第07.08.09.10章 藥物組學(xué)

第七、八、九、十章藥物基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)基因組學(xué)時代已經(jīng)到來1990年人類基因組計(jì)劃的啟動，至2001年公布人類基因組圖譜及初步分析結(jié)果，基因組學(xué)時代已經(jīng)到來。這無疑是人類生命科學(xué)歷史上的一個重大里程碑。人類基因組計(jì)劃的順利實(shí)施，真正成為生命科學(xué)領(lǐng)域第一項(xiàng)巨大的科學(xué)工程，催生孕育了基因組學(xué)的誕生。

基因組學(xué)成為多學(xué)科相互滲透的“大科學(xué)”生物學(xué)科、醫(yī)學(xué)、藥學(xué)、計(jì)算機(jī)科學(xué)、化學(xué)、數(shù)學(xué)、物理學(xué)、電子工程學(xué)、考古學(xué)和地學(xué)等基因組學(xué)無疑已成為當(dāng)前和今后相當(dāng)長的時期內(nèi)較活躍和影響較大的生物科學(xué)前沿學(xué)科之一。主要內(nèi)容第七章藥物基因組學(xué)第八章藥物轉(zhuǎn)錄組學(xué)第九章藥物蛋白質(zhì)組學(xué)

第十章藥物代謝組學(xué)1.藥物基因組學(xué)的誕生和發(fā)展（1）誕生早在20世紀(jì)50年代，人們就發(fā)現(xiàn)不同的遺傳背景會導(dǎo)致藥物反應(yīng)的個體差異（不同個體對同一藥物同一劑量的反應(yīng)存在量與質(zhì)的差別）。70年代末，杰弗里提出基因組中每100個堿基中就會有1個出現(xiàn)變異。80年代后期，這些差異被引進(jìn)藥物遺傳學(xué)，并首次闡明了細(xì)胞色素P450酶系中的CYP2D6的基因多態(tài)性可以導(dǎo)致病人對藥物的代謝出呈現(xiàn)快代謝和慢代謝兩種不同的方式。第七章藥物基因組學(xué)一.藥物基因組學(xué)的介紹到20世紀(jì)末，由于分子生物學(xué)的發(fā)展、分子遺傳學(xué)的發(fā)展和人類基因組計(jì)劃的順利實(shí)施，人類基因的多態(tài)性不斷被發(fā)現(xiàn)和證實(shí)，人們認(rèn)識到人體的許多基因都參與藥物在體內(nèi)的過程，藥物在體內(nèi)的反應(yīng)和代謝也涉及到多個基因的相互作用?；蚨鄳B(tài)性導(dǎo)致了藥物反應(yīng)的多樣性，并在藥物遺傳學(xué)基礎(chǔ)上發(fā)展起來了藥物基因組學(xué)，人類開始從基因組水平研究藥物反應(yīng)的個體差異。從而形成了一門以基因多態(tài)性為基礎(chǔ)研究藥物效應(yīng)的個體間差異及其規(guī)律的新興交叉學(xué)科，即藥物基因組學(xué)。一.藥物基因組學(xué)的介紹藥物基因組學(xué)（pharmacogenomics）是研究遺傳變異與藥物反應(yīng)相互關(guān)系的一門學(xué)科，是以提高藥物的療效和安全性為目標(biāo)。是利用人類基因組學(xué)研究不同人群（個體）基因組的遺傳學(xué)差異對藥物反應(yīng)的影響，以促進(jìn)新藥開發(fā)和臨床個體化用藥的學(xué)科。藥物基因組學(xué)是在藥物遺傳學(xué)（遺傳藥理學(xué)）的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。一句話：研究個體遺傳變異對藥物應(yīng)答的影響。藥物基因組學(xué)不是以發(fā)現(xiàn)新基因、探明疾病的發(fā)生機(jī)制和預(yù)見發(fā)病風(fēng)險為目的，而是利用已知的基因組學(xué)理論，研究遺傳因素對藥物反應(yīng)的影響，或以藥物效應(yīng)和安全性為主要目標(biāo)，研究藥物動力學(xué)和藥效學(xué)差異的基因特征，以及基因變異所致的不同個體對藥物的不同反應(yīng)。從基因水平研究基因序列的多態(tài)性與藥物效應(yīng)多樣性之間的關(guān)系。基因組DNA序列多態(tài)性生命的遺傳信息存儲于DNA序列之中，基因組DNA序列的變異是物種遺傳多樣性的基礎(chǔ)。DNA的多態(tài)性：在長期的進(jìn)化和適應(yīng)環(huán)境的過程中在正常群體中，由于各個體DNA分子的某些位點(diǎn)發(fā)生突變

，產(chǎn)生基因序列差異的現(xiàn)象被稱為基因（或DNA）多態(tài)性。人類基因組中約0.1%差異序列。包含了重要的個體遺傳差異信息，造成了人們患病的不同和對藥物的不同反應(yīng)。分子標(biāo)記的概念

