第11節(jié) 植物細(xì)胞代謝產(chǎn)物制備I

第四篇生物制品生產(chǎn)第9章植物細(xì)胞代謝產(chǎn)物制備I第9章內(nèi)容安排：I：植物細(xì)胞培養(yǎng)II：植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)次級(jí)代謝產(chǎn)物的應(yīng)用舉例分析與討論本節(jié)主要內(nèi)容：1.植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)本節(jié)關(guān)鍵問(wèn)題：1.植物細(xì)胞的特點(diǎn)2.植物細(xì)胞培養(yǎng)方式：懸浮培養(yǎng)、固定化培養(yǎng)3.植物細(xì)胞培養(yǎng)的生物反應(yīng)器植物細(xì)胞培養(yǎng)得到的常見(jiàn)次級(jí)代謝物紫草寧小檗堿（黃連素）花青素，花黃素銀杏黃酮銀杏內(nèi)酯白果內(nèi)酯蒽醌青蒿素超氧化物歧化酶木瓜蛋白酶木瓜凝乳蛋白酶香豆素薄荷醇人參皂甙類胰島素紫杉醇地高辛利血平奎寧堿長(zhǎng)春花堿尼古丁魚(yú)騰酮迷迭香酸紫草細(xì)胞黃連細(xì)胞玫瑰茄細(xì)胞，紫蘇細(xì)胞銀杏細(xì)胞銀杏細(xì)胞銀杏細(xì)胞巴戟天細(xì)胞黃花蒿細(xì)胞大蒜細(xì)胞番木瓜細(xì)胞番木瓜細(xì)胞胡桐細(xì)胞，薰衣草細(xì)胞薄荷細(xì)胞人參細(xì)胞苦瓜細(xì)胞紅豆杉細(xì)胞毛地黃細(xì)胞羅夫木細(xì)胞金雞納細(xì)胞長(zhǎng)春花細(xì)胞煙草細(xì)胞魚(yú)藤細(xì)胞鼠尾草細(xì)胞，鞘心花細(xì)胞色素，消炎消炎、止瀉食用色素，抗氧化疏通血管，抗氧化治療心血管疾病治療大腦和神經(jīng)系統(tǒng)疾病抗菌消炎，抗腫瘤抗瘧疾，退熱藥抗氧化、抗輻射、抗衰老消炎，肉質(zhì)嫩化治療骨質(zhì)增生，血型檢測(cè)抗病毒，香精食用香精調(diào)節(jié)免疫功能，保健治療糖尿病抗腫瘤強(qiáng)心藥降血壓抗瘧疾治療白血病殺蟲(chóng)殺蟲(chóng)消炎，抗氧化長(zhǎng)春新堿長(zhǎng)春堿長(zhǎng)春花細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)生物堿治療白血病銀杏細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)黃酮、萜類化合物紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉醇玫瑰茄等植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)色素洛神花什么是初級(jí)和次級(jí)代謝產(chǎn)物？初級(jí)代謝產(chǎn)物是指微生物通過(guò)代謝活動(dòng)所產(chǎn)生的、自身生長(zhǎng)和繁殖所必需的物質(zhì)，如氨基酸、核苷酸、多糖、脂類、維生素等。通過(guò)初級(jí)代謝，能使?fàn)I養(yǎng)物轉(zhuǎn)化為結(jié)構(gòu)物質(zhì)、具生理活性物質(zhì)或?yàn)樯L(zhǎng)提供能量，因此初級(jí)代謝產(chǎn)物，通常都是機(jī)體生存必不可少的物質(zhì)，只要在這些物質(zhì)的合成過(guò)程的某個(gè)環(huán)節(jié)上發(fā)生障礙，輕則引起生長(zhǎng)停止，重則導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生突變或死亡，是一種基本代謝類型。次級(jí)代謝產(chǎn)物

