第五章 基因的分離與鑒定

基因的分離與鑒定DNA克隆片段的產(chǎn)生和分離重組體DNA分子的構(gòu)建及導(dǎo)入受體細(xì)胞基因克隆的實驗方案克隆基因的分離重組子的選擇與鑒定DNA克隆片段的產(chǎn)生和分離1.利用限制性內(nèi)切酶片段化基因組DNA鳥槍法（shotgunapproch）：用限制性內(nèi)切酶消化給體基因組DNA，這種消化產(chǎn)物，不經(jīng)過凝膠電泳分部分離，就直接用來同載體分子作連接反應(yīng)的克隆方法。2.凝膠電泳法和蔗糖梯度離心法分離構(gòu)建重組DNA分子的途徑重組子分子導(dǎo)入受體細(xì)胞的途徑原核生物的轉(zhuǎn)化與轉(zhuǎn)染真核生物的轉(zhuǎn)染原核生物的轉(zhuǎn)化與轉(zhuǎn)染E.coli的鈣轉(zhuǎn)化E.coli的電穿孔轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)導(dǎo)E.coli的鈣轉(zhuǎn)化細(xì)菌細(xì)胞在一定的生理狀態(tài)（感受態(tài)），或經(jīng)CaCl2處理，或制備成原生質(zhì)體的情況下，都可吸收外源ＤＮＡ，利用這一特性可將重組ＤＮＡ導(dǎo)入受體細(xì)胞中，用質(zhì)粒作載體的遺傳工程一般使用這種方法。由于E.coli不會自發(fā)地產(chǎn)生感受態(tài)，因此E.coli的轉(zhuǎn)化一般采用鈣轉(zhuǎn)化法。該方法是將E.coli用冷CaCl2(0℃)致敏，而后在高溫（42℃）下熱休克，這樣可使外原DNA進(jìn)入受體細(xì)胞。E.coli的電穿孔轉(zhuǎn)化在高壓電場下使細(xì)胞產(chǎn)生瞬間的穿孔，這個穿孔足夠大并可維持足夠的時間，使外原DNA進(jìn)入受體細(xì)胞。電穿孔法的轉(zhuǎn)化效率比鈣轉(zhuǎn)化法高2~3個數(shù)量級。這種方法也可用于真核生物的轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染是指轉(zhuǎn)化感染（Transfection來自于transfomation與infection）

凡是以噬菌體（如M13）或病毒為載體，以轉(zhuǎn)化的方法將DNA導(dǎo)入細(xì)胞的方法均稱為轉(zhuǎn)染。因此轉(zhuǎn)染就方法來說與轉(zhuǎn)化是一樣的。體外包裝顆粒的轉(zhuǎn)導(dǎo)將重組的λ噬菌體DNA或重組的柯斯載體DNA經(jīng)體外包裝成具有感染能體力的λ噬菌體顆粒，然后經(jīng)由在受體細(xì)胞表面上的λDNA接受位點，使這些帶有目的基因序列的重組體DNA注入大腸桿菌。真核生物的轉(zhuǎn)染

1.磷酸鈣轉(zhuǎn)染技術(shù)2.電穿孔法3.基因搶轉(zhuǎn)染法4.激光微束穿孔法5.顯微注射法6.脂質(zhì)體介導(dǎo)法7.多聚物介導(dǎo)法磷酸鈣轉(zhuǎn)染技術(shù)主要用于動物細(xì)胞的轉(zhuǎn)染。將DNA溶液加入到CaCl2中，然后在強烈震蕩下加入由Na2HPO4和NaH2PO4組成的磷酸緩沖液，使溶液產(chǎn)生磷酸鈣沉淀并將DNA包裹在沉淀中。將這些沉淀加入到細(xì)胞中，利用細(xì)胞的胞飲作用將DNA導(dǎo)入到細(xì)胞中。磷酸鈣一方面可以增加細(xì)胞的通透性，一方面可以避免DNA被細(xì)胞內(nèi)的核酸酶水解。電穿孔法：原理與原核生物的電穿孔法一樣，主要用于植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)染?；驌屴D(zhuǎn)染法：主要用于植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)染。利用被電場或機械加速的金屬微粒能夠進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的基本原理，先將DNA溶液與鎢、金等金屬微粒一起保溫，使DNA吸附在金屬微粒表面，隨高速的金屬微粒直接進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。激光微束穿孔法：主要用于葉綠體或線粒體的基因工程操作。利用直徑很小、能量很高的激光束在細(xì)胞表面引起可逆性的穿孔，使DNA進(jìn)入細(xì)胞。

