第三章-動(dòng)物細(xì)胞制藥

生物技術(shù)制藥第三章動(dòng)物細(xì)胞制藥第五章動(dòng)物細(xì)胞制藥第一節(jié)概述第二節(jié)動(dòng)物細(xì)胞的形態(tài)和生理特點(diǎn)第三節(jié)生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞的要求和獲得第四節(jié)動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基第五節(jié)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法第六節(jié)動(dòng)物細(xì)胞大量培養(yǎng)的方法和操作方式第七節(jié)動(dòng)物細(xì)胞生物反應(yīng)器第八節(jié)動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)品的純化方法和質(zhì)量要求第九節(jié)動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)品的制造實(shí)例第十節(jié)動(dòng)物細(xì)胞制藥的前景和展望第一節(jié)概述（1）發(fā)現(xiàn)細(xì)胞和細(xì)胞學(xué)說創(chuàng)立。1665年英國物理學(xué)家Hooke通過自制的顯微鏡觀察切成薄片的軟木時(shí)看到死細(xì)胞的細(xì)胞壁。（2）組織培養(yǎng)或細(xì)胞培養(yǎng)。1885年德國生理鹽水培養(yǎng)雞胚組織，至1907年，細(xì)胞體外培養(yǎng)宣布進(jìn)入一個(gè)新時(shí)代。（3）細(xì)胞工程學(xué)時(shí)代。運(yùn)用現(xiàn)代生物科學(xué)的理論、方法和技術(shù)，按照人們預(yù)先設(shè)計(jì)的藍(lán)圖，有計(jì)劃大規(guī)模地培養(yǎng)細(xì)胞和組織以獲得生物產(chǎn)品，或改變細(xì)胞遺傳物質(zhì)的組成以獲得新的生物或其產(chǎn)品。以及發(fā)展這些技術(shù)的研究領(lǐng)域。（3）細(xì)胞工程學(xué)時(shí)代包括真核細(xì)胞的基因重組、導(dǎo)入、擴(kuò)增和表達(dá)的理論和技術(shù)，細(xì)胞融合的理論和技術(shù)，細(xì)胞器特別是細(xì)胞核移植的理論和技術(shù)，染色體改造的理論和技術(shù)，轉(zhuǎn)基因動(dòng)、植物的理論和技術(shù)，細(xì)胞大量培養(yǎng)的理論和技術(shù)，以及產(chǎn)物分離純化的理論和技術(shù)。（4）細(xì)胞工程制藥成為現(xiàn)代制藥技術(shù)中常用的手段。細(xì)胞是生物體的結(jié)構(gòu)單位和功能單位。細(xì)胞工程是利用細(xì)胞的全能性，采用組織與細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)對動(dòng)、植物進(jìn)行修飾，為人類提供優(yōu)良品種和保存瀕危珍稀物種。細(xì)胞工程主要包括體細(xì)胞融合、核移植、細(xì)胞器攝取和染色體片段重組等。體細(xì)胞融合是指兩個(gè)不同種類的細(xì)胞，加上融合劑，在一定條件下，彼此融合成雜交細(xì)胞，使來自兩個(gè)親本細(xì)胞的基因有可能都被表達(dá)，從而打破了遠(yuǎn)緣生物不能雜交的屏障，提供了創(chuàng)造新物種的可能。細(xì)胞核移植對動(dòng)物優(yōu)良雜交種的無性繁殖具有重要的意義。克隆技術(shù)便是細(xì)胞核移植的一個(gè)最為典型的應(yīng)用。細(xì)胞器的攝取主要是指葉綠體和線粒體的攝取。如用白化型原生質(zhì)體攝取正常的葉綠體，進(jìn)而發(fā)育成正常的綠色植物；用抗藥型草履蟲的線粒體植入其他草履蟲細(xì)胞，使后者獲得抗藥性。染色體片段重組是利用染色體替換來改變生物遺傳特性，如利用染色體的易位、缺體等方法，獲得新的染色體組合第二節(jié)動(dòng)物細(xì)胞的形態(tài)和特點(diǎn)一、動(dòng)物細(xì)胞的形態(tài)二、動(dòng)物細(xì)胞的生理特點(diǎn)三、動(dòng)物細(xì)胞生長的特點(diǎn)一、動(dòng)物細(xì)胞的形態(tài)細(xì)胞的分化（或特化）形態(tài)分化在離體培養(yǎng)同樣也存在。離體培養(yǎng)的細(xì)胞分為兩類：貼壁依賴型（anchorage-dependent）和非貼壁依賴型（anchorage-independent），前者可簡稱為貼壁細(xì)胞，后者可簡稱為懸浮細(xì)胞。動(dòng)物細(xì)胞結(jié)構(gòu)圖一、動(dòng)物細(xì)胞的形態(tài)1、貼壁細(xì)胞這類細(xì)胞的生長必須有給以貼附的支持物表面，細(xì)胞依靠自身分泌的或培養(yǎng)基中提供的貼附因子才能在該表面上生長、增殖。細(xì)胞在該表面生長一般形成兩種形態(tài)，即成纖維樣細(xì)胞型或上皮樣細(xì)胞型。前者主要來源于中胚層組織的細(xì)胞，生長時(shí)呈放射狀、旋渦狀或火焰狀走行；后者主要來源于外胚層和內(nèi)胚層組織的細(xì)胞，生長時(shí)彼此緊密連接成單層細(xì)胞片。1.細(xì)胞種類：人肝腫瘤細(xì)胞

2.培養(yǎng)的天數(shù)：復(fù)蘇后12小時(shí)；

3.放大倍速：倒置顯微鏡X10；

4.培養(yǎng)基種類：DMEM+10%小牛血清（杭州四季青)；

5.細(xì)胞狀態(tài)與特征簡述:細(xì)胞呈梭型貼壁生長

一、動(dòng)物細(xì)胞的形態(tài)2、懸浮細(xì)胞這類細(xì)胞的生長不依賴支持物表面，可在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)生長，如血液的淋巴細(xì)胞和用以生產(chǎn)干擾素的Namalwa細(xì)胞等，細(xì)胞呈圓形。Bme細(xì)胞

1.細(xì)胞種類：家蠶胚胎細(xì)胞

2.培養(yǎng)的天數(shù)：傳代后3d

3.放大倍速：倒置顯微鏡放大倍數(shù)：X10、X25

4.培養(yǎng)基種類：Grace+10%胎牛血清；

5.細(xì)胞狀態(tài)與特征簡述:細(xì)胞懸浮生長，呈梭形，生長速度快，2d～3d又可傳代

3、兼性貼壁細(xì)胞兼具上述兩種生長方式的細(xì)胞，稱為兼性貼壁細(xì)胞，如CHO細(xì)胞、小鼠L929細(xì)胞。當(dāng)它們貼附在支持物表面上生長時(shí)呈上皮或成纖維細(xì)胞的形態(tài)，而當(dāng)懸浮于培養(yǎng)基中生長時(shí)則呈圓形，但有時(shí)它們可相互支持貼附在一起生長。CHO細(xì)胞

1.細(xì)胞種類：倉鼠卵巢細(xì)胞；

2.培養(yǎng)的天數(shù)：2天；

3.放大倍速：倒置顯微鏡X10；

4.培養(yǎng)基種類：DMEM+10%胎牛血清；

5.細(xì)胞狀態(tài)與特征簡述:細(xì)胞呈梭型貼壁生長

二、動(dòng)物細(xì)胞的生理特點(diǎn)1、細(xì)胞的分裂周期長一般為12~48h，細(xì)胞分裂周期=間期（G1期+S期+G2期）+分裂期（M期）G1期：凡細(xì)胞無增殖活動(dòng)時(shí)皆滯留在G1期S