是指生物生長(zhǎng)到一定階段才產(chǎn)生的化學(xué)結(jié)構(gòu)十分復(fù)雜、對(duì)該生物無(wú)明顯生理功能，或并非是該生物生長(zhǎng)和繁殖所必需的物質(zhì)，如抗生素、毒素、激素、色素等。不同種類的生物所產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物不相同，它們可能積累在細(xì)胞內(nèi)，也可能排到外環(huán)境中。一植物細(xì)胞培養(yǎng)的定義植物細(xì)胞培養(yǎng)（Plantcellculture）是在離體條件下，將分離的植物細(xì)胞通過(guò)繼代培養(yǎng)增殖，獲得大量細(xì)胞群體的一種技術(shù)。獲得的細(xì)胞群體可以作為制備有價(jià)值代謝產(chǎn)物的原料，也可以作為基礎(chǔ)研究的材料。同時(shí)植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)也是人工種子、原生質(zhì)體培養(yǎng)、花藥培養(yǎng)等的支撐技術(shù)。什么是植物細(xì)胞培養(yǎng)?與組織培養(yǎng)的區(qū)別?

植物細(xì)胞培養(yǎng)(plantcellculture):是指在離體條件下對(duì)植物單個(gè)細(xì)胞或小的細(xì)胞團(tuán)進(jìn)行培養(yǎng)并使其增殖，獲得大量細(xì)胞群體的一種技術(shù)。1979年國(guó)際組織培養(yǎng)協(xié)會(huì)專業(yè)術(shù)語(yǔ)委員會(huì)建議：

組織培養(yǎng)：從機(jī)體內(nèi)取出組織或細(xì)胞，模擬機(jī)體內(nèi)生理?xiàng)l件，在體外進(jìn)行培養(yǎng)，使之生存或生長(zhǎng)成組織。

細(xì)胞培養(yǎng)：動(dòng)植物細(xì)胞在體外條件下的存活或生長(zhǎng)，此時(shí)細(xì)胞不再形成組織。植物組織培養(yǎng)⑴培養(yǎng)對(duì)象植物的各種組織、器官⑵培養(yǎng)目的獲得所需的植物組織和再生植株；快速繁殖。細(xì)胞培養(yǎng)⑴培養(yǎng)對(duì)象各種形式的植物細(xì)胞⑵培養(yǎng)目的獲得所需的細(xì)胞和各種所需的產(chǎn)物；進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化；將外源底物轉(zhuǎn)化為所需的產(chǎn)物。與植物組織培養(yǎng)的區(qū)別

二植物細(xì)胞特點(diǎn)問(wèn)題1：與微生物相比，植物細(xì)胞有什么特點(diǎn)？細(xì)菌，真菌、植物細(xì)胞都有細(xì)胞壁細(xì)菌無(wú)成形的細(xì)胞核，真菌、植物細(xì)胞有成形的細(xì)胞核。植物細(xì)胞比微生物細(xì)胞大。植物細(xì)胞直徑一般約為10-200μm，平均直徑比微生物細(xì)胞大30-100倍。植物細(xì)胞很少以單一細(xì)胞形式懸浮生長(zhǎng)，通常以一定細(xì)胞數(shù)的非均相細(xì)胞團(tuán)方式存在。植物細(xì)胞具有纖維素細(xì)胞壁和大的液泡，很容易被剪切力損傷。與微生物細(xì)胞相比，植物細(xì)胞生長(zhǎng)速度慢，操作周期長(zhǎng)，分批培養(yǎng)一般需要2-3周，半連續(xù)或連續(xù)培養(yǎng)時(shí)間一般長(zhǎng)達(dá)2-3個(gè)月。植物細(xì)胞培養(yǎng)基成分豐富而復(fù)雜，適合微生物生長(zhǎng)，因此防止污染更困難。植物細(xì)胞培養(yǎng)一般需要光照，通過(guò)光合作用合成有機(jī)物，因此氧氣和CO2的含量與傳遞對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)影響較大。三植物細(xì)胞培養(yǎng)歷史20世紀(jì)50年代，泰爾克（Talecke）和尼克爾（Nickell）證實(shí)植物細(xì)胞可生長(zhǎng)在懸浮培養(yǎng)液中。隨后，人們發(fā)現(xiàn)離體培養(yǎng)的植物細(xì)胞具有合成代謝產(chǎn)物的能力。1956年，尼克爾（Nickell）和盧荻（Routin）申請(qǐng)了第一個(gè)用植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)化學(xué)物質(zhì)的專利。20世紀(jì)80年代后期，紫草寧等細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)次獲得了產(chǎn)業(yè)化（紫草寧可以用作創(chuàng)傷、燒傷以及痔瘡的治療藥）。四植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)（一）培養(yǎng)基植物細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基主要由碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽、維生素、植物生長(zhǎng)激素、有機(jī)酸和一些復(fù)合物質(zhì)組成。目前應(yīng)用廣泛的基礎(chǔ)培養(yǎng)基有MS、B5、N6等，具體內(nèi)容參見(jiàn)附錄。問(wèn)題2：植物組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基組成有哪些？無(wú)機(jī)鹽：大量元素N\S\P\K\Ca\Mg等、微量元素有機(jī)物：糖類、氨基酸、維生素等調(diào)節(jié)物質(zhì)：激素與微生物培養(yǎng)基相比：需要大量無(wú)機(jī)鹽；多種維生素和激素；一般采用無(wú)機(jī)氮源；一般以蔗糖為碳源。生物酶懸浮分散、離心植物組織植物細(xì)胞

