分子診斷在感染性疾病中的應(yīng)用

分子診斷在感染性疾病中的應(yīng)用

袁艷軍感染的慨念

感染是病原體在宿主的個體內(nèi)進(jìn)行有害的復(fù)制、繁殖過程.

病原體:細(xì)菌、真菌、病毒、支原體、衣原體、螺旋體、寄生蟲……

條件致病菌微生物人體微生物人體不同的感染狀態(tài)共生狀態(tài)在正常情況下，人體的一些腔道和體表均有微生物寄生感染性疾病的分子診斷策略一般性策略（檢出病原體的DNA/RNA）：判斷有無感染是何種病原體感染常用方法：PCR＋分子探針雜交完整性策略檢出病原體分型（分類）－亞型－耐藥性常用方法：雜交、PCR、基因芯片、DNA測序分子生物學(xué)檢驗技術(shù)在感染性疾病中的應(yīng)用主要包括對病原生物進(jìn)行鑒定、分型、耐藥診斷和治療過程中的療效監(jiān)測等動態(tài)、定量地檢測病原體核酸，能對療效判斷和病情預(yù)后評價提供客觀的依據(jù)目前已經(jīng)應(yīng)用于一些重要的感染性疾病，如結(jié)核病、病毒性肝炎、艾滋病、SARS、人禽流感等感染性疾病的分子診斷臨床價值一、感染性疾病的診斷和治療監(jiān)測

（一）結(jié)核分枝桿菌（二）肝炎病毒

（三）人類免疫缺陷病毒（五）SARS冠狀病毒（四）HPV病毒

感染方式

呼吸道、消化道或皮膚損傷侵入機(jī)體

所致疾病

疾病種類多樣化以肺結(jié)核為主結(jié)核分枝桿菌(M.tuberculosis)生物學(xué)主要特點：1.結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞壁中含有大量脂質(zhì)2.引起的疾病都呈慢性，并伴肉芽腫3.抗酸染色陽性結(jié)核分枝桿菌(M.tuberculosis)

實驗室診斷現(xiàn)狀分子生物學(xué)檢測方法近年來核酸擴(kuò)增技術(shù)和雜交分析技術(shù)的發(fā)展，為分枝桿菌的檢測、鑒定和藥敏實驗提供了極大的方便，可將診斷時間從幾周降低到幾天。結(jié)核病基因診斷技術(shù)主要包括聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、核酸探針雜交、DNA序列測定、基因芯片、基因分型等?，F(xiàn)代分子生物學(xué)快速診斷基因結(jié)構(gòu)分子診斷共價封閉環(huán)狀結(jié)構(gòu)標(biāo)準(zhǔn)株結(jié)核分枝桿菌基因組全長4.4kb,包含4000個蛋白質(zhì)編碼基因和50個RNA編碼基因

基因組特點MDR早期診斷分枝桿菌分子診斷系統(tǒng)

菌種鑒定篩查、鑒別診斷實時熒光PCR基因芯片快速檢測平臺高效：一個樣本可同時檢測結(jié)核分枝桿菌和NTM快速：4周（菌培）3小時靈敏：10個菌/反應(yīng)（TB）；102

個菌/反應(yīng)（NTM）13分枝桿菌核酸檢測功能：TB快速篩查；TB/NTM鑒別診斷高效：同時檢測17種分枝桿菌（包括TB）快速：＞4周（菌種鑒定）6小時靈敏：

103

個菌/反應(yīng)檢測范圍：結(jié)核、胞內(nèi)、鳥、戈登、堪薩斯、偶然、瘰疬、淺黃、土、龜-膿腫、草、不產(chǎn)色、海-潰瘍、金色、蘇爾加、蟾蜍、恥垢。14分枝桿菌菌種鑒定（DNA微陣列芯片法）

通量：兩個一線抗結(jié)核藥（MDR）速度：8周（藥敏）6小時靈敏度：103

個菌/反應(yīng)基于rpoB（利福平）和katG/inhA（異煙肼）的基因突變，對耐多藥結(jié)核病做出快速診斷。15結(jié)核分枝桿菌耐藥基因檢測試劑盒病毒性疾病的分子檢測乙型肝炎病毒（hepatitisBvirus,

HBV）全世界有3.5億慢性攜帶者，75%在亞太地區(qū)每年有一百萬人死于HBV感染，是全球范圍內(nèi)第9位死因中國：50%~70%的人受過感染，8%~10%是HBV攜帶者