期：DNA的合成，一般為6~8小時(shí)G2期：DNA量加倍，RNA合成和染色體螺旋化，持續(xù)時(shí)間短，一般為2~5h。M期：一般持續(xù)時(shí)間很短，僅0.5~1h。相當(dāng)于有絲分裂的中后期和末期，主要是染色體的變化、分裂，并形成子細(xì)胞。二、動(dòng)物細(xì)胞的生理特點(diǎn)2、細(xì)胞生長需貼附于基質(zhì)，并有接觸抑制現(xiàn)象大多數(shù)正常二倍體（dipoid）細(xì)胞的生長都需要一定的基質(zhì)（如玻璃，塑料等）上貼附，伸展后才能生長增殖，其機(jī)制可能與電荷、鈣鎂離子的作用以及許多貼附因子有關(guān)。當(dāng)細(xì)胞在基質(zhì)上分裂增殖，逐漸匯合成片時(shí)，細(xì)胞與其周圍細(xì)胞相互接觸時(shí)，細(xì)胞才停止增殖。保持一定的營養(yǎng)，細(xì)胞仍可存活一段時(shí)間，但細(xì)胞密度不再增加，該現(xiàn)象就稱為接觸抑制或密度依賴抑制現(xiàn)象。一旦細(xì)胞轉(zhuǎn)化為異倍體后，該現(xiàn)象消失，細(xì)胞可多層生長，細(xì)胞密度可大大增加。二、動(dòng)物細(xì)胞的生理特點(diǎn)3、正常二倍體細(xì)胞的生長壽命是有限的當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)開始，稱之為原代培養(yǎng)，也叫初始培養(yǎng)，指直接由機(jī)體取得材料（細(xì)胞、組織或器官），到第一次傳代前的培養(yǎng)即為原代培養(yǎng)，經(jīng)過傳代后，即成為有限細(xì)胞系，即有限的生長傳代時(shí)間，取決于細(xì)胞來源的種族和年齡，人胚成纖維細(xì)胞約可培養(yǎng)50代，雞胚的30代，小鼠的8代。但是若向培養(yǎng)基中加入表皮生長因子，可使上皮細(xì)胞的壽命從原來的50代增加至150代。當(dāng)細(xì)胞突變?yōu)楫惐扼w后，該細(xì)胞可轉(zhuǎn)變成無限細(xì)胞系，或稱連續(xù)細(xì)胞系。二、動(dòng)物細(xì)胞的生理特點(diǎn)4、動(dòng)物細(xì)胞對周圍環(huán)境比較敏感無細(xì)胞壁保護(hù)，因而外界的物理化學(xué)因素很容易產(chǎn)生影響。5、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基的要求高與細(xì)菌和植物細(xì)胞不同，其需要12種必需氨基酸、8種以上的維生素、多種無機(jī)鹽和微量元素、作為主要碳原的葡萄糖以及多種細(xì)胞生長因子和貼附因子，而且不同種類要求又有變化。二、動(dòng)物細(xì)胞的生理特點(diǎn)6、動(dòng)物細(xì)胞蛋白的合成途徑和修飾功能與細(xì)菌不同場所：游離的核糖體以及粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的核糖體，前者合成的蛋白質(zhì)都用于細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)內(nèi)，后者上合成的蛋白質(zhì)是分泌性的和膜中的整合蛋白，多數(shù)為糖蛋白。蛋白質(zhì)上的糖鏈有的在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上加接，有的在高爾基體中加接。其中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中加接的是N-鏈寡糖，在高爾基體內(nèi)加接的是O-鏈寡糖。糖基化與細(xì)胞的許多生理功能密切相關(guān)。綜上，采用動(dòng)物細(xì)胞作為宿主細(xì)胞生產(chǎn)藥品有利有弊。三、動(dòng)物細(xì)胞生長的特點(diǎn)細(xì)胞生長：（1）單細(xì)胞生長：細(xì)胞周期細(xì)胞周期定義：細(xì)胞從一次分裂結(jié)束到下一次分裂結(jié)束所經(jīng)歷的一個(gè)完整的過程稱為一個(gè)細(xì)胞周期（CellCycle），細(xì)胞周期包括間期和細(xì)胞分裂期。間期是細(xì)胞代謝，DNA復(fù)制的時(shí)期，它由一個(gè)DNA合成期（S期）和S期前后的兩個(gè)間隔期G1和G2組成，細(xì)胞分裂期（M）包括有絲分裂期和胞質(zhì)分裂期兩個(gè)主要過程。

細(xì)胞周期(2)群體細(xì)胞生長：生長曲線

N2=N1·2g（N2=t2時(shí)的細(xì)胞數(shù)，N1=t1時(shí)的細(xì)胞數(shù)，

g=t1－t2時(shí)間內(nèi)細(xì)胞繁殖的代數(shù)）

(d)logN(cell/ml)延遲期對數(shù)生長期穩(wěn)定期衰亡期

細(xì)胞生長曲線（1）

潛伏期（Latentphare）：新接種的細(xì)胞在培養(yǎng)液中經(jīng)過一段懸浮狀態(tài)，貼附于培養(yǎng)器皿表面，各種細(xì)胞貼附速度不同，這與細(xì)胞種類、培養(yǎng)基成分，底物性質(zhì)等條件有關(guān)。初代培養(yǎng)細(xì)胞貼壁較慢，大約10~24小時(shí)，連續(xù)細(xì)胞系和惡性細(xì)胞系貼壁較快，30min內(nèi)即可完成。貼壁后，細(xì)胞并不馬上分裂，仍需一個(gè)潛伏期。潛伏期的長短與細(xì)胞接種量細(xì)胞種類培養(yǎng)基性質(zhì)（pH值，組成）細(xì)胞接種時(shí)的狀態(tài)（對數(shù)期接種，非對數(shù)期接種）

有關(guān)（2）

對數(shù)生長期（logarithmicgrowthphase）經(jīng)過潛伏期的適應(yīng)與準(zhǔn)備，培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞一代最具活力時(shí)期——對數(shù)生長期。在這個(gè)時(shí)期，細(xì)胞分裂旺盛，細(xì)胞分裂相增多，分裂相的數(shù)量標(biāo)志著細(xì)胞分裂的旺盛程度，以分裂指數(shù)（MI）表示。細(xì)胞有絲分裂指數(shù)（mitoticindex，MI）MI=（分裂相個(gè)數(shù)/1000個(gè)細(xì)胞）×100%初代細(xì)胞的MI低，連續(xù)細(xì)胞系和腫瘤細(xì)胞系MI高達(dá)30~5%，一般細(xì)胞MI介于0.1%~0.5%之間。此時(shí)細(xì)胞群體數(shù)與細(xì)胞增長速率成正比例函數(shù)。對數(shù)生長期一般可達(dá)3~5天。在一個(gè)理想的物理化學(xué)環(huán)境下，如適宜的溫度、pH值、溶氧量、合適的混合強(qiáng)度以及適宜的營養(yǎng)配比，可控制的有害物濃度，培養(yǎng)細(xì)胞就會(huì)處于一種較恒定的生長分裂狀態(tài)。（3）

穩(wěn)定期（stationaryphase）對數(shù)生長期細(xì)胞增殖到一定數(shù)量，在培養(yǎng)空間和營養(yǎng)物質(zhì)有限，代謝產(chǎn)物積累的不利條件下，細(xì)胞生長進(jìn)入一個(gè)新分裂的細(xì)胞數(shù)與死亡的細(xì)胞數(shù)相等的動(dòng)態(tài)平衡階段，細(xì)胞總數(shù)不再增加，但細(xì)胞代謝活動(dòng)仍在進(jìn)行中。（4）

衰亡期（senescencephase）由于營養(yǎng)物質(zhì)的耗盡和有害物質(zhì)的作用，培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)入死亡細(xì)胞數(shù)多于分裂細(xì)胞數(shù)的衰亡階段，活細(xì)胞數(shù)減少，死細(xì)胞數(shù)增多。一些正常細(xì)胞生命周期是有限的，分裂次數(shù)也有限，50~60次，或50~60代左右，如將20~30代的細(xì)胞進(jìn)行保存一定時(shí)間后，復(fù)蘇培養(yǎng)，細(xì)胞仍只可傳20~30代左右，最后衰老死亡。對一些腫瘤細(xì)胞或轉(zhuǎn)化細(xì)胞（tansformedcell）[由于物理因子（UV、X），在含因子或病毒感染等造成]，可以獲得能夠無限生長繁殖的連續(xù)細(xì)胞系（cellline），它們沒有最多分裂次數(shù)限制而成為“永生細(xì)胞”（immortalcell）。2．貼壁生長過程：接種后細(xì)胞生長過程可分為四個(gè)階段（以貼壁細(xì)胞為例）：（1）