（二）植物單細(xì)胞分離與初步培養(yǎng)植物細(xì)胞培養(yǎng)首先需要從植物樣品制備單細(xì)胞問(wèn)題3：植物組織培養(yǎng)、細(xì)胞融合時(shí)單個(gè)植物細(xì)胞是如何獲得的？1.酶解法選擇專一性水解酶在溫和的條件下將植物細(xì)胞壁物質(zhì)（纖維素、果膠、多糖）降解，從而使細(xì)胞彼此分開(kāi)，這種方法稱為酶解法。經(jīng)常采用的生物酶包括：纖維素酶、果膠酶、瓊脂酶等。（1）酶解法Takebe等（1968）最早報(bào)道：用果膠酶處理可以分離大量的葉肉細(xì)胞。加酶過(guò)濾、離心（2）機(jī)械法第一種方法：用刀片刮葉片撕去下表皮露出葉肉細(xì)胞用解剖刀刮下細(xì)胞第二種方法：葉片研碎、離心研碎成粉加研磨介質(zhì)過(guò)濾、離心機(jī)械法和酶解法比較機(jī)械法酶解法細(xì)胞不受到酶的傷害；不用質(zhì)壁分離；細(xì)胞產(chǎn)量低；細(xì)胞易破。細(xì)胞受到酶的傷害；要質(zhì)壁分離；細(xì)胞產(chǎn)量高；細(xì)胞不易破。3.愈傷組織法通過(guò)培養(yǎng)植物外植體誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織，并使其大量增殖，再通過(guò)機(jī)械震蕩或者酶解的方法使細(xì)胞分離從而獲得游離的細(xì)胞。擴(kuò)增培養(yǎng)、液體懸浮

植物細(xì)胞

誘導(dǎo)脫分化外植體建立懸浮細(xì)胞培養(yǎng)系愈傷組織法

2.單細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)

1）平板培養(yǎng)法

指將一定量細(xì)胞接種到或混合到一薄層固體培養(yǎng)基里進(jìn)行培養(yǎng)的方法。此法是Bergman(貝格曼，1960)首創(chuàng)。平板培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)是便于在顯微鏡下對(duì)細(xì)胞進(jìn)行定點(diǎn)觀察,選擇單細(xì)胞株和篩選突變體。細(xì)胞平板培養(yǎng)概念：將制備好的單細(xì)胞懸浮液，按照一定的細(xì)胞密度，接種在1mm左右的薄層固體培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，稱之為平板培養(yǎng)。主要技術(shù)要點(diǎn)：

單細(xì)胞的分離：一般采用酶分離法，小細(xì)胞團(tuán)不能超過(guò)6個(gè)細(xì)胞，因此過(guò)濾時(shí)網(wǎng)篩的網(wǎng)眼要選擇合適。

單細(xì)胞懸浮液的制備：分離的單細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)基洗滌2次以后，調(diào)整密度為5×105/ml。