DNA序列差異形成的分子標(biāo)記可以反映群體中存在的差異個體。廣義的分子標(biāo)記(molecularmarker)是指可遺傳的并可檢測的DNA序列和蛋白質(zhì)。狹義的分子標(biāo)記概念只是指DNA標(biāo)記，而這個界定現(xiàn)在被廣泛采納：能反映生物個體或種群間基因組中某種差異特征的DNA片段，它直接反映基因組DNA間的差異。分子遺傳標(biāo)記的特點(diǎn)無表型效應(yīng)不受環(huán)境的限制和影響普遍存在于所有生物數(shù)量豐富等特殊優(yōu)勢分子標(biāo)記的種類

DNA分子標(biāo)記在過去20年得到了迅速發(fā)展,主要可分成三個世代，大致可分為三大類。第一類是以分子雜交為核心的分子標(biāo)記技術(shù)，如：★限制性片段長度多態(tài)性標(biāo)記（Restrictionfragmentlengthpolymorphism,簡稱RFLP標(biāo)記）；其原理為:堿基的改變與染色體結(jié)構(gòu)的變化導(dǎo)致生物個體或種群之間DNA片段酶切位點(diǎn)的變化,用限制性內(nèi)切酶切割改變的DNA,將產(chǎn)生長短、種類、數(shù)目不同的限制性片段,這些片段經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后就會呈現(xiàn)出不同的帶狀分布,而具有差異的DNA片段就可通過Southern雜交檢測出來。第二類是以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR反應(yīng)）為核心的分子標(biāo)記技術(shù)，包括：★隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記（簡稱RAPD標(biāo)記）；★簡單序列重復(fù)標(biāo)記（SSR標(biāo)記）或簡單序列長度多態(tài)性（SSLP標(biāo)記）；★擴(kuò)展片段長度多態(tài)性標(biāo)記（AFLP標(biāo)記）；★序列標(biāo)位（Sequencetaggedsites,簡稱STS標(biāo)記）；第三類是以基因組序列為基礎(chǔ)的一些新型的分子標(biāo)記，如：★單核苷酸多態(tài)性（Singlenuleotidepolymorphism,簡稱SNP標(biāo)記）；★表達(dá)序列標(biāo)簽（Expressedsequencestags,簡稱EST標(biāo)記）等。定義：主要是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。其比較的不是DNA的片段長度，而是相同序列長度里的單個堿基的差別。

1996年，Lander報道了用單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記（singlenucleotidpolymorphismSNP）制備第三代遺傳連鎖圖的遺傳標(biāo)記。單核苷酸多態(tài)性（singlenucleotidpolymorphism，SNP）單核苷酸多態(tài)性（SNPs）的發(fā)生頻率最高，人類DNA中每300個堿基對就有一個SNP，因此，一個人類個體大約攜帶1000萬個SNPs。SNP特點(diǎn)1.最常見的一種2.數(shù)量多、分布廣3.具有遺傳穩(wěn)定性4.具有二態(tài)性5.可以建立單體型區(qū)域6.疾病遺傳機(jī)制的候選改變位點(diǎn)SNP的分布在基因組DNA中,任何堿基均有可能發(fā)生變異,因此SNP既有可能在基因序列內(nèi),也有可能在基因以外的非編碼序列上。①位于基因編碼區(qū)的SNP（cSNP），cSNP又可分為兩種:一種是同義cSNP,即SNP所致編碼序列的改變并不影響其翻譯蛋白質(zhì)的氨基酸序列,突變堿基與未突變堿基的含義相同;另一種是非同義cSNP,指堿基序列的改變可使以其為藍(lán)本翻譯的蛋白質(zhì)序列發(fā)生改變,從而影響蛋白質(zhì)的功能。②5‘非編碼區(qū)；3’非編碼區(qū)；其他非編碼區(qū)（內(nèi)含子外顯子鏈接區(qū)）。檢測方法比較新興的方法包括：Taqman探針技術(shù)、磷酸測序(pyrosequencing)、DNA芯片(DNAchip)分析、變性高效液相色譜(denaturinghighperformanceliquidchromatography,DHPLC)、能量轉(zhuǎn)移標(biāo)記的等位特異PCR、基質(zhì)輔助激光解吸附電離飛行時間質(zhì)譜(matrixassistedlaserdesorptionionizationtimeofflightmassspectrometry,MALDI-TOF)等.國際人類基因組單體型圖計(jì)劃：HapMap計(jì)劃單體型：是指位于一條染色體上某一區(qū)域的傾向于整體遺傳的一組緊密連鎖的遺傳標(biāo)記物，稱作單體型（haplotype）。對SNP而言，專指位于單條染色體上某一區(qū)域的一組相關(guān)聯(lián)的相鄰SNPs的等位位點(diǎn)，傾向于以一個整體遺傳給后代。標(biāo)簽SNP(htSNP）：一個染色體區(qū)域可以有很多SNP位點(diǎn)，但在每一個單體型中總有幾個SNP位點(diǎn)對于檢測這一單體型是必需的，稱為標(biāo)簽SNP.確定單體型只需檢測標(biāo)簽SNP即可?！皣H人類基因組‘單體型圖’計(jì)劃”（ＨａｐＭａｐ）是繼“國際人類基因組計(jì)劃”之后，人類基因組研究領(lǐng)域的又一重大研究計(jì)劃?？茖W(xué)家們將在已完成的人類全基因組序列圖的基礎(chǔ)上，確定人類經(jīng)世代遺傳仍保持完整的單體型圖；以及在不同族群中這些單體型的類型與分布。并將這些不同的單體型標(biāo)上標(biāo)簽。國際人類基因組單體型圖計(jì)劃：HapMap計(jì)劃