游離期：接種的細(xì)胞在培養(yǎng)液中呈懸浮態(tài)，由于胞質(zhì)回縮，胞體變圓。（2）

吸附期：細(xì)胞類型不同，貼壁時(shí)間有所差異。單個(gè)細(xì)胞、傳代細(xì)胞較快、組織塊，較大細(xì)胞團(tuán)較慢，一般細(xì)胞可在24小時(shí)內(nèi)貼壁，平均貼壁時(shí)間5~20min，狀態(tài)不好的細(xì)胞及瀕死細(xì)胞，培養(yǎng)基偏酸、偏堿，培養(yǎng)瓶不潔等不利于細(xì)胞貼壁。（3）

繁殖期：圓形懸浮細(xì)胞貼壁后延展，雖有細(xì)胞運(yùn)動(dòng)，但無分裂，經(jīng)一段停滯，開始生長分裂，隨著細(xì)胞數(shù)量增多，同時(shí)有一定的移動(dòng)現(xiàn)象，細(xì)胞間開始接觸并連接成片，這時(shí)細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)便會(huì)停止，這種由于細(xì)胞間的接觸而發(fā)生的抑制現(xiàn)象，稱為接觸抑制（contactinhibition），接觸抑制只是抑制細(xì)胞運(yùn)動(dòng)，并不抑制細(xì)胞分裂。所以當(dāng)細(xì)胞連接成片后，仍能繼續(xù)分裂，直到細(xì)胞達(dá)到一定密度，才停止分裂，叫密度抑制（densityinhibition），能抑制細(xì)胞分裂。但腫瘤細(xì)胞及轉(zhuǎn)化細(xì)胞不存在密度抑制，可以羅疊生長。（4）

退化期：當(dāng)細(xì)胞長滿瓶底后，如不及時(shí)傳代，由于營養(yǎng)物消耗和代謝物積累，細(xì)胞進(jìn)入退化期，此時(shí)細(xì)胞輪廊增強(qiáng)，細(xì)胞內(nèi)堆積有顆粒物，為膨脹的線粒體，細(xì)胞變得粗糙，嚴(yán)重時(shí)細(xì)胞從瓶壁脫落，引起死亡（長老了），所以應(yīng)及時(shí)傳代。第三節(jié)生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞的要求和獲得一、生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞的要求二、生產(chǎn)動(dòng)物細(xì)胞的獲得三、常用生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞的特性四、基因工程細(xì)胞的構(gòu)建和篩選五、細(xì)胞庫的篩選一、生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞的要求（1）原代正常組織分離的細(xì)胞（2）二倍體細(xì)胞，傳代細(xì)胞（3）傳代細(xì)胞用于生產(chǎn)（4）按照FDA對細(xì)胞株的要求，控制最終產(chǎn)品中DNA殘留量。二、生產(chǎn)動(dòng)物細(xì)胞的獲得原代細(xì)胞、已建立的二倍體細(xì)胞系、可無限期傳代的轉(zhuǎn)化細(xì)胞系，以及用這些細(xì)胞進(jìn)行融合和重組的工程細(xì)胞系。1、原代細(xì)胞：是直接取自動(dòng)物組織、器官，經(jīng)過粉碎、消化而獲得的細(xì)胞懸液。一般1g組織約有109個(gè)細(xì)胞。2、二倍體細(xì)胞系：原代細(xì)胞經(jīng)過傳代、篩選、克隆，從而從多種細(xì)胞成分的組織中挑選并純化出某種具有一定特征的細(xì)胞株。3、轉(zhuǎn)化細(xì)胞系：失去了正常細(xì)胞的特點(diǎn)，可以無限增殖。4、融合細(xì)胞系在誘導(dǎo)物的作用下，細(xì)胞膜會(huì)發(fā)生一定的變化，從而導(dǎo)致兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞的融合。常用的誘導(dǎo)物為仙臺病毒和聚乙二醇。物理的方法有高壓電場等。5、重組工程細(xì)胞系三、常用生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞的特性（1）WI-38：1961年來源于女性高加索人正常胚肺組織的二倍體細(xì)胞系，核型2n=46。該細(xì)胞是成纖維細(xì)胞，能產(chǎn)生膠原，培養(yǎng)基用BME（Eagle’sbasalmedium）加小牛血清，pH控制在7.2，同工酶為G6PDB型。細(xì)胞的倍增時(shí)間為24h，有限壽命為50代，上世紀(jì)60年代被廣泛用于制備疫苗。（2）MRC-5：特性和用途與WI-38相似，1966年來源于14周正常男性，對多種人的病毒敏感，用于疫苗的生產(chǎn)。三、常用生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞的特性（3）CHO-K1：1957年從中國地鼠卵巢中分離的一株上皮樣細(xì)胞。在培養(yǎng)時(shí)需加入脯氨酸。核型為2n=20~22。目前廣泛用于構(gòu)建工程細(xì)胞的是一株缺乏二氫葉酸還原酶的營養(yǎng)缺陷突變株CHO-dhfr-，它常用的培養(yǎng)基為DMEM培養(yǎng)基，加0.1mol/L次黃嘌呤和0.01mmol/L胸苷，以及10%小牛血清。三、常用生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞的特性（4）BHK-21：1961年從5只生長1天的地鼠幼鼠的腎臟中分離的?，F(xiàn)在廣泛采用的是1963年用單細(xì)胞分離的方法經(jīng)13次的克隆的細(xì)胞。成纖維細(xì)胞，2n=44。通常用的培養(yǎng)基為DMEM培養(yǎng)基，添加7%胎牛血清。過去多用于增殖病毒，包括多瘤病毒、口蹄疫病毒和狂犬病疫苗，現(xiàn)在已被用于構(gòu)建工程細(xì)胞。三、常用生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞的特性（5）Vero：1962年來源于正常的成年非洲綠猴腎。是貼壁依賴的成纖維細(xì)胞，2n=60，高倍體率為1.7%，可持續(xù)地進(jìn)行培養(yǎng)。通常用的培養(yǎng)基為199培養(yǎng)基，添加5%胎牛血清。該細(xì)胞可支持多種病毒的增殖，包括脊髓灰質(zhì)炎、狂犬病病毒，已被批準(zhǔn)用于人體。（6）Namalwa：1972年來源于肯尼亞患有Burkitt淋巴瘤的病人體中，后在瑞典構(gòu)建的一株人的類淋巴母細(xì)胞，該細(xì)胞有2.8%的高倍體率，多數(shù)細(xì)胞有12~14條標(biāo)記染色體，單條X染色體，無Y染色體。通常用的培養(yǎng)基為RPMI1640，添加7%胎牛血清。用于大規(guī)模生產(chǎn)-干擾素。三、常用生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞的特性（7）SP2/0-Ag14：該細(xì)胞是1978年中通過融合的方法，從有抗羊紅細(xì)胞活性的BALB/c小鼠的脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞系P3X63Ag8融合的雜交瘤SP2/HL-Ag亞克隆中分離得到。它不分泌任何免疫球蛋白抗體鏈，能耐受8-氮鳥嘌呤（8-azaguanine）20g/ml，但在含HAT選擇培養(yǎng)基中不能存活。通常用的培養(yǎng)基為DMEM培養(yǎng)基，添加10%胎牛血清。該細(xì)胞系已被廣泛地用于單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞的制備和抗體的生產(chǎn)。近年來正在被開發(fā)為生產(chǎn)其他藥品的高表達(dá)宿主三、常用生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞的特性（8）Sf-9：1983年從親代IPLB-SF21AE中克隆形成。親代細(xì)胞則在1977年從秋粘蟲（Spodopterafrugiperda)的蛹卵組織中分離獲得。它對苜宿尺蠖核型多角體病毒（AutographacaliforniaMNPV）和其他桿狀病毒（Baculovirus）高度敏感。通常用的培養(yǎng)基為Grace培養(yǎng)基，添加3.3g/L水解乳蛋白和3.3g/L酵母浸液，以及10%胎牛血清。目前已經(jīng)被廣泛用于高效表達(dá)外來蛋白制品。四、基因工程細(xì)胞的構(gòu)建和篩選原代細(xì)胞、二倍體細(xì)胞系和轉(zhuǎn)化細(xì)胞系三者在生產(chǎn)中都有使用，但在生產(chǎn)中采用更多的、更有前景的是融合細(xì)胞及采用基因工程手段構(gòu)建的各種工程細(xì)胞。當(dāng)前被用以構(gòu)建工程細(xì)胞的動(dòng)物細(xì)胞有CHO-dhfr-、BHK-21、Namalwa、Vero、SP2/0和Sf-9等細(xì)胞。那么如何獲得動(dòng)物工程細(xì)胞呢？四、基因工程細(xì)胞的構(gòu)建和篩選1、真核細(xì)胞基因表達(dá)載體的構(gòu)建2、基因載體的導(dǎo)入和高效表達(dá)工程細(xì)胞株的篩選1、真核細(xì)胞基因表達(dá)載體的構(gòu)建目前一般使用的載體有兩類：一是病毒載體，如牛痘病毒、腺病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒和桿狀病毒等。牛痘病毒已被廣泛地用來構(gòu)建成多價(jià)疫苗，腺病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體正被試用用于基因治療中，而桿狀病毒載體-昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)已被成功地用于300多種外源基因的高效表達(dá)。用桿狀病毒做載體有許多優(yōu)點(diǎn)：（1）該病毒基因組是雙鏈DNA，容易進(jìn)行重組；（2）插入7~8kb的DNA不影響正常病毒粒子的形成；（3）多角體蛋白和病毒粒子的形成無直接關(guān)系，因此用外源基因更換多角體蛋白基因，仍能形成有感染力的病毒粒子；（4）多角體蛋白基因有非常強(qiáng)的啟動(dòng)子，產(chǎn)生的蛋白質(zhì)可占全部蛋白質(zhì)的20~30%；（5）用光學(xué)顯微鏡可看到多角體，容易以此為標(biāo)記物來挑選陽性克??；（6）如果用家蠶桿狀病毒，還可在蠶體直接表達(dá)外源基因。1、真核細(xì)胞基因表達(dá)載體的構(gòu)建1、真核細(xì)胞基因表達(dá)載體的構(gòu)建另一類是質(zhì)粒載體，而且常常是穿梭質(zhì)粒載體，即在細(xì)菌和哺乳動(dòng)物細(xì)胞兩者體內(nèi)都能擴(kuò)增。構(gòu)建此類載體一般含有如下基本成分：（1）允許載體在細(xì)菌體內(nèi)擴(kuò)增的質(zhì)粒序列。多數(shù)含有質(zhì)粒pBR322或其衍生載體pAT153的序列，包括能使質(zhì)粒在細(xì)菌體內(nèi)復(fù)制的起始位點(diǎn)和抗生素標(biāo)記基因（2）含有能使基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的調(diào)控元件，在5’端轉(zhuǎn)錄起動(dòng)需要有啟動(dòng)子，包括帽狀位點(diǎn)（RNA轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)）上游約30堿基處的TATA框和上游70~90堿基處的CAAT框序列和增強(qiáng)子。當(dāng)前構(gòu)建載體的許多啟動(dòng)子序列都來自病毒。也有其它來源的啟動(dòng)子。此外，在基因3’端應(yīng)有終止序列、RNA3’端的切割序列和polyA序列等。近來有人在載體里加入顯性活動(dòng)調(diào)控區(qū)（DCR）序列，以此來克服因載體整合在宿主基因組位點(diǎn)而產(chǎn)生的表達(dá)水平降低。1、真核細(xì)胞基因表達(dá)載體的構(gòu)建1、真核細(xì)胞基因表達(dá)載體的構(gòu)建（3）能用以篩選出外源基因已整合的選擇標(biāo)記。一般有兩類標(biāo)記：一類僅適合用于密切相關(guān)的突變細(xì)胞株，如采用標(biāo)記基因hgprt、tk和aprt等基因，它們僅適用于hgprt-（次黃嘌呤一鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶缺陷型）、tk--（胸苷激酶缺陷型）和aprt--（腺嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶缺陷型）等基因缺失的細(xì)胞株。另一類是顯性作用基因，如neo基因，它能使氨基糖苷抗生素—新霉素磷酸化而失活，從而使原來對新霉素敏感的哺乳動(dòng)物細(xì)胞一旦獲得含該基因的載體后，就能在含該抗生素的培養(yǎng)基中存活。（4）有時(shí)還帶有選擇性增加拷貝數(shù)的擴(kuò)增系統(tǒng)。最常用的是編碼二氫葉酸還原酶的基因。該酶的擴(kuò)增可防止氨甲喋呤（MTX）對細(xì)胞的毒害作用。利用該原理，在構(gòu)建載體時(shí)可有意識地將它與目的基因重組在一起，當(dāng)在培養(yǎng)基內(nèi)增加MTX濃度時(shí)，就會(huì)促使dhfr基因的擴(kuò)增，同時(shí)也會(huì)使其毗鄰的目的基因隨之?dāng)U增，從而大大提高表達(dá)量。類似的擴(kuò)增系統(tǒng)還有谷氨酰胺合成酶和腺苷脫氫酶等系統(tǒng)。1、真核細(xì)胞基因表達(dá)載體的構(gòu)建2、基因載體的導(dǎo)入和高效表達(dá)工程細(xì)胞株的篩選（1）DNA導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞方法：