植板：將1份已調(diào)整好密度的單細(xì)胞懸浮液與4份35℃的固體培養(yǎng)基充分混合均勻，然后均勻的平鋪于培養(yǎng)皿中，其厚度為1-2mm。待植板后的培養(yǎng)基完全凝固后，用石蠟或封口膜將培養(yǎng)皿封嚴(yán)以防污染，在25℃黑暗條件下培養(yǎng)3周即可長(zhǎng)出肉眼可見(jiàn)的細(xì)胞團(tuán)。平板培養(yǎng)法平板培養(yǎng)法看護(hù)培養(yǎng)（nursingculture）用一塊活躍生長(zhǎng)的愈傷組織來(lái)看護(hù)單個(gè)細(xì)胞，使其持續(xù)分裂和增殖。這塊愈傷組織被稱為看護(hù)組織。由繆爾（Muir）于1953年創(chuàng)立。具體方法：將單個(gè)細(xì)胞接種于濾紙上，再置于愈傷組織之上培養(yǎng)。優(yōu)點(diǎn)是：簡(jiǎn)便、成功率高。缺點(diǎn)是不能在顯微鏡下直接觀察。2）看護(hù)培養(yǎng)與飼養(yǎng)層培養(yǎng)法飼養(yǎng)層培養(yǎng)（Feederlayerculture）把處理過(guò)的（如X射線處理）無(wú)分裂能力或分裂很慢的細(xì)胞來(lái)飼養(yǎng)所需培養(yǎng)的細(xì)胞，使其分裂和生長(zhǎng)。微室培養(yǎng)

概念：人工制造一個(gè)小室，將單細(xì)胞培養(yǎng)在小室中的少量培養(yǎng)基上，使其分裂增殖形成細(xì)胞團(tuán)的方法，稱微室培養(yǎng)。1滴含單細(xì)胞培養(yǎng)液周圍加石蠟油凹穴載玻片旁邊加石蠟油蓋蓋玻片蓋蓋玻片平視圖置培養(yǎng)皿中26~28℃恒溫培養(yǎng)微室培養(yǎng)要求：