顯微注射法：主要用于動物細(xì)胞或植物的原生質(zhì)體，利用毛細(xì)管直接將DNA注入細(xì)胞內(nèi)。脂質(zhì)體（liposome）介導(dǎo)法：主要用于動物細(xì)胞或植物的原生質(zhì)體。將DNA包裹在人工制備的磷脂雙分子層的膜狀結(jié)構(gòu)內(nèi)，通過脂質(zhì)體與細(xì)胞膜的融合而將DNA導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)。多聚物介導(dǎo)法：用于動物細(xì)胞或植物的原生質(zhì)體。利用多聚物如PEG、二乙胺乙基葡聚糖（DEAE葡聚糖）、多聚賴氨酸、多聚鳥氨酸等與二價陽離子、DNA混合形成沉淀顆粒，通過細(xì)胞的胞飲作用而進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。基因克隆的實驗方案1.cDNA基因克隆2.基因組DNA克隆3.基因定位克隆

cDNA基因克隆cDNAlibrariescDNA基因克隆

cDNA文庫是指得到足夠多的分別克隆的cDNA片段，匯集這些克隆應(yīng)包含某種細(xì)胞中各種mRNA的相應(yīng)順序，每種順序至少有一份拷貝，這種克隆片段的匯集體稱為某種細(xì)胞的cDNA文庫。

cDNAlibrariesmRNAisolation,purificationChecktheRNAintegrity

FractionateandenrichmRNA

SynthesisofcDNA

TreatmentofcDNAends

LigationtovectorcDNA文庫沒有原核生物的cDNA

文庫原核生物的mRNA非常不穩(wěn)定；原核生物的基因組文庫比較容易構(gòu)建，能包含所有基因的序列。cDNA文庫對于真核生物的基因分析cDNA文庫是只含有編碼蛋白的基因文庫cDNAs

沒有內(nèi)含子基因可以在E.coli

中直接表達(dá)用于新基因的鑒別組織或特殊類型細(xì)胞（基因的特異表達(dá)）cDNA文庫cDNA文庫-mRNA分離

大部分真核生物的mRNAs

有3’poly（A）尾巴

oligo(dT)能與poly(A)尾巴互補，由此來獲得mRNA.AAAAAAAAAAn5’cap1.傳統(tǒng)的分離方法是用oligo(dT)-纖維素柱分離總RNA2.把oligo(dT)-磁珠同總RNA混合，在強磁場下分離mRNA3.用蔗糖梯度離心mRNA核糖體復(fù)合體（溶解細(xì)胞）來分離mRNA三種分離mRNA的方法用纖維素純化poly(A)mRNA的流程圖確定mRNA沒被降解

方法:mRNA的翻譯:用體外蛋白質(zhì)合成檢測mRNAs。（麥胚無細(xì)胞轉(zhuǎn)譯體系或兔網(wǎng)織細(xì)胞裂解物轉(zhuǎn)譯體系）通過凝膠電泳分析mRNAs:用瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳cDNA文庫-檢測mRNA的完整性克隆特殊的mRNAs克隆一個特殊的基因比建立完整的cDNA文庫更有用凝膠分離:通過瓊脂糖凝膠電泳回收mRNAs（根據(jù)mRNA的大?。└患?通過雜交來實現(xiàn)cDNA的合成:第一鏈的合成:

mRNA,反轉(zhuǎn)錄酶，oligo(dT)，核酸末端轉(zhuǎn)移酶，dNTPs1.oligo(dT)引導(dǎo)的cDNA合成法2.隨機引物引導(dǎo)的cDNA合成法第二鏈的合成:

根據(jù)在第一鏈3’-末端加尾（C），用補充引物合成第二鏈

5’mRNA

AAAAA-3’HO-TTTTTP-5’5’ReversetranscriptaseFourdNTPsAAAAA-3’TTTTTP-5’mRNA

mRNA

cDNAcDNAcDNADuplexcDNAAAAAACCC-3’TTTTTP-5’TTTTTP-5’3’3’-CCCCCCCTerminaltransferasedCTPAlkali(hydrolyaesRNA)PurifyDNAoligo(dG)KlenowpolymeraseorreverseTranscriotaseFourdNTPs5’-pGGGG-OH5’3’-CCCCCCC5’-pGGGG3’-CCCCCCCTTTTTP-5’-3’Thefirststrandsynthesis5’-pGGGG3’-CCCCCCCHO-CCGAATTCGGGGGG3’-GGCTTAAGCCCCCC5’-pAATTCGGGGGGTTTTTGGCTTAAGCC-OHCCGAATTCGG-3’3’-CCCC3’-CCCCCCC3’-CCCC5’-pGGGG5’-pGGGGTTTTTp-5’-3’TTTTTp-5’TTTTTp-5’-3’-3’TTTTTGGCTTAAp-5’HO-CCG/AATTCGG-3’3’-GGCTTAA/GCC-OHCCG-3’DuplexcDNASinglestrand-specificnucleaseKlenowpolymerasetreatwithE.coRImethylaseAddE.colRIlinkers

usingT4DNAligaseE.colRIdigestionLigatetovectorandtransfomSecondstrandsynthesis對cDNA末端的處理平末端的片斷需要加入特殊的核苷酸序列形成粘性末端，才能進(jìn)行克隆步驟:移去突出的3’-ends(strand-specialnuclease)填充缺失3’核苷酸

(klenowfragmentofDNApolyIand4dNTPs)銜接物和平末端的連接(T4DNAligase)限制性內(nèi)切酶的消化

(E.coRI)與載體的連接

任何一個含有E.coRI酶切位點的載體都可以用來克隆cDNA.步驟:載體末端脫磷酸（堿性磷酸酶）用T4DNA連接酶連接載體和cDNA(plasmidorlphagevector)cDNA克隆的優(yōu)越性1.以mRNA為材料；

（一些RNA病毒，不經(jīng)過DNA中間體，對其研究，cDNA是唯一可行的方法）2.基因文庫的篩選比較簡單易行；3.由于每一個cDNA克隆都含有一種mRNA序列，在選擇中出現(xiàn)假陽性的幾率比較低；4.克隆在細(xì)菌中表達(dá)的基因，用作基因序列的測定，和發(fā)育過程中或組織中基因特異表達(dá)

基因組DNA克隆

Genomiclibraries基因組文庫的構(gòu)建基因文庫（genelibrary）：用重組DNA技術(shù)將某種生物細(xì)胞的總DNA或染色體DNA的所有片段隨機地連接在載體上，然后轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中通過細(xì)胞增殖而構(gòu)成各個片段的克隆。當(dāng)制備的克隆數(shù)目多到可以把某種生物的全部基因都包含在內(nèi)的情況下，這一組克隆的總體就稱為某種生物的基因文庫。同一定義也適用于線粒體或葉綠體ＤＮＡ的基因文庫。由于制備ＤＮＡ片段的切點是隨機的，所以每一克隆內(nèi)所含的ＤＮＡ片段即可能是一個或幾個基因，也可能是一個基因的一部分或除完整基因外還包含著兩側(cè)的鄰近ＤＮＡ順序。

基因文庫的構(gòu)建就是利用所謂的“鳥搶法”，使基因組的DNA片段隨機地插入適當(dāng)?shù)妮d體中，引入細(xì)胞進(jìn)行大量繁殖而構(gòu)建的?；蚪MDNA文庫純化基因組DNA

基因組DNA的片斷化物理切割和限制性內(nèi)切酶eukaryotesprokaryotes與載體連接構(gòu)建基因文庫的基因組DNA必須進(jìn)行純化后，才能用來制備適用于載體插入片斷大小的隨機片斷基因組DNA的純化:

原核生物:直接從細(xì)胞中體取基因組DNA去除蛋白（蛋白酶消化）,脂類和其它“雜質(zhì)”。真核生物

:從細(xì)胞核中Hae

：5’-

…GG

/CC…

3’,Sau3A:5’-/GATC-3’,

Alu:5’-

…AG/CT…3’,BamH1:5’-G/GATCC限制性內(nèi)切酶消化將片斷的末端(粘性或平頭)和酶消化的載體連接酶切位點是否被修飾（在哺乳動物種CpG

甲基化）內(nèi)切酶消化的時間和用量取決于要插入片斷的大小范圍。

用于構(gòu)建基因文庫片段的產(chǎn)生大致有兩種方法：一是用限制性內(nèi)切酶完全消化基因組DNA，這個方法有兩個特點。第一是假如所需的基因含有所用限制酶的識別位點，那么這一基因?qū)⒈豢寺≡趦蓚€或數(shù)個片段中，給研究帶來一定的困難。第二，一般常用的限制酶大多識別六個bp序列，切割DNA所產(chǎn)生的片段的平均大小相對比較?。s4kb即46＝4096bp），因此整個基因文庫要含有非常大量的重組體，這樣應(yīng)用分子雜交法進(jìn)行篩選就十分費事費時。雖然可以用限制酶進(jìn)行部分消化，產(chǎn)生約20kb的片段，但這種方法必須掌握好酶解的條件。用于制備基因文庫的隨機片段的另一種方法是采用機械隨機切割。這種方法可以制備大片段的DNA（用噬菌體λ作載體約20kb，以cosmid作載體約45kb），從而克服上述的兩處缺點。但是這種方法的不是之處是：所制備的片段的末端順序是隨機的，還必須經(jīng)過末端修復(fù)，人工制造接頭等手續(xù)才能與載體ＤＮＡ進(jìn)行連接。用于基因文庫構(gòu)建的載體常用噬菌體λ或cosmid載體，因為它們的容量比較大，可克隆大片段的DNA。雖然cosmid載體比λ載體的容量大，但由于文庫的保存（cosmid載體在E.coli中，λ載體在噬菌體中）λ比cosmid容易，因此λ載體用的更多些。Hae

、Alu文庫的大小(確定有足夠的克隆數(shù))必須包括一定數(shù)量的重組子才可能克隆基因組中的任何堿基序列。計算重組子數(shù)量的公式：N=ln(1-P)ln(1-f)P:重組體群體中出現(xiàn)目的基因的序列的幾率（一般期望99%）f:限制片斷的平均大小與基因組DNA總量之比N：一個完整基因文庫所應(yīng)包含的重組DNA的轉(zhuǎn)化子的克隆數(shù)Forexample:期望值為0.99，插入片斷為20kb的

E.coli(4.6×106bp)和human(3×109bp)基因組的克隆數(shù)的計算N

E.coli==1.1×103ln(1-0.99)ln[1-(2×104/4.6×106)]Nhuman==6.9×105

ln(1-0.99)ln[1-(2×104/3×109)]這個例子說明用質(zhì)粒載體（插入片斷5-10kb）就可以建立很好的原核生物基因文庫，只需要幾千個克??；而真核生物則需要更大承載能力的載體。有一些序列不能被克隆 Example:1.序列缺乏酶切位點;2.目的基因包容在一個其大小范圍超出載體承載能力的DNA片斷上

Toolongforthevectorused載體根據(jù)基因組的大小選擇合適的載體構(gòu)建DNA文庫。載體

PlasmidphageλcosmidBACYAC

插入片斷

(kb)523453501000最常用的載體是phageλ基因定位克隆Map-baseedcloning主要內(nèi)容：1.擬南芥簡介2.RFLP分子標(biāo)記3.RFLP作圖的原理與步驟4.染色體步移5.大尺度基因組物理圖譜的構(gòu)建基因定位克隆是用于分離其編碼產(chǎn)物上不知道的目的基因的一種有效的方法。從理論上講，任何一種可鑒定出有一個突變的基因，都可以通過基因定位克隆技術(shù)予以分離。

步驟：1.先將目的基因定位到染色體上，并在目的基因的兩側(cè)確定一對緊密連接的RFLP或RAPD分子標(biāo)記；2.利用最緊密連鎖的一對兩側(cè)分子標(biāo)記作探針，通過染色體步移技術(shù)將位于這兩個分子標(biāo)記之間的含目的基因組片斷克隆并分離出來；3.最后根據(jù)其同突變體發(fā)生遺傳互補的能力從此克隆重鑒定出目的基因。應(yīng)用基因定位克隆技術(shù)分離目的基因的必要條件：