世界其它地區(qū)亞太地區(qū)75%75%的長期慢性攜帶者來自亞太地區(qū)HBV的形態(tài)特征

DNA病毒雙鏈（非環(huán)狀）DNA不等長正鏈（2/3）負(fù)鏈最常見的血清型為adw、adr和ayw亞型的地區(qū)分布不同，我國以adr為主，adw次之，而ayw見于新疆、西藏和內(nèi)蒙古等地

HBV基因組結(jié)構(gòu)

pre-S1pre-S1蛋白pre-S2pre-S2蛋白SHBsAgpre-CHBeAgCHBcAgPDNAPXHBxAg編碼HBsAgpre-S2pre-S1S區(qū)C區(qū)P區(qū)X區(qū)基因重疊急性感染時期HBV的標(biāo)志物HBV檢測窗口期血清學(xué)（HBsAg）：56天PCR：33天縮短23天（平均6-15天）HBV分子診斷方法擴(kuò)增位置引物序列擴(kuò)增片段大小(bp)P、X基因特異片段5’-ATACTGCGGAACTCCTAGC-3’2785’-CCGCGTAAAGAGAGGTGCG-3’Ｃ基因特異片段5’-ATACCACAGAGTCTAGACTCGTGGTGGACT-3’4775’-AAGCCCTACGAACCACTGAACAAATGGCAC-3’Ｃ基因特異片段5’-GCTTTGGGGCATGGACATTGACCCCTATAA-3’2585’-ATGGGATCCCTGGATGCTGGGTCTTCCAAA-3’HBV-DNA檢測（PCR）PCR引物是PCR擴(kuò)增的關(guān)鍵，決定擴(kuò)增的特異性和敏感度。PCR引物常根據(jù)其S、C、P和X基因中的高度保守序列來設(shè)計。部分常用的引物序列1．樣本處理（樣本處理區(qū)）2．核酸擴(kuò)增2.1試劑配置（PCR前準(zhǔn)備區(qū)）2.2加樣（樣本處理區(qū)）2.3PCR擴(kuò)增（檢測區(qū)）HBVDNAFQ-PCR（realtimePCR）試劑制備標(biāo)本處理擴(kuò)增檢測xxxHBVDNAFQ-PCR（real-timePCR）結(jié)果判斷：FQ-PCR進(jìn)行HBVDNA的定量檢測，檢測范圍為2.5×102~2.5×109copies/ml

檢測樣本中5×102copies/ml≤HBVDNA≤5×107copies/ml，測定結(jié)果有效，可直接報告相應(yīng)的拷貝數(shù)檢測樣本中HBVDNA>5×107copies/ml，既可直接報告為>5×107copies/ml，也可用正常人血清按10倍剃度做相應(yīng)稀釋，使其拷貝數(shù)落在1×105-5×107copies/ml范圍內(nèi)，再重新測定，測定結(jié)果應(yīng)以稀釋倍數(shù)進(jìn)行校正檢測樣本HBVDNA<5×102copies/ml時，拷貝數(shù)僅供參考，報告為小于最低檢出限Ct值無數(shù)值時,報告為0.0copies/ml支鏈DNA（bDNA）技術(shù)一種核酸探針雜交標(biāo)志信號放大技術(shù)。優(yōu)點：穩(wěn)定性和重復(fù)性較好，結(jié)果準(zhǔn)確，操作簡單，將待測病毒裂解釋放核酸后變性為單鏈，即可進(jìn)行檢測。缺點：敏感性較低、檢測范圍窄而不適用于低水平病毒的檢測。還可以用于乙肝病毒基因檢查的方法主要有：熒光PCR法、競爭PCR法、PCR酶聯(lián)免疫吸附法、熒光標(biāo)記物法和PCR酶聯(lián)化學(xué)發(fā)光等方法。

變異株與耐藥突變檢測

HBV可能發(fā)生自然變異HBV在人體活疫苗接種和抗病毒治療等壓力下發(fā)生變異HBV基因組的變異常引起病毒生物學(xué)特性的改變，從而導(dǎo)致HBV感染發(fā)病機(jī)制的變化、血清學(xué)檢測指標(biāo)的改變以及免疫逃逸，給乙型肝炎的診斷和治療帶來困難一、感染性疾病的診斷和治療監(jiān)測