微室內(nèi)不能有氣泡。

微室的厚度最好不要超過(guò)20微米，蓋玻片的厚度要在0.17-0.18mm左右。

觀察時(shí)要保持溫度和培養(yǎng)時(shí)一致。

3）液體淺層靜置培養(yǎng)法

指將一定密度的懸浮細(xì)胞放在培養(yǎng)皿中形成一淺薄層，封口靜止培養(yǎng)。該方法優(yōu)點(diǎn)：易于補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)基，便于鏡檢。（三）繼代培養(yǎng)1.固體培養(yǎng)平板培養(yǎng)法是經(jīng)常采用的一種固體培養(yǎng)方式，將一定量細(xì)胞接種到或混合到裝有一薄層固體培養(yǎng)基（含瓊脂Agar）的培養(yǎng)皿內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。類似于微生物細(xì)胞的平板培養(yǎng)，具體步驟包括：?jiǎn)渭?xì)胞懸浮液的制備、計(jì)數(shù)、調(diào)節(jié)細(xì)胞密度、培養(yǎng)基選擇、澆平板、接種培養(yǎng)。采用液體培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞培2.液體培養(yǎng)養(yǎng)。（四）植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)細(xì)胞懸浮培養(yǎng)（Cellsuspensionculture）是將細(xì)胞接種于液體培養(yǎng)基中并保持良好的分散狀態(tài)的培養(yǎng)方式。植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)主要在搖床和生物反應(yīng)器中進(jìn)行，培養(yǎng)方法與微生物類似。優(yōu)點(diǎn)：1.可以增加細(xì)胞與培養(yǎng)液的接觸，促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)的吸收。2.保證良好的混合狀態(tài)，從而獲得良好的氣體傳遞效果。3.可以達(dá)到較高的細(xì)胞濃度，容易放大培養(yǎng)。振蕩培養(yǎng)箱懸浮培養(yǎng)的生物反應(yīng)器一般所說(shuō)的生物反應(yīng)器是指細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器，是為細(xì)胞生長(zhǎng)提供合適的化學(xué)與物理環(huán)境并能檢測(cè)控制細(xì)胞生長(zhǎng)的裝置。一般都有三部分組成：反應(yīng)罐、控制系統(tǒng)、檢測(cè)分析系統(tǒng)。問(wèn)題4.與傳統(tǒng)微生物發(fā)酵罐相比，植物細(xì)胞培養(yǎng)的生物反應(yīng)器有什么特點(diǎn)？植物細(xì)胞培養(yǎng)的特殊要求植物細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器最初大多采用微生物反應(yīng)器。由于植物細(xì)胞與微生物細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)不同，植物細(xì)胞較微生物細(xì)胞大，對(duì)剪切力耐受性差，而且對(duì)氧的要求相對(duì)微生物要低得多，因此微生物反應(yīng)器并不完全適合于植物細(xì)胞生長(zhǎng)與生產(chǎn)。植物細(xì)胞培養(yǎng)具有周期長(zhǎng)、細(xì)胞抗剪切能力弱、易團(tuán)聚等特點(diǎn)。同時(shí)，植物細(xì)胞規(guī)模培養(yǎng)的目的是生產(chǎn)天然產(chǎn)物，而這些天然產(chǎn)物均為細(xì)胞次生代謝物。所以，植物細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器的設(shè)計(jì)，不僅要考慮有利于細(xì)胞生長(zhǎng)，同時(shí)還要考慮有利于產(chǎn)物的積累和分離。總體上講，適合植物細(xì)胞的反應(yīng)器應(yīng)該具有適宜的氧傳遞、良好的流動(dòng)性和較低的剪切力。光照的提供：外光源、內(nèi)光源，透明材料。結(jié)構(gòu)盡量簡(jiǎn)單。機(jī)械攪拌式生物反應(yīng)器（Stirredtankrioreactor）一般由罐體、攪拌槳、控溫系統(tǒng)、氣路、傳感器等組成。依靠攪拌器使液體產(chǎn)生軸向流動(dòng)和徑向流動(dòng)。該生物反應(yīng)器的優(yōu)點(diǎn)是攪拌充分，供氧能力和混合效果較好。攪拌罐中產(chǎn)生的剪切力大，容易損傷細(xì)胞，直接影響細(xì)胞的生長(zhǎng)和代謝，特別對(duì)于次級(jí)產(chǎn)物生成影響極大。需要對(duì)攪拌罐進(jìn)行改進(jìn)，包括改變攪拌形式、葉輪結(jié)構(gòu)與類型、空氣分布器等，力求減少產(chǎn)生的剪切力，同時(shí)滿足供氧與混合的要求。