1.以酵母人工染色體為載體構(gòu)建含有大片斷DNA的YAC文庫。2.有可用的同目的基因緊密連鎖的DNA探針，（距離幾百bp）

擬南芥簡介：

1.植株小，便于篩選突變體；2.時代時間短（5個星期左右），可以積累大量遺傳數(shù)據(jù)）；3.種子產(chǎn)率高，每株可產(chǎn)生4104粒以上的種子；4.基因組小，結(jié)構(gòu)簡單，總長度7107bp適合于用染色體步移技術(shù)克隆目的基因；5.天然自花授粉，可得到突變基因的純合子，同時也可通過人工雜交授粉，以便給基因定位。RFLP分子標(biāo)記

DNA限制片斷長度多態(tài)性，它是指應(yīng)用特定的核酸內(nèi)切酶切割有關(guān)的DNA分子，所產(chǎn)生的DNA片斷在長度上的簡單變化。由于核酸內(nèi)切酶是以一種序列特異的方式切割DNA分子，來自一個完整的純合子個體（所有的基因及DNA序列）的每一種同源DNA分子，都會在同樣的位點被準(zhǔn)確地切割。它所代表的是基因組DNA在限制性內(nèi)切酶消化后產(chǎn)生片段在長度上差異，由于不同個體等位基因之間堿基的互換、重排、缺失等變化導(dǎo)致限制內(nèi)切酶識別位點發(fā)生改變，從而造成基因型間限制性片段長度的差異。當(dāng)這些大小不等的片段通過凝膠電泳時，就形成不同帶，通過與克隆的DNA探針進(jìn)行Southren雜交和放射自顯影后，即獲得反映個體特異性的RFLP圖譜。GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGCTTAAGGAATTCEcoR

CTTAAGGAATTCCCTAAGGGATTCGAATTCCTTAAGEcoR

EcoR

生態(tài)型A的DNA生態(tài)型B的DNAEcoR

分別切割兩種生態(tài)型DNA電泳后作Southen雜交同放射性同位素標(biāo)記的基因A克隆雜交ab基因A基因ARFLP作圖的原理和步驟：

abX探針A探針B探針B探針AF1雜合子探針B探針AF2代CNH2:1:1不連鎖AB緊密連鎖HCN自由組合需要篩選相當(dāng)大量的F2代群體，通過重組子計算基因A與B之間的遺傳距離。染色體步移（chrosomewalking）這種技術(shù)通過逐一克隆來自染色體基因組DNA的彼此重疊的序列，而慢慢靠近目的基因，因此形象的稱為染色體步移。步驟1.先構(gòu)建起點RFLP標(biāo)記克隆的限制圖，把其中最靠近目的基因的限制片斷亞克隆出來；2.經(jīng)同位素標(biāo)記之后，用作分子雜交探針；從基因組文庫中篩選與起點克隆具有重疊序列的新克隆；重復(fù)進(jìn)行上述步驟，直到找到目的基因的克隆。。

染色體步移的影響因素：1.在基因組的不同位置上散布著重復(fù)的DNA序列，它們會擾亂步移的順序性，因此，進(jìn)行染色體步移的探針必須是唯一的序列的克隆。2.在基因組DNA中存在著一些無法克隆的序列，因為當(dāng)它們被克隆到所使用的克隆載體上時，會發(fā)生致死效應(yīng)。在擬南芥和番茄中1cM的圖距大約相當(dāng)于290kb和750kb，而在人類基因組中1cM的圖距大約相當(dāng)于1000kb，在小麥中這個數(shù)字是35000kb。由于大多數(shù)高等真核基因組中都存在著大量的散在重復(fù)序列，致使染色體步移對于超大型的DNA序列的作圖和超長的距離進(jìn)行基因定位克隆存在一定的困難。大尺度基因組物理圖譜的構(gòu)建