融合法化學(xué)法物理法病毒法細(xì)胞融合法DNA-磷酸鈣沉淀法

電穿孔法重組逆轉(zhuǎn)錄病毒脂質(zhì)體介導(dǎo)法DEAE-葡聚糖法顯微注射法重組DNA病毒原生質(zhì)融合法染色體介導(dǎo)法基因槍法多瘤病毒樣顆粒微細(xì)胞介導(dǎo)法鬼影紅細(xì)胞介導(dǎo)法介導(dǎo)法介導(dǎo)法2、基因載體的導(dǎo)入和高效表達(dá)工程細(xì)胞株的篩選（2）篩選：外源基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞的效率是很低的，首先要依靠構(gòu)建載體內(nèi)的選擇標(biāo)記采用相應(yīng)的篩選系統(tǒng)，如用HAT（次黃嘌呤、氨基喋呤、胸腺嘧啶）選擇系統(tǒng)，篩選tk+、hgprt+的轉(zhuǎn)化細(xì)胞；用G418（Geneticin）選擇系統(tǒng)，篩選Neor的轉(zhuǎn)化細(xì)胞；用MTX選擇系統(tǒng)，篩選dhfr+的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，等等。其次是對選出的細(xì)胞進(jìn)行克隆和亞克隆使其純化。最后在多數(shù)情況下需利用其擴(kuò)增系統(tǒng)，不斷增加其基因拷貝數(shù)，從而獲得高效表達(dá)而穩(wěn)定的工程細(xì)胞株。2、基因載體的導(dǎo)入和高效表達(dá)工程細(xì)胞株的篩選五、細(xì)胞庫的建立除原代細(xì)胞外，其它的細(xì)胞株、細(xì)胞系都需要建細(xì)胞庫加以保存。按照我國和美國FDA的規(guī)定，用于生產(chǎn)的工程細(xì)胞必須建立兩個(gè)細(xì)胞庫：原始細(xì)胞庫（mastercellbank，MCB）和生產(chǎn)用細(xì)胞庫（manugacture’sworkingcellbank，MWCB）或稱工作細(xì)胞庫（workingcellbank，WCB）。五、細(xì)胞庫的建立儲存于MCB的細(xì)胞應(yīng)該是單一來源的均質(zhì)的細(xì)胞，對于二倍體細(xì)胞應(yīng)該是群體倍增水平盡可能低的細(xì)胞。儲存時(shí)應(yīng)具有該細(xì)胞詳細(xì)檔案，包括：（1）該細(xì)胞系的歷史：來源、動(dòng)物的年齡和性別、細(xì)胞分離的方法和所用的培養(yǎng)材料等（若來源于人，則還需要知道該人的病史，以便檢查是否存在著病原體）；（2）該細(xì)胞的特性：形態(tài)、生長特性如倍增時(shí)間和分種比等。種源的特性，如核型、同工酶、細(xì)胞抗原、以及特異的標(biāo)記染色體等。若是用于生產(chǎn)的重組細(xì)胞，在需有載體構(gòu)建的資料、基因拷貝數(shù)、表達(dá)產(chǎn)物的性質(zhì)和產(chǎn)量及其穩(wěn)定性等。（3）對各種有害因子的檢查結(jié)果：細(xì)菌、真菌、支原體和各種病毒，包括逆轉(zhuǎn)錄病毒等。培養(yǎng)簡歷：組織來源日期、物種、組織起源、性別、年齡、供體正?；虍惓＝】禒顟B(tài)、細(xì)胞已傳代數(shù)等