不同葉輪產(chǎn)生剪切力大小順序?yàn)椋簻u輪狀葉輪＞平葉輪＞折葉漿＞螺旋狀葉輪Kaman等采用帶有1個(gè)雙螺旋帶狀葉輪(helicalribbonimpeller)和3個(gè)表面擋板的攪拌罐，證明適于剪切力敏感的高密度細(xì)胞培養(yǎng)。離心槳生物反應(yīng)器采用三葉螺旋槳，同時(shí)采用微孔金屬絲網(wǎng)作為空氣分布器，能提供良好的混合狀態(tài)，具有比機(jī)械攪拌槳底的剪切力。氣升式生物反應(yīng)器(Air-liftbioreactor)由氣升室、氣降室、除氣室和底部四部分組成。培養(yǎng)液循環(huán)的動(dòng)力來(lái)自于氣升室、氣降室中因含氣量不同而在底部產(chǎn)生的壓力差，因而比鼓泡型有更均一的流動(dòng)形式。根據(jù)反應(yīng)器內(nèi)部結(jié)構(gòu)與氣體分布器的位置不同可分為內(nèi)環(huán)流和外環(huán)流兩種鼓泡式生物反應(yīng)器(Bubblecolumnbioreactor)又稱為鼓泡塔式反應(yīng)器，是最簡(jiǎn)單的氣動(dòng)式生物反應(yīng)器。氣體分布器一般位于底部中央，氣體從底部通過(guò)噴嘴或孔盤(pán)進(jìn)入反應(yīng)器。它不含轉(zhuǎn)動(dòng)部分，整個(gè)系統(tǒng)密閉，易于無(wú)菌操作。不同于氣升式生物反應(yīng)器，液體在反應(yīng)器內(nèi)部呈無(wú)規(guī)律的湍流狀態(tài)。培養(yǎng)過(guò)程中沒(méi)有機(jī)械能消耗，適合于培養(yǎng)對(duì)剪切力敏感的細(xì)胞。然而對(duì)高密度及粘度較大的培養(yǎng)物，反應(yīng)器的混合效率會(huì)降低。其它類型生物反應(yīng)器轉(zhuǎn)鼓式生物反應(yīng)器(Rotatingdrumbioreactor)因?yàn)檗D(zhuǎn)子的轉(zhuǎn)動(dòng)帶動(dòng)培養(yǎng)罐轉(zhuǎn)動(dòng)，促進(jìn)了氣體交換與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，具有懸浮系統(tǒng)均一、低剪切力、防止細(xì)胞粘附在壁上的優(yōu)點(diǎn)，適合于高密度植物懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)，已用于長(zhǎng)春花、紫草的細(xì)胞懸浮培養(yǎng)。（五）植物細(xì)胞固定化培養(yǎng)問(wèn)題5：植物細(xì)胞固定化培養(yǎng)有什么優(yōu)點(diǎn)？細(xì)胞固定化培養(yǎng)（Cellimmobilizationculture）是指將游離的細(xì)胞包埋在支持物內(nèi)部或表面進(jìn)行培養(yǎng)的一門(mén)技術(shù)。是在20世紀(jì)70年代的酶固定化催化技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的。1979年，布洛德利斯（Brodelius）首次成功利用固定化的毛地黃、長(zhǎng)春花細(xì)胞制備次級(jí)代謝產(chǎn)物。1.細(xì)胞經(jīng)包埋后使所受的剪切力損傷減小，維持了細(xì)胞的穩(wěn)定性，適合脆弱的植物細(xì)胞的培養(yǎng)，同時(shí)也利于采用傳統(tǒng)生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)。2.懸浮細(xì)胞培養(yǎng)體系中細(xì)胞密度比較高時(shí)會(huì)因粘度增加引起傳質(zhì)困難。固定化細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中細(xì)胞密度遠(yuǎn)高于懸浮培養(yǎng)，但并不會(huì)改變培養(yǎng)液流體性質(zhì)，利于傳質(zhì)。3.大多數(shù)植物次級(jí)代謝產(chǎn)物合成在生長(zhǎng)停止后才大量合成。采用固定化培養(yǎng)可以將細(xì)胞生長(zhǎng)與產(chǎn)物合成分成兩個(gè)階段。與細(xì)胞懸浮培養(yǎng)相比，植物細(xì)胞固定化培養(yǎng)具有以下優(yōu)點(diǎn)：4.細(xì)胞生長(zhǎng)較為緩慢，利于次級(jí)代謝產(chǎn)物的積累。5.固定化增加了細(xì)胞與細(xì)胞間的接觸，促進(jìn)了細(xì)胞間信息傳遞，利于代謝產(chǎn)物的合成。6.固定化細(xì)胞可以反復(fù)使用，可以方便地進(jìn)行產(chǎn)物的連續(xù)性收獲，降低了成本。1.固定化方法吸附、交聯(lián)、共價(jià)結(jié)合、包埋等。（1）吸附固定法通過(guò)物理吸附、離子吸附（依靠靜電引力固著在帶有異電荷的載體上）等方法使細(xì)胞固定在載體上。（2）共價(jià)結(jié)合法細(xì)胞表面的基團(tuán)（如氨基、巰基、咪唑基、酚羥基等）和固相支持物表面的基團(tuán)之間形成化學(xué)共價(jià)鍵連接，從而成為固定化細(xì)胞。A將細(xì)胞包埋在多孔載體內(nèi)部制成固定化細(xì)胞。優(yōu)點(diǎn)：