1.DNA分子大片斷切割2.大片斷DNA分子的分離3.YAC庫的構(gòu)建4.大尺度物理圖譜的構(gòu)建

DNA分子大片斷切割

用切割位點稀少的核酸內(nèi)切酶進(jìn)行切割。大片斷DNA分子的分離

脈沖電場凝膠電泳（PFGE）

YAC庫的構(gòu)建

YAC（yeastartificialchromosome，酵母人工染色體）質(zhì)粒載體是在人類基因組計劃（HGP）實施的背景下發(fā)展起來的一類克隆特大片段的載體。這類載體含有1.酵母菌的復(fù)制起點ARS（automaticreplicationsequence,ARS），2.來自酵母染色體的著絲粒CEN（centromere）序列；3.一對酵母的端粒TEL（telomere）序列；

4.選擇性標(biāo)記和克隆位點；5.同時還含有大腸桿菌的復(fù)制起始點，可以在大腸桿菌中以環(huán)狀質(zhì)粒的形式存在。DNA體外重組后以原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的方式導(dǎo)入酵母細(xì)胞。這類載體克隆能力可達(dá)1~2Mb。主要用于基因組文庫的構(gòu)建。大尺度物理圖譜的構(gòu)建物理圖譜（physicalgenes）:分子標(biāo)記間的物理圖距是以核苷酸數(shù)目表示的，這種圖譜現(xiàn)在可以PFGE法進(jìn)行構(gòu)建。通過測定攜帶分子標(biāo)記的DNA限制片斷的大小，便可以計算出兩個分子標(biāo)記之間的物理圖距。

構(gòu)建全基因組物理圖譜的過程分離到大量的基因組克隆，并構(gòu)建它們的詳細(xì)的限制圖譜，就可以鑒定出重疊的基因組克隆，進(jìn)而構(gòu)建出全基因組的物理圖譜?？寺』虻姆蛛x1.應(yīng)用核酸探針2.應(yīng)用差別雜交或扣除雜交法3.應(yīng)用mRNA差別顯示技術(shù)4.應(yīng)用表達(dá)文庫5.酵母雙雜交體系應(yīng)用核酸探針分離克隆的目的基因步驟：1.獲得探針2.轉(zhuǎn)膜3.雜交TransfertheDNAintheplaqueorcolonytoaNylonornitrocellulosemembranePhageDNAbindtothemembranedirectly

BacterialcoloniesmustbelysedtoreleaseDNAonthemembranesurface.Hybridization

(inasolutionContainingNucleicacidprobe)Washtoremoveunhybri-dizationprobeandvisualize

X-rayfilm(radio-activelylabeled)

antibodyorenzyme(modifiednucleotidelabeled

Lineupthehybridizatedregionorrepeatedhybridization(Alkalitreatment)探針的來源1.某種生物實驗體系中分離到的基因序列，可作為從其它生物中分離相關(guān)基因的核酸探針。2.根據(jù)蛋白質(zhì)家族保守性，合成核酸探針。功能相同或相近的蛋白質(zhì)，存在著具有共同氨基酸序列的區(qū)段（保守區(qū)），往往由彼此相鄰的6~7個氨基酸組成。

寡核苷酸探針的人工合成

1.探針的長度；要使探針與目的基因序列嚴(yán)格互補，最少的探針長度15~16個核苷酸，實驗中為保證足夠的特異性，通常使用17~20個核苷酸。2.簡并性；根據(jù)蛋白質(zhì)氨基酸組分合成的寡核苷酸探針，通常是混合物的形式。在這種探針庫中，只有一種是與目的基因完全互補的。由于探針庫中只有一種是與目的基因完全互補的，其它的探針有可能與不相關(guān)的片斷雜交，產(chǎn)生假陽性信號。1.猜測體探針