凍存液：培養(yǎng)基和防凍液名稱

細(xì)胞活力：融解前后細(xì)胞接種存活率和生長特性

培養(yǎng)液：培養(yǎng)基種類和名稱（一般要求不含抗生素）、血清來源和含量

細(xì)胞形態(tài)：類型，如為上皮或成纖維細(xì)胞等，融解后細(xì)胞生長特性

核

型：二倍體或多倍體，標(biāo)記染色體的有無

無污染檢測：包括細(xì)菌、真菌、支原體、原蟲和病毒等

物種檢測：檢測同工酶，主要為G6PD和LDH，以證明細(xì)胞有否交叉污染以及反轉(zhuǎn)錄酶檢測

免疫檢測：一兩種血清學(xué)檢測

細(xì)胞建立者：建立者姓名；檢測者姓名

五、細(xì)胞庫的建立儲存于MWCB的細(xì)胞應(yīng)該是從MCB來的，或從單一安瓿來，或從多個(gè)安瓿在融化即刻混合在一起的，然后經(jīng)培養(yǎng)擴(kuò)增到一定數(shù)量后，再分裝儲存形成的細(xì)胞庫。同樣該細(xì)胞庫也必須建立檔案，而且需要進(jìn)行無菌性和無細(xì)胞交叉污染的檢查。生產(chǎn)時(shí)需確定其最高使用的傳代數(shù)。第四節(jié)動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基為了使細(xì)胞培養(yǎng)在體外培養(yǎng)成功，需要一些基本條件：（1）絕對無菌操作；（2）足夠的營養(yǎng)供應(yīng)，排除有害物質(zhì)包括極其微量的離子摻入；（3）適量氧氣供應(yīng)；（4）隨時(shí)清除細(xì)胞代謝中產(chǎn)生的有害產(chǎn)物；（5）有良好的適于生存外界環(huán)境，包括pH、滲透壓和離子濃度等；（6）及時(shí)分種，保持合適的細(xì)胞密度。第四節(jié)動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基一、動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)條件二、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基的種類和組成一、動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)條件1、器材的清洗和消毒器材的清洗：一般來說，需經(jīng)浸泡、刷洗、泡酸和沖洗四個(gè)步驟，用過的器材最好盡快地浸泡在3%的磷酸三鈉溶液內(nèi)過夜，以除去蛋白質(zhì)和殘余細(xì)胞等污垢。器材的消毒滅菌：主要通過物理方法和化學(xué)方法來達(dá)到嚴(yán)格無菌的操作過程。盡量避免使用抗生素，但在工業(yè)生產(chǎn)中還是經(jīng)常使用的。常用抗生素及其濃度見表3-5一、動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)條件2、水質(zhì)蒸餾、離子交換、電滲析、反滲透、中空纖維過濾等單獨(dú)使用或配合使用，制備純水，一般要求金屬離子含量很低，電阻值在18M

以上。動(dòng)物細(xì)胞制藥用水，要求去熱源。一、動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)條件3、pHpH的高低對細(xì)胞各種酶的活性、細(xì)胞壁的通透性以及許多蛋白的功能都有重要的影響。動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的最適pH為7.2~7.4，低于6.8或高于7.6時(shí)會(huì)對細(xì)胞產(chǎn)生不利影響，嚴(yán)重時(shí)會(huì)引起細(xì)胞退變甚至死亡。一般來說，傳代細(xì)胞比原代細(xì)胞對pH變動(dòng)的耐受性強(qiáng)，細(xì)胞量多時(shí)比細(xì)胞量少時(shí)耐受性強(qiáng)。細(xì)胞代謝也會(huì)造成pH變化，可用緩沖體系來穩(wěn)定細(xì)胞周圍環(huán)境的pH。書中給出了部分緩沖體系，可以參考。一、動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)條件4、滲透壓在細(xì)胞培養(yǎng)的所有操作中，為了使與細(xì)胞接觸的所有液體都保持有較合適的滲透壓和pH，一般都需要使用平衡鹽溶液（balancedsaltsolution,BSS），它由無機(jī)鹽和葡萄糖組成。表3-6列出了幾種常用平衡鹽溶液（BSS）組成/g·L-1。二、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基的種類和組成細(xì)胞種系不同對培養(yǎng)基的要求亦有差異，主要有三類：天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基和無血清培養(yǎng)基。1、天然培養(yǎng)基：在細(xì)胞培養(yǎng)的早期階段使用的培養(yǎng)基，主要為來自天然的材料如血漿凝塊、血清、淋巴液、胚胎浸液以及羊水、腹水等。2、合成培養(yǎng)基：優(yōu)點(diǎn)是成分明確，組分穩(wěn)定，可大量生產(chǎn)供應(yīng)。動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中常用的有BME、MEM、DMEM、HAMF12、RPMI1640以及ISOCOV、199和McCoy等，構(gòu)成這些培養(yǎng)基的主要成分見書中表3-7。二、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基的種類和組成上述合成培養(yǎng)基中主要有氨基酸、維生素、糖類、無機(jī)鹽以及其它一些特定成分如核酸的前體腺苷、鳥苷等。為了給細(xì)胞培養(yǎng)以更大的方便，以便于其增殖或貼附生長，常向培養(yǎng)基中加入一定量的動(dòng)物血清，常用的是添加5%~10%的小牛血清，雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)中，血清可能要求的更高，常用10~20%的胎牛血清。血清的作用機(jī)制可能為：（1）提供有利于細(xì)胞生長增殖所需要的各種生長因子和激素；（2）提供有利于細(xì)胞貼壁所需要的貼附因子和伸展因子；（3）提供可識別金屬、激素、維生素和脂類的結(jié)合蛋白；（4）提供細(xì)胞生長所必須的脂肪酸和微量元素。二、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基的種類和組成3、無血清培養(yǎng)基無血清培養(yǎng)基的優(yōu)點(diǎn)如下：①提高了細(xì)胞培養(yǎng)的可重復(fù)性，避免了由于血清批之間差異的影響；②減少了由血清帶來的病毒、真菌和支原體等微生物污染的危險(xiǎn)；③供應(yīng)充足、穩(wěn)定；④細(xì)胞產(chǎn)品容易純化；⑤避免了血清中某些因素對有些細(xì)胞的毒性；⑥減少了血清中蛋白對某些生物測定的干擾，便于實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析。目前已經(jīng)有市售無血清培養(yǎng)基（書中表3-8所示）。無血清培養(yǎng)基中都是在合成培養(yǎng)基內(nèi)加入不同種類的添加劑所構(gòu)成，大致有以下幾類：（1）激素和生長因子：使用最多的是胰島素，促進(jìn)糖原和脂肪酸的合成，對細(xì)胞生長有刺激作用。

（2）結(jié)合蛋白：最經(jīng)常被補(bǔ)充的是鐵傳遞蛋白和白蛋白。為了便于純化，有時(shí)可用硫酸亞鐵、檸檬酸鐵、葡萄糖酸鐵代替鐵傳遞蛋白。

（3）貼附和伸展因子：目前多數(shù)無血清培養(yǎng)基只適用于懸浮細(xì)胞，真正能用以培養(yǎng)貼壁細(xì)胞的很少，也很貴，原因在于它們均缺少必需的貼附和伸展因子，除這些因子外，有的還添加維生素A酸和重組的小肽，它可與細(xì)胞的受體結(jié)合。

