因重組。溶菌感染重組感染細(xì)菌噬菌體圖15-3轉(zhuǎn)導(dǎo)作用轉(zhuǎn)導(dǎo)：通過病毒介導(dǎo)發(fā)生在供體細(xì)胞與受體細(xì)胞之間的DNA轉(zhuǎn)移及基因重組

插入序列轉(zhuǎn)座

插入序列（insertionsequences，IS）：

長(zhǎng)750~1500bp

組成： 反向重復(fù)序列：9~41bp，位于兩側(cè) 轉(zhuǎn)座酶編碼基因：產(chǎn)物引起轉(zhuǎn)座，位于中間 正向重復(fù)序列：4~12bp，位于反向重復(fù)序列 外側(cè)，為插入序列所特有

轉(zhuǎn)座：

1.保守性轉(zhuǎn)座

從原位遷至新位

2.復(fù)制性轉(zhuǎn)座 插入序列復(fù)制后，一個(gè)復(fù)制本遷到

新位，另一個(gè)保留在原位。

保守性復(fù)制

插入序列+反向重復(fù)序列+靶位點(diǎn)內(nèi)切酶裂解(轉(zhuǎn)座酶)切端形成新的磷酸二酯鍵(轉(zhuǎn)座酶)新DNA(polyI)合成與連接(轉(zhuǎn)座酶)位點(diǎn)特異的重組(轉(zhuǎn)座酶)老定位新定位圖15-4插入序列的復(fù)制性轉(zhuǎn)座3'3'5'5'3'5'3'5'

轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座

轉(zhuǎn)座子（transposons）：可從一個(gè)染色體 位點(diǎn)轉(zhuǎn)移到另一位點(diǎn)的分散重復(fù)序列。 反向重復(fù)序列 組成轉(zhuǎn)座酶基因 特殊基因：如抗生素抗性基因等3’5’3’3’3’5’5’5’5’5’5’5’3’3’3’3’3’3’5’5’5’5’5’3’3’3’3’3’3’3’5’5’5’5’5’5’5’5’5’5’5’5’3’3’3’3’3’3’內(nèi)切酶recBCDDNA侵?jǐn)_recA 分支遷移recA內(nèi)切酶recBCDDNA連接酶Holliday中間體機(jī)制3’3’3’3’3’3’3’3’3’3’3’3’3’3’3’3’3’3’3’3’5’5’5’5’5’5’5’5’5’5’5’5’5’5’Holliday中間體內(nèi)切酶

ruvC內(nèi)切酶

ruvCDNA連接酶DNA連接酶圖15-6同源重組機(jī)制Holliday中間體工具酶的定義工具酶：指能用于DNA和RNA分子的切割，連接，聚合，反轉(zhuǎn)錄等有關(guān)的各種酶系統(tǒng)。常用的工具酶工具酶名稱 主要功能

限制性內(nèi)切核酸酶在DNA分子內(nèi)部的特異性的restrictionendonucleases堿基序列內(nèi)部進(jìn)行切割 DNA連接酶將兩條以上的線性DNA分子或片段DNAligase 催化形成磷酸二酯鍵連接成一個(gè)整體 DNA聚合酶I

通過向3’端逐一增加核苷酸以填補(bǔ)雙鏈DNA分子上的單鏈DNApolymeraseI裂口，即5’→3’DNA聚合酶活性與3’→5’及5’→3’外切酶活性 多核苷酸激酶催化將把一個(gè)磷酸分子加到多核苷酸鏈的DNApolymerasekinease5’－OH末端上 反轉(zhuǎn)錄酶以RNA或DNA鏈為模板合成互補(bǔ)的cDNA鏈reversetranscriptase DNA末端轉(zhuǎn)移酶

將多聚物尾巴加到了線性雙鏈DNAterminalDeoxynuc或單鏈DNA分子的3’－OH末端或DNA的3’－末端標(biāo)dNTPleatidytransferase (接下表格)

常用的工具酶(續(xù)上表格)工具酶名稱 主要功能

堿性磷酸酶去除DNA,RNA,dNTP的5’磷酸基團(tuán)BAPorCIP 核酸外切酶III

降解DNA3’－OH末端的核苷酸殘基exonucleaseIII 降解酶S1降解單鏈D