2.PCR-猜測體探針猜測體：一種人工合成的用于分離克隆基因的低簡并性的寡核苷酸探針，其核苷酸序列是根據(jù)特定物種當(dāng)中某種已知蛋白質(zhì)的密碼子使用頻率，同時又采納了根據(jù)猜測最可能在目的基因中出現(xiàn)的密碼子資料，選擇含有密碼子簡并程度最低的蛋白質(zhì)區(qū)段進(jìn)行合成。一種較長的唯一的寡核苷酸序列，它能夠大范圍的卻不能夠完全的同靶序列互補。PCR-猜測體探針（尿酸氧化酶基因）根據(jù)末端32個氨基酸序列，設(shè)計PCR簡并引物，以cDNA為模板用猜測探針雜交篩選陽性克隆應(yīng)用差別雜交或扣除雜交法分離克隆的目的基因差別雜交（differentialhybridization）又稱差別篩選(differentialscreening)適用于分離經(jīng)特殊處理而被誘發(fā)表達(dá)的mRNA的cDNA。扣除雜交（subtractivehybridization）又叫扣除cDNA克?。╯ubtractivecDNAcloning）通過構(gòu)建扣除文庫得以實現(xiàn)。差別雜交：需要兩種不同的細(xì)胞群體（目的基因正常表達(dá)、目的基因不表達(dá)），分別制備兩種不同mRNA提取物，以兩種總mRNA探針平行雜交，對有表達(dá)目的基因的細(xì)胞總mRNA構(gòu)建的克隆文庫進(jìn)行篩選。差別雜交的局限性：1.雜交靈敏度低，對于低峰度的mRNA尤為明顯2.工作量大，重復(fù)性差，兩套平行濾膜之間的DNA保有量有差別，導(dǎo)致雜交信號不一致?？鄢s交：去除普遍共同存在的、或是非誘發(fā)產(chǎn)生的cDNA序列，從而使欲分離的目的基因的序列得到有效的富集。應(yīng)用mRNA差別顯示技術(shù)（DDRT-PCR）分離克隆的目的基因

(differentialdisplayreversetranscriptionpolymerasechainreaction)原理：用3’-端錨定引物和反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA的第一鏈；用3’-端錨定引物和5’-端10-mer隨機引物組成引物對，以反轉(zhuǎn)錄第一鏈為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增（DDRT-PCR），在標(biāo)準(zhǔn)的序列膠中電泳2~3小時，可顯示出50~100條長度在100~5000bp之間的DNA條帶。3’-錨定引物：P.Liang等人設(shè)計合成了全部12種不同的引物，用以反轉(zhuǎn)錄mRNA，合成第一鏈cDNA。這種引物通常叫作3'-端錨定脫氧核苷酸引物，并用5'-T11MN或5'-T12MN通式表示。其中M為除了T以外的任何一種核苷酸（即A、G或C），而N則為任何一種核苷酸（即A、G、C或T），故MN共有12種不同的排列組合方式。mRNA:5’-NMAAAAAA…AA-3’(12種序列)3’-NMTTTTTTT…TT-5’5’-隨機引物：10-mer，更好的同第一鏈結(jié)合，從而呈現(xiàn)出更多種的mRNA。一般用20種隨機引物和12種3’-端錨定引物組成的全部240組引物對PCR擴(kuò)增后，所產(chǎn)生的大約20000條條帶，基本涵蓋了在一定的發(fā)育階段某種類型細(xì)胞中所表達(dá)的全部的mRNA。

DDRT-PCR（mRNAdifferentialdisplyreversetranscriptionpolymerasechainreaction）

由于在cDNA群體中，代表特定細(xì)胞類型或發(fā)育階段的mRNA的含量非常低，所以要把一種只在某一階段或某種細(xì)胞類型中表達(dá)、而在另一發(fā)育階段或某種細(xì)胞類型中不表達(dá)的目的基因分離出來，就需要PCR擴(kuò)增。基本過程：1.從一對處于不同發(fā)育階段（或不同基因型）的細(xì)胞群體中分離總mRNA，并用3’-端錨定引物作反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA;2.用5’-端隨機引物和3’-端錨定引物組成的引物對，在加入放射性同位素標(biāo)記的dNTP的條件下，以第一步反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。3.將擴(kuò)增樣品在變性的DNA測序膠中進(jìn)行電泳分離；4.將有關(guān)的差別表達(dá)的DNA條帶從測序膠上切割下來回收其DNA片斷；5.膠塊中的DNA量非常少，不能用于克隆，需進(jìn)行二次擴(kuò)增；6.將克隆的特定的DNA分別同基因組DNA及總mRNA作Southern或Northern雜交，測序；7.以此目的片斷作探針從cDNA文庫中或基因組文庫中篩選全長的cDNA克隆或基因組克隆。優(yōu)點：1.可以同時比較多個樣品表達(dá)的差異；2.可以同時檢測“上游”及“下游”的基因；3.檢測靈敏度高，所需樣品少，經(jīng)PCR擴(kuò)增一些低峰度的mRNA也可以被檢測出來；4.結(jié)合使用了PCR和序列膠電泳分析兩項技術(shù)，使本方法顯得較單方便。局限性：