（4）其它有利于細(xì)胞生長的因子和元素：它們包括有消除氧自由基損害的谷胱甘肽，某些微量元素，如硒等。第五節(jié)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法細(xì)胞培養(yǎng)的方法，一般可以根據(jù)細(xì)胞的種類分為原代和傳代培養(yǎng)；又可以根據(jù)培養(yǎng)基的不同分為液體培養(yǎng)和固體培養(yǎng)；還可以根據(jù)培養(yǎng)容器和方式不同分為靜止培養(yǎng)、旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)、攪拌培養(yǎng)、微載體培養(yǎng)、中空纖維培養(yǎng)、固定化培養(yǎng)等。其基本技術(shù)都是類似的，介紹細(xì)胞培養(yǎng)必須掌握的基本方法和技術(shù)。一、細(xì)胞分離1.離心分離法主要用于從含有細(xì)胞的體液如血液、羊水等中分離細(xì)胞。800～1000r/min離心5～10min即可。2.消化分離法該法是先從生物體取來組織塊，將其剪碎，并用消化液將其消化，使組織松散成細(xì)胞懸液，然后用緩沖液洗滌、離心、去除殘留的消化液而獲得所需的細(xì)胞。常用的消化物有胰蛋白酶、EDTA、膠原酶、鏈霉蛋白酶、木瓜蛋白酶等。1.胰蛋白酶胰蛋白酶(胰酸)溶液是一種常用的細(xì)胞消化液，原代培養(yǎng)時(shí)用于處理組織塊，使細(xì)胞分離下來。傳代時(shí)用胰蛋白酶使培養(yǎng)細(xì)胞離開所貼附的培養(yǎng)瓶表面，并分散成單個(gè)細(xì)胞。胰蛋白酶主要采自?；蜇i的胰臟，呈白色粉末狀，易潮解，應(yīng)在低溫干燥處保存。胰酶的活力常用一份胰酶解離酪蛋白的份數(shù)表示，常用胰酶活力為1：125或1：250。胰蛋白酶對細(xì)胞的分離效果與細(xì)胞的類型、特性和瓶壁表面特性有關(guān)。一般來說濃度大、溫度高(勿高于37℃)、作用時(shí)間長，則對細(xì)胞分離能力大。但超過一定程度會(huì)損傷細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞傳代后不能貼壁或死亡。胰酶在pH8.0、37℃時(shí)消化能力最強(qiáng)。溶液中的Ca2+、Mg2+和血清會(huì)降低胰酶活力，所以配制胰酶時(shí)須用無Ca2+、Mg2+的D-Hanks液。當(dāng)消化結(jié)束時(shí)，可加入少量血清或含血清的培養(yǎng)基以終止胰酶作用。細(xì)胞傳代使用的胰酶濃度是0．25％或0．2％。用于原代細(xì)胞培養(yǎng)消化組織塊則為0．1％或0．125％。Hanks液是常見的平衡鹽溶液(BSS)之一。D-Hanks液則是無鈣鎂離子的Hanks液。BSS與細(xì)胞生長狀態(tài)下的pH值、滲透壓及無菌狀態(tài)一致，且配方簡單，是組織培養(yǎng)基本用液，常用于配制培養(yǎng)基及其他用液，或洗細(xì)胞等，細(xì)胞在BSS中可生存幾個(gè)小時(shí)。配制1％胰蛋白酶消化液

1．D．Hanks液高壓滅菌之后，晾至室溫，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2．稱取10g胰蛋白酶粉末加入少量D－Hanks液調(diào)成糊狀，再補(bǔ)足4℃預(yù)冷的適量D-Hanks液至1000ml，4℃下磁力攪拌使完全溶解。

3．用NaHC03干粉將胰酶溶液的pH值調(diào)至8.0左右(胰酶作用的最適pH值)

4．分裝成小份，過濾除菌，－20℃凍存。用時(shí)用D．Hanks液稀釋成0.25％或0.125％二、細(xì)胞計(jì)數(shù)（1）

細(xì)胞形態(tài)觀測及活細(xì)胞計(jì)數(shù)：計(jì)算細(xì)胞數(shù)目可用血球計(jì)數(shù)盤或是粒子計(jì)數(shù)器自動(dòng)計(jì)數(shù)。粒子計(jì)數(shù)器：電子細(xì)胞自動(dòng)計(jì)數(shù)器，它的原理是讓一定體積的細(xì)胞懸液經(jīng)一小孔，并在兩個(gè)電極間通過，此時(shí)通過的細(xì)胞就會(huì)對電極間的電流產(chǎn)生干擾而使電壓發(fā)生改變，這樣就會(huì)在電子計(jì)數(shù)器上形成一個(gè)信號被記錄下來。該法的優(yōu)點(diǎn)是計(jì)數(shù)速度快，缺點(diǎn)是無法分辨活細(xì)胞和死細(xì)胞，并會(huì)誤將細(xì)胞結(jié)團(tuán)當(dāng)作單個(gè)細(xì)胞記錄下來，使計(jì)算數(shù)值偏低。血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)：先根據(jù)情況用培養(yǎng)基將細(xì)胞懸液作適當(dāng)稀釋，然后用吸管吸取少量懸液，滴于計(jì)數(shù)板上的蓋玻片一段，讓液體自動(dòng)進(jìn)入蓋片下方間隙。鏡下觀察并計(jì)數(shù)。壓線只計(jì)上線和右線的細(xì)胞。血球計(jì)數(shù)盤一般有二個(gè)室，每個(gè)室中細(xì)刻9個(gè)1mm2

大正方形，其中4個(gè)角落之正方形再細(xì)刻16個(gè)小格，深度均為0.1mm。當(dāng)chamber上方蓋上蓋玻片后，每個(gè)大正方形之體積為1mm2x0.1mm=1.0x10-4ml。使用時(shí)，計(jì)數(shù)每個(gè)大正方形內(nèi)之細(xì)胞數(shù)目，乘以稀釋倍數(shù)，再乘以104，即為每ml中的細(xì)胞數(shù)目。

血球計(jì)數(shù)板

4大格細(xì)胞總數(shù)細(xì)胞數(shù)=—————————×104×稀釋倍數(shù)

4鏡下偶見由兩個(gè)以上細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán)，應(yīng)按單個(gè)細(xì)胞計(jì)算，若細(xì)胞團(tuán)占10%以上，說明分散不好，需重新制備細(xì)胞懸液。范例：

T75monolayerculture制成10ml細(xì)胞懸浮液，取0.1ml溶液與0.1ml臺盼蘭混合均勻于試管中，取少許混合液加入血球計(jì)數(shù)盤，計(jì)數(shù)四大方格內(nèi)。

細(xì)胞數(shù)目。

活細(xì)胞數(shù)/方格：55,62,49,59

死細(xì)胞數(shù)/方格：5,3,4,6

細(xì)胞總數(shù)=243

平均細(xì)胞數(shù)/方格=60.75

稀釋倍數(shù)=2

細(xì)胞數(shù)/ml：60.75x104x2=1.22x106

細(xì)胞數(shù)/flask：1.22x106x10ml=12.2x106

存活率：225/243﹦92.6%(2)細(xì)胞活力檢測染料排除法臺盼蘭苯胺黑藻紅B結(jié)晶紫——活細(xì)胞著色

死細(xì)胞著色

MTT法：活細(xì)胞中的線粒體琥珀酸脫氫酶可將黃綠色的MTT降解成蘭色結(jié)晶狀甲贊顆粒積于細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞周圍。其量與細(xì)胞數(shù)呈正比，也與細(xì)胞活力呈正比。通過比色可測定存活率。存活率=活細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%三、細(xì)胞的傳代細(xì)胞增值到一定程度，由于各種因素的限制，如不及時(shí)分種，細(xì)胞就會(huì)死亡、脫落。故在細(xì)胞的培養(yǎng)過程中要及時(shí)的傳代。1.懸浮細(xì)胞的傳代較容易，只要加入一倍或幾倍的生長液，然后分鐘兩只或多只培養(yǎng)瓶即可。2.貼壁細(xì)胞的傳代需經(jīng)消化液消化后再分種。(1)

細(xì)胞長滿瓶底后，換液，棄去舊培養(yǎng)液，用PBS洗兩遍，加入新鮮培養(yǎng)液。(2)

次日消化細(xì)胞；棄去原培養(yǎng)液，用PBS洗兩遍，加入消化液（0.25％胰蛋白酶：0.1％EDTA＝1：1），室溫放置2～5min。(3)

棄去胰酶溶液，加入等量培養(yǎng)液終止胰酶消化，吸管吹打，使成單細(xì)胞懸液。(4)

把細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管。4℃，1000g離心10min，棄上清。(5)

加入新培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞成單個(gè)細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，并計(jì)數(shù)細(xì)胞密度。(6)