HBV耐藥突變類型及其核苷酸、氨基酸變化46.91℃54.64℃50.74℃丙型肝炎病毒（HCV）急性丙肝的臨床診斷1.流行病學(xué)史：有輸血史、應(yīng)用血液制品史或明確的HCV暴露史。2.臨床表現(xiàn)：全身乏力、食欲減退、惡心和肝區(qū)疼痛等，其他可有低熱，輕度肝腫大，脾腫大，黃疸。部分患者無明顯癥狀。3.實驗室檢查：ALT多呈輕度和中度升高，抗-HCV和HCVRNA陽性。約90%的輸血后非甲非乙型肝炎和70

80%的無輸血史的散發(fā)型非甲非乙型肝炎由HCV感染所致HCV血中HCV含量僅為HBV的千分之一HCV的細(xì)胞培養(yǎng)尚未成功，病毒的分離極為困難HCV的變異性很高，使其診斷十分困難HCV的免疫學(xué)標(biāo)志僅有抗HCV一項，且由感染至抗體產(chǎn)生大約需要70天，部分病人感染后始終都不形成抗體HCV分子診斷技術(shù)尤為重要HCV基因組（單鏈RNA）呈球形顆粒直徑約50nm有一脂質(zhì)包膜核心：單股正鏈RNA，全長9.4kb僅一個開放讀框（ORF），編碼一條含有3008

3037個氨基酸的病毒前體多肽HCV基因分型的多樣性由于HCV的RNA聚合酶的忠實性不高，所以引起HCV的基因型呈多樣性HCV分為6個主要基因型（Simmonds），HCV亞型已超過50個.HCVRNA基因分型有助于判定治療的難易程度及制定抗病毒治療的個體化方案.HCV分子診斷HCV-RNA定性試驗?zāi)孓D(zhuǎn)錄PCR有許多因素影響著PCR方法，如標(biāo)本處理及儲存形式，引物設(shè)計、擴(kuò)增倍數(shù)、反應(yīng)條件、DNA產(chǎn)物的污染、擴(kuò)增后產(chǎn)物檢測系統(tǒng)等嚴(yán)格的質(zhì)控、操作人員的熟練程度尤為重要HCVRNA定性檢測的特異度在98%以上，只要一次病毒定性檢測為陽性即可確證HCV感染一次檢測陰性不能完全排除HCV感染，應(yīng)重復(fù)檢查HCV-RNA定量試驗

估價血清中HCV-RNA水平反映感染機(jī)體的病毒復(fù)制率及清除率在未治療的慢性丙肝機(jī)體內(nèi)病毒負(fù)荷相對穩(wěn)定目前有二種方法可定量HCV-RNA水平-靶擴(kuò)增技術(shù)如定量PCR方法-信號擴(kuò)增技術(shù)如支鏈DNA法

HCVRNA定量（real-timeRT-PCR）質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)陰性對照的檢測結(jié)果為陰性強(qiáng)陽性對照的Ct值應(yīng)小于等于30.0臨界陽性對照的Ct值應(yīng)大于強(qiáng)陽性對照的Ct值否則此次實驗視為無效結(jié)果判斷Ct值無數(shù)值的樣本為陰性樣本Ct值≤36.0的樣本為陽性Ct值大于36.0的樣本建議重做，重做結(jié)果無數(shù)值者為陰性，否則為陽性HCVRNA定量結(jié)果表示方法HCVRNA定量檢測法有兩種表示方法：拷貝/ml（羅氏公司CobasV2.0）IU/ml（美國國立遺傳學(xué)研究所的SuperQuant）兩者之間可以進(jìn)行換算，IU/ml與拷貝數(shù)/ml換算公式是：IU/ml=0.854

拷貝數(shù)/ml+0.538特別說明應(yīng)注意HCVRNA檢測中的假陽性和假陰性在HCV急性感染期，在血漿或血清中的病毒基因組水平可達(dá)到105～107拷貝/ml在慢性感染者中，HCVRNA水平變化范圍在5×104～5×106拷貝/ml之間，同一患者血液中HCVRNA的水平相對穩(wěn)定HCV病毒載量的高低與疾病的嚴(yán)重程度和疾病的進(jìn)展并無絕對相關(guān)性，但可以作為抗病毒治療療效評估的觀察指標(biāo)（“評估”和“預(yù)測”）

HCV基因型測定

檢測基因型方法一般分為二類：

⑴檢測HCV基因的點突變的篩選試驗⑵評估HCV基因更大片段的驗證性試驗

HCV基因型的篩選試驗有：

(1)對HCV高度保守的5’-NC區(qū)域行限制性片段長度多