1.假陽性比例高（50%～75%）；同一長度的條帶，含有多種DNA序列；鄰近條帶回收時，造成人為誤差；mRNA3’-端序列保守性高，而常用3’-端cDNA作探針。2.擴(kuò)增的差別條帶分子長度比較短小（110～450bp）；

應(yīng)用表達(dá)文庫分離克隆的目的基因表達(dá)文庫分離克隆的目的基因當(dāng)沒有可用的核苷酸序列供作篩選基因文庫的探針時，將cDNA克隆在表達(dá)載體上，再導(dǎo)入大腸桿菌寄主細(xì)胞然后通過對蛋白質(zhì)產(chǎn)物的鑒定，分離克隆的真核目的基因。特點：1.表達(dá)的蛋白質(zhì)以融合蛋白質(zhì)的形式存在，其中原核蛋白質(zhì)的氨基酸序列是整合在真核蛋白質(zhì)的一個末端，不易被原核細(xì)胞中的有關(guān)蛋白酶消化降解，因而顯得比較穩(wěn)定，可以得到較高的表達(dá)水平。2.cDNA片斷必須置于啟動子序列下游，在其控制之下；按正確的取向和讀碼結(jié)構(gòu)插入，確保產(chǎn)生正確的蛋白質(zhì)。篩選的方法：1.利用抗體篩選表達(dá)文庫；2.測定蛋白質(zhì)的功能；3.用放射性同位素標(biāo)記的、帶有特定蛋白質(zhì)結(jié)合位點的DNA片斷作探針篩選表達(dá)文庫。將菌落或噬菌斑原位復(fù)制到膜上處理之后蛋白質(zhì)暴露，與第一抗體溫育漂洗未結(jié)合的抗體，加入經(jīng)標(biāo)記的第二抗體能與第一抗體結(jié)合抗體篩選表達(dá)文庫2.測定蛋白質(zhì)的功能

生物化學(xué)研究表明，存在Ca＋＋離子的條件下，鈣調(diào)蛋白能與許多種酶結(jié)合形成穩(wěn)定的復(fù)合物。將放射性同位素標(biāo)記得鈣調(diào)蛋白用作探針篩選cDNA表達(dá)文庫，鑒定能夠表達(dá)出與它特異性結(jié)合的目標(biāo)蛋白質(zhì)的陽性克隆。

3.用放射性同位素標(biāo)記的、帶有特定蛋白質(zhì)結(jié)合位點的DNA片斷作探針篩選表達(dá)文庫

鑒定能夠表達(dá)出與特定DNA片斷（真核啟動子中與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的DNA元件）結(jié)合的目標(biāo)蛋白質(zhì)的克隆。酵母雙雜交體系

（two-hybridsystem）酵母雙雜交體系又叫相互作用陷阱(interactiontrap)

有效的分離能與已知的靶蛋白質(zhì)相互作用的蛋白質(zhì)的編碼基因。應(yīng)用于真核基因地表達(dá)調(diào)控，細(xì)胞粘合因子間的相互作用、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路以及細(xì)胞周期與分化、反式因子的鑒定與分離等研究基本原理：許多真核生物的轉(zhuǎn)錄激活因子都是由兩個結(jié)構(gòu)上可以分開的、功能上相互獨立的結(jié)構(gòu)域組成（example）；應(yīng)用重組DNA技術(shù)，也可以將來自同一個轉(zhuǎn)錄因子的、或者兩種不同轉(zhuǎn)錄因子的、分開的兩種結(jié)構(gòu)域，在體內(nèi)重新組裝成具有功能的轉(zhuǎn)錄因子，從而激活UAS（上游激活序列）下游啟動子調(diào)節(jié)的報告基因的表達(dá)。Example:

釀酒酵母的