在預(yù)傳代的瓶中加入新培養(yǎng)液，把細(xì)胞懸液加入到預(yù)傳代細(xì)胞瓶。注意事項(xiàng)：消化前需先觀察細(xì)胞有無污染加入消化液的量要適當(dāng)，以搖動(dòng)時(shí)能蓋滿單層細(xì)胞為度。消化時(shí)間不宜過久，一般靜置2～5min，當(dāng)細(xì)胞層出現(xiàn)麻布樣網(wǎng)孔時(shí)，即可倒去消化液。終止消化要去掉消化液，然后加入有血清的培養(yǎng)基。分種量的多少取決于細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞特性，多數(shù)為1傳2或1傳3為好。已培養(yǎng)過的瓶子可再次使用，但一般不要超過2～3次二倍體細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)每次傳代必須寫上傳代次數(shù)。傳代后一般每天或隔一天換液，每3～5天傳代一次。四、細(xì)胞的凍存和復(fù)蘇1.細(xì)胞的凍存細(xì)胞在低溫時(shí)代謝降低，從而大大的延長了它的存活時(shí)間。為了保存細(xì)胞，都采用液氮低溫（-196℃）凍存的方法。凍存過程中，滲透壓的改變會(huì)影響到脂蛋白，使細(xì)胞膜破裂。為了防止電解質(zhì)過分濃縮，可采用某些保護(hù)劑，如甘油或二甲基亞砜。冷凍時(shí)，冷凍速度不能太快也不能太慢，一般要求以1℃/min的速度下降為宜。可采用下面幾種方法：將安培瓶放在壁厚1.5cm的聚乙稀盒內(nèi)，然后放在-70℃內(nèi)2h，再轉(zhuǎn)入液氮。先將安培瓶置4℃4～5h或過夜，再放在-70℃內(nèi)2h，然后再懸于液氮罐頸口1h，最后浸入液氮。放在凍存簡易裝置內(nèi)，置于液氮罐頸口，離液氮面5～10cm，2～3h后浸入液氮。實(shí)例：(1)選取對數(shù)增長期細(xì)胞，在收集細(xì)胞前24小時(shí)換液一次。(2)按常規(guī)方法把培養(yǎng)細(xì)胞消化下來，制備成細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)，使總數(shù)達(dá)2×106/mL左右，離心（1000g，5min）,去上清。(3)用等量凍存液（含20％小牛血清，10％DMSO的DMEM培養(yǎng)液），用吸管輕輕吹打成細(xì)胞懸液。(4)分裝入凍存管中，擰緊，用封口膜封嚴(yán)；分別于凍存管管壁和管蓋編號。(5)將凍存管放入凍存袋中，并在凍存記錄本上注明位置，細(xì)胞名稱，凍存日期；(6)將凍存袋裝入液氮罐中，以1℃/min的速度，在30

40min之內(nèi)下降到液氮表面，再經(jīng)30min后，投入液氮中（定速降溫設(shè)備）?；蛘呦确旁?/p>

20℃冰箱放置2h，然后轉(zhuǎn)入

80℃冰箱，可以

80℃冰箱一直凍存或者1

14天后轉(zhuǎn)入液氮凍存。注意事項(xiàng)：凍存的細(xì)胞處在良好的營養(yǎng)狀態(tài)，故在凍存前一天要換液培養(yǎng)細(xì)胞密度以1×106～2×106/ml為好。配制凍存用培養(yǎng)基要與實(shí)際使用的一致，另加保護(hù)劑二甲基亞砜或甘油10％，二甲基亞砜用過濾滅菌。安培瓶封口后要檢查其密封性。標(biāo)簽上寫上細(xì)胞的名稱，編號和凍存日期細(xì)胞的復(fù)蘇要求：快融。操作：

(1)把從液氮中取出的冰凍細(xì)胞，立即將凍存管放入42℃水浴，待其將融化后，用酒精棉球擦凈，把細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入離心管，再慢慢補(bǔ)加少量培養(yǎng)液；(2)離心（1000g，5min），棄上清用培養(yǎng)液輕輕懸浮細(xì)胞；再離心（1000g，5min），棄上清，再用培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，接種到培養(yǎng)瓶培養(yǎng)。(3)次日更換一次培養(yǎng)液后，按常規(guī)培養(yǎng)。細(xì)胞凍存：1.取生長狀態(tài)好的細(xì)胞制成懸液，2.離心洗滌，3.加含10%DMSO動(dòng)存液4.加入安培瓶，5.熔封，6.-70℃放置2-3h，7.移入液氮罐，8.記錄

細(xì)胞復(fù)蘇9.取出安培瓶放入37℃水浴中，10.消毒安培瓶開封將細(xì)胞移入離心管家培養(yǎng)基離心，11.計(jì)數(shù)，12.接種培養(yǎng)瓶培養(yǎng)。注意：為防止安培瓶爆炸，一定要戴面罩和手套從液氮罐取出后應(yīng)立即丟入成有37～42℃溫水的搪瓷杯內(nèi)，并攪動(dòng)加速融化。用乙醇消毒安培瓶外表由于DMSO對細(xì)胞有一定的毒性，故應(yīng)盡早去除?；蛄⒓措x心，換上新鮮培養(yǎng)基；或先將細(xì)胞懸液直接種入培養(yǎng)瓶內(nèi)，4～6h后，待細(xì)胞貼壁后立即換液隔天觀察細(xì)胞生長情況，再換液一次。第六節(jié)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的方法和操作方式一、動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的方法從生產(chǎn)實(shí)際來看，動(dòng)物細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)主要可分為懸浮培養(yǎng)、貼壁培養(yǎng)和貼壁-懸浮培養(yǎng)。二、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的操作方式無論是哪種培養(yǎng)，其操作方式與細(xì)菌培養(yǎng)一樣，一般可分為分批式操作、補(bǔ)料-分批（或流加式）操作、半連續(xù)式操作、連續(xù)式操作和灌流式操作，其中補(bǔ)料-分批（或流加式）操作在用細(xì)菌生產(chǎn)時(shí)被普遍采用，但在動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中用得較少。其中分批式、半連續(xù)式和灌流式比較重要。一、動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的方法1、懸浮培養(yǎng)（suspensionculture）適用于一切種類的非貼壁依賴性細(xì)胞（懸浮細(xì)胞），也適用于兼性貼壁細(xì)胞。操作簡便，培養(yǎng)條件比較均一，傳質(zhì)傳氧能力強(qiáng)，容易擴(kuò)大培養(yǎng)規(guī)模。但是培養(yǎng)密度不高目前生產(chǎn)中用于懸浮培養(yǎng)的設(shè)備主要是通氣攪拌式生物反應(yīng)器和氣升式生物反應(yīng)器。2、貼壁培養(yǎng)一切貼壁依賴性細(xì)胞，也適用于兼性貼壁細(xì)胞。適用的細(xì)胞種類廣，較容易采用灌流培養(yǎng)的方式使細(xì)胞達(dá)到高密度；不足之處是操作比較麻煩，需要合適的貼附材料和足夠的面積，培養(yǎng)條件不易均一，傳質(zhì)和傳氧效果差。另一種被普遍采用的貼壁培養(yǎng)方法是固定床式生物反應(yīng)器（由連續(xù)流動(dòng)的液體底物和靜止不動(dòng)的固定化生物催化劑組成，另外，也可以由連續(xù)不動(dòng)的氣體和靜止不動(dòng)的固體底物和微生物組成）。但由于該反應(yīng)器中傳質(zhì)和傳氧常出現(xiàn)梯度式不均一現(xiàn)象，故放大受到限制。貼壁培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)的另一個(gè)不同之處是在傳代或擴(kuò)大培養(yǎng)時(shí)，常常需要用酶將其從基質(zhì)上消化下來。一、動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的方法3、貼壁-懸浮培養(yǎng)，或稱假懸浮培養(yǎng)（1）微載體培養(yǎng)：創(chuàng)造大的貼附面積，供細(xì)胞貼附生長增殖，載體體積小，比重較輕，在輕度攪拌下即可攜帶細(xì)胞自由地懸浮在培養(yǎng)基內(nèi)，充分發(fā)揮懸浮培養(yǎng)的一切優(yōu)點(diǎn)。理想的微載體應(yīng)具備：生物相容性、無毒性、表面惰性、比重適當(dāng)（1.030~1.045g/ml）、粒徑均一，在60~250

