高效液相色譜法測定蜘蛛香總環(huán)烯醚中chorovlrae和蜘蛛香素b的含量

高效液相色譜法測定蜘蛛香總環(huán)烯醚中chorovlrae和蜘蛛香素b的含量

蜘蛛香是指失去雄雞科植物的蜘蛛香的根和根莖。曾載于《本草綱目》,在多版《中國藥典》中也有收載,功能鎮(zhèn)靜安神、理氣止痛、消食止瀉、祛風(fēng)除濕,治療脘腹脹痛、食積不化、腹瀉痢疾、風(fēng)濕痹痛、腰膝酸軟、失眠。蜘蛛香中主含環(huán)烯醚萜類、揮發(fā)油類、黃酮類等化學(xué)成分,具有鎮(zhèn)靜催眠、抗腫瘤、降血脂、抗焦慮等藥理作用。本課題組在研發(fā)蜘蛛香總環(huán)烯醚萜抗焦慮中藥新藥過程中,分離純化得到chlorovaltrate、蜘蛛香素B等20余種環(huán)烯醚萜類單體化合物。chlorovaltrate曾先后被Fuzzati等、Lin等從蜘蛛香中分離純化得到,具有抗真菌,抑制肺癌、前列腺癌、肝癌、結(jié)腸癌等多種腫瘤細(xì)胞,適度的神經(jīng)保護(hù)作用;蜘蛛香素B是本課題組首次從蜘蛛香中分離得到,具有一定的神經(jīng)保護(hù)作用,兩者皆是蜘蛛香中重要的環(huán)烯醚萜類成分。本實(shí)驗(yàn)擬通過測定這兩種成分在蜘蛛香總環(huán)烯醚萜中的含量,為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供一定的參考依據(jù),相關(guān)研究尚未發(fā)現(xiàn)有公開的報道。1紫外-可見分光光度計LC20A高效液相色譜儀(SPD-20A檢測器,LC-20AT泵,CBM-102,Chromato-SolutionLight軟件,日本島津),TU-1901型雙光束紫外-可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司),BSA224S型精密天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)。蜘蛛香總環(huán)烯醚萜由西南交通大學(xué)生命學(xué)院實(shí)驗(yàn)室制備,chlorovaltrate和蜘蛛香素B對照品(實(shí)驗(yàn)室自制,純度≥95%),甲醇、乙腈(色譜純,美國Fisher公司),二次蒸餾水(成都恒信化學(xué)試劑有限公司)。2方法和結(jié)果2.1l-1母液的制備精密稱取chlorovaltrate對照品適量,加甲醇溶解后定容至25mL量瓶中,得628mg·L-1的母液,搖勻;精密吸取上述母液適量,甲醇溶解稀釋為7.75mg·L-1的溶液,搖勻,作為chlorovaltrate對照品貯備液。精密稱取蜘蛛香素B對照品適量,甲醇溶解定容,再精密吸取適量稀釋為10.0mg·L-1的蜘蛛香素B對照品貯備液。2.2甲醇搖勻和定容精密稱取蜘蛛香總環(huán)烯醚萜樣品6.0mg,甲醇溶解并定容至25mL量瓶中,搖勻;從中精密吸取5mL置25mL量瓶中,甲醇定容至刻度,搖勻;經(jīng)0.45μm的微孔濾膜過濾,取續(xù)濾液作為供試品溶液。2.3理論板數(shù)、流動相乙腈-水測定蜘蛛香素BwatersC18色譜柱(4.6mm×250mm,5μm,美國Phenomenex公司),流動相乙腈-水(50∶50),檢測波長203nm,流速1.0mL·min-1,柱溫30℃,理論板數(shù)按蜘蛛香素B峰計算不低于5000。見圖2。2.4chtoroaltrate標(biāo)準(zhǔn)曲線在各自的色譜條件下,分別精密吸取對照品溶液2,4,8,12,16,20μL,進(jìn)樣測定。以對照品質(zhì)量(pg)為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。chlorovaltrate回歸方程Y=116.24X+42.455(r=0.9986),結(jié)果表明chlorovaltrate在15.5~155pg與峰面積呈良好的線性關(guān)系。蜘蛛香素B回歸方程Y=131.48X+191.79(r=0.9987),結(jié)果表明蜘蛛香素B在20~200pg與峰面積有良好的線性關(guān)系。2.5儀器精密度試驗(yàn)分別精密吸取chlorovaltrate、蜘蛛香素B對照品溶液各20μL,重復(fù)進(jìn)樣5次,記錄峰面積,測得RSD分別為0.049%,0.26%,表明儀器精密度良好。2.6重復(fù)性試驗(yàn)分別稱取同批蜘蛛香總環(huán)烯醚萜樣品5份,按供試品溶液制備方法操作,按照2.3項(xiàng)下方法分別進(jìn)樣20μL,測定,測得兩者的RSD分別為0.42%,1.45%,表明方法重復(fù)性良好。2.7chlusoaltrate,生物測定穩(wěn)定性精密吸取供試品溶液20μL,分別于制備后0,4,8,12,24,48h測定峰面積,計算chlorovaltrate、蜘蛛香素B含量RSD分別為1.83%,0.61%,表明本品48h內(nèi)穩(wěn)定性良好。2.8樣品測定分別精密吸取chlorovaltrate、蜘蛛香素B供試品溶液各20μL,按2.3項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析,測定按2.4項(xiàng)下方法計算樣品中chlorovaltrate、蜘蛛香素B的含量。結(jié)果表明,樣品中chlorovaltrate、蜘蛛香素B的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為8.91,7.00mg·g-1。3根據(jù)測定檸蛛香總環(huán)烯醚的含量來確定樹種前期研究中,本課題組通過正交試驗(yàn),得到了蜘蛛香總環(huán)烯醚萜優(yōu)化的提取工藝,即蜘蛛香藥材70%乙醇浸提2次,第1次8倍量浸漬提取24h,第2次6倍量12h,抽濾,合并濾液,減壓濃縮至干。然后通過對浸膏上樣量與樹脂濕重比例,洗脫劑濃度梯度,洗脫劑用量等因素的考察,確定蜘蛛香總環(huán)烯醚萜優(yōu)化的純化工藝為:D101樹脂,浸膏比上樣量72mg·g-1,上樣靜置30min后,依次用6BV水、4BV60%乙醇、4BV95%乙醇洗脫,收集95%洗脫部分,減壓濃縮至干,得到的蜘蛛香總環(huán)烯醚萜含量不低于70%。為了更好的對蜘蛛香總環(huán)烯醚萜進(jìn)行質(zhì)量控制,本課題組對chlorovaltrate、蜘蛛香素B這兩個重要的環(huán)烯醚萜指標(biāo)成分進(jìn)行了含量檢測。但發(fā)現(xiàn)蜘蛛香總環(huán)烯醚萜中chlorovaltrate和蜘蛛香素B的含量較少。下一步,本課題組擬在總環(huán)烯醚萜中尋找含量更高、更具有代表性的指標(biāo)性成分,以更好的對蜘蛛香總環(huán)烯醚萜進(jìn)行質(zhì)量控制。[網(wǎng)絡(luò)出版時間]2014-06-2611:10測定chlorovaltratewatersC18色譜