m之間（溶脹后）、光學(xué)透明、柔軟、耐高壓滅菌溫度、反復(fù)多次使用、制備簡單、原料充分。80年代以后發(fā)展的多孔微載體或微球，有商品出售。一、動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的方法（2）包埋或微囊培養(yǎng)：將細(xì)胞包埋或包裹在凝膠載體或微囊內(nèi)。一般載體材料為：人工合成的polymer、糖類如纖維素等、蛋白質(zhì)如膠原、纖維蛋白等。此方法的優(yōu)點(diǎn)之一是可采用多種生物反應(yīng)器進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)。（3）結(jié)團(tuán)培養(yǎng)：利用細(xì)胞本身形成結(jié)團(tuán)的特點(diǎn)，相互結(jié)團(tuán)后再用懸浮的方法培養(yǎng)，操作簡便，節(jié)省了用于微載體的成本。二、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的操作方式1、分批式操作一種是將細(xì)胞和培養(yǎng)基一次性加入反應(yīng)器內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，此后細(xì)胞不斷增長，產(chǎn)物不斷形成和積累，最后將條件培養(yǎng)基（conditionedmedium），即經(jīng)培養(yǎng)已含有細(xì)胞產(chǎn)物的培養(yǎng)基，或連同細(xì)胞一并取出，培養(yǎng)結(jié)束。另一種是先將細(xì)胞和培養(yǎng)基加入反應(yīng)器，待細(xì)胞生長至一定密度后，向反應(yīng)器內(nèi)加入誘導(dǎo)劑或病毒等，經(jīng)一端時(shí)間作用后，將反應(yīng)物取出，如產(chǎn)生Namalwa干擾素和疫苗等。二、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的操作方式2、半連續(xù)式操作該方式是當(dāng)細(xì)胞和培養(yǎng)基一起加入反應(yīng)器后，在細(xì)胞增長和產(chǎn)物形成過程中，每間隔一段時(shí)間，取出部分培養(yǎng)物，或單純是條件培養(yǎng)基，或連同細(xì)胞、載體一起，然后補(bǔ)充同樣數(shù)量的新鮮培養(yǎng)基，或另加新鮮載體，繼續(xù)培養(yǎng)。該操作方式在動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)和藥品生產(chǎn)中被廣泛采用，它的優(yōu)點(diǎn)是操作簡便，生產(chǎn)效率高，可長期進(jìn)行生產(chǎn)，反復(fù)收獲產(chǎn)品，而且可使細(xì)胞密度和產(chǎn)品產(chǎn)量一直保持在較高的水平。二、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的操作方式3、灌流式操作該方式是當(dāng)細(xì)胞和培養(yǎng)基一起加入反應(yīng)器后，在細(xì)胞增長和產(chǎn)物形成過程中，不斷地將部分條件培養(yǎng)基取出，同時(shí)不斷地補(bǔ)充新鮮培養(yǎng)基。它與連續(xù)式操作不同之處在于取出部分條件培養(yǎng)基時(shí)，絕大部分細(xì)胞仍保留在反應(yīng)器內(nèi)，而連續(xù)式培養(yǎng)則同時(shí)也取出了部分細(xì)胞。該操作方式是近代用動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)各種藥品最被推崇的方式。它的優(yōu)點(diǎn)是：①細(xì)胞可處在較穩(wěn)定的良好的環(huán)境中，有害代謝物濃度低；②可極大地提高細(xì)胞密度，從而極大地提高了產(chǎn)品產(chǎn)量；③產(chǎn)品在罐內(nèi)停留時(shí)間縮短，可及時(shí)收留在低溫下保存，有利于產(chǎn)品質(zhì)量的提高；④培養(yǎng)基的比消耗率較短，加之產(chǎn)量質(zhì)量的提高，生產(chǎn)成本明顯降低。二、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的操作方式灌流式操作在某些生物反應(yīng)器中是唯一可行的操作方式，如中空纖維生物反應(yīng)器、固定床或流化床式反應(yīng)器、膜式生物反應(yīng)器等。在這些反應(yīng)器中，細(xì)胞已被固定，在取出部分條件培養(yǎng)基和補(bǔ)充新鮮培養(yǎng)基和補(bǔ)充新鮮培養(yǎng)基時(shí)，細(xì)胞基本上都被保留反應(yīng)器中，故采用該操作不存在困難。但在微載體培養(yǎng)、懸浮培養(yǎng)和結(jié)團(tuán)培養(yǎng)中，就存在一個(gè)如何使條件培養(yǎng)基和細(xì)胞、載體分離的問題。為了解決該問題，目前采用的方法有與旋轉(zhuǎn)軸連在一起的濾網(wǎng)、有專門用于懸浮細(xì)胞的中空纖維分離器、超聲波分離器和靠微載體自重沉降分離的上細(xì)下粗的排液柱以及靠離心分離的專用離心機(jī)等。菌種篩選搖瓶試驗(yàn)發(fā)酵罐試驗(yàn)第七節(jié)動(dòng)物細(xì)胞生物反應(yīng)器及其檢測控制系統(tǒng)理想的動(dòng)物生物反應(yīng)器必須具備如下一些基本要求：①體系中的其它材料，對細(xì)胞必須無毒性；②生物反應(yīng)器結(jié)構(gòu)的傳質(zhì)、傳熱和混合性能好；③密封性能良好，可避免一切外來微生物的污染；④培養(yǎng)環(huán)境多種物化參數(shù)可自動(dòng)檢測和調(diào)節(jié)控制，控制的精確度高，且能保持環(huán)境質(zhì)量的均一；⑤可長期連續(xù)運(yùn)轉(zhuǎn)，尤其對于動(dòng)物細(xì)胞而言；⑥容器加工制造時(shí)要求內(nèi)面光滑，無死角；⑦拆裝、連接和清潔方便，耐高壓蒸汽消毒便于操作消毒；⑧設(shè)備成本盡可能低。反應(yīng)器可分為實(shí)驗(yàn)室規(guī)模、中試規(guī)模和生產(chǎn)規(guī)模。第七節(jié)動(dòng)物細(xì)胞生物反應(yīng)器及其檢測控制系統(tǒng)一、動(dòng)物細(xì)胞生物反應(yīng)器的類型和其基本結(jié)構(gòu)；二、動(dòng)物細(xì)胞生物反應(yīng)器的檢測控制系統(tǒng)；一、動(dòng)物細(xì)胞生物反應(yīng)器的類型和其基本結(jié)構(gòu)1、攪拌罐式生物反應(yīng)器通過借鑒細(xì)菌發(fā)酵罐得到的動(dòng)物細(xì)胞反應(yīng)器，有如下特點(diǎn)：（1）罐體的高徑比一般采用1~1.5：1，利于增大與空氣的接觸面；培養(yǎng)動(dòng)物的罐底為圓形，以避免細(xì)胞和載體沉積在周邊；（2）為防止攪拌產(chǎn)生的切力損傷細(xì)胞，攪拌速度慢，一般在20~100r/min，故多數(shù)傾向于采用較大的傾斜式槳葉攪拌器或船舶推進(jìn)式槳葉攪拌器（3）一般采用無氣泡通氣系統(tǒng)，以解決由于氣泡破裂時(shí)產(chǎn)生的應(yīng)力對細(xì)胞的損傷；（籠網(wǎng)或聚丙烯中空纖維膜、透氣的硅膠管）（4）高密度、長時(shí)間培養(yǎng)以及提高反應(yīng)器的生產(chǎn)效率考慮，反應(yīng)器常常需要配備有進(jìn)出液體系統(tǒng)，以便進(jìn)行灌流培養(yǎng)，并有使細(xì)胞與培養(yǎng)基分離使細(xì)胞保留在反應(yīng)器內(nèi)的裝置。攪拌罐式生物反應(yīng)器在目前仍然是重要的生產(chǎn)設(shè)備。一、動(dòng)物細(xì)胞生物反應(yīng)器的類型和其基本結(jié)構(gòu)2、氣升式生物反應(yīng)器該反應(yīng)器的特點(diǎn)見圖5-4，與攪拌式生物反應(yīng)器相比，具有剪切力小，混合均一，氧和營養(yǎng)的傳遞好，由于沒有了機(jī)械攪拌的結(jié)構(gòu)，有利于設(shè)備的密封，降低了造價(jià)。操作無噪音；料液可充滿達(dá)80～90％，而不需加消泡劑；維修、操作及清洗簡便，減少雜菌感染。方便PH