HapMap計(jì)劃將鑒定來自世界不同地區(qū)的四個群體的常見單體型，以及特異識別這些單體型的標(biāo)簽SNPs。2002年10月，中國、美國、英國、日本、加拿大五國代表在美國華盛頓正式啟動了這項(xiàng)計(jì)劃。中國完成10％，美國完成31％，日本占25％，英國占24％，加拿大占10％。中國負(fù)責(zé)3號、21號和8號染色體單體型圖的繪制。通過單體型圖計(jì)劃將鑒定出20～100萬個標(biāo)簽SNP位點(diǎn)。

2.藥物基因組學(xué)的研究方法目的：通過基因分型的方式指導(dǎo)個體化治療。核心內(nèi)容：篩選和鑒定與疾病或藥物應(yīng)答表型相關(guān)的遺傳標(biāo)記物。常用方法：關(guān)聯(lián)分析方法。基于候選基因的關(guān)聯(lián)分析和基于全基因組的關(guān)聯(lián)分析3.藥物基因組學(xué)的發(fā)展

目前，藥物基因組學(xué)的發(fā)展就是將近幾年在研究人類基因組與功能基因組中發(fā)展的新技術(shù)（如高通量掃描、生物芯片、高密度單核苷酸多態(tài)性(SNP)、遺傳圖譜、生物信息學(xué)等）新知識，融入到分子醫(yī)學(xué)、藥理學(xué)、毒理學(xué)等諸多領(lǐng)域，并運(yùn)用這些技術(shù)與知識從整個基因組層面系統(tǒng)地去研究不同個體的基因差異與藥物療效的關(guān)系，了解具有重要功能意義的和影響藥物吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝、排泄的多態(tài)性基因，從而明確藥理學(xué)作用的分子機(jī)制以及各種疾病致病的遺傳學(xué)機(jī)理，最終達(dá)到指導(dǎo)臨床合理用藥、引導(dǎo)市場開發(fā)好藥的目的。第八章藥物轉(zhuǎn)錄組學(xué)第一節(jié)轉(zhuǎn)錄組學(xué)概述第二節(jié)轉(zhuǎn)錄組學(xué)在藥學(xué)中的應(yīng)用第二節(jié)轉(zhuǎn)錄組學(xué)概述一、轉(zhuǎn)錄組廣義：指在某一生理?xiàng)l件下，一種細(xì)胞、組織、器官或生物體所能轉(zhuǎn)錄出來的所有RNA的總和。包括mRNA和非編碼RNA。狹義：指活細(xì)胞所能轉(zhuǎn)錄出來的所有mRNA，即從基因組DNA中轉(zhuǎn)錄的基因總和，也稱為表達(dá)譜。轉(zhuǎn)錄組是連接基因組遺傳信息和生物功能的蛋白質(zhì)組的必然紐帶,也是基因功能及結(jié)構(gòu)研究的基礎(chǔ)和出發(fā)點(diǎn)。是基因表達(dá)第一步的產(chǎn)物，是細(xì)胞最重要的組分。轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控是目前研究最多的，也是生物體最重要的調(diào)控方式之一。轉(zhuǎn)錄組與基因組的關(guān)系轉(zhuǎn)錄組是基因組表達(dá)的產(chǎn)物。不同的是轉(zhuǎn)錄組只能是特定時間和空間條件下表達(dá)的基因。轉(zhuǎn)錄組來自于基因組，量小的多但重要。人基因組有30億bp，只有不到3萬個能基因轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄后的mRNA能翻譯成蛋白質(zhì)的只占整個轉(zhuǎn)錄組的40%。轉(zhuǎn)錄組是高度動態(tài)的，轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)通常表現(xiàn)出高度的可變性。二、轉(zhuǎn)錄組學(xué)一、概念：是基因組學(xué)后新興的一門學(xué)科，是一門在整體水平上研究細(xì)胞中基因轉(zhuǎn)錄的情況及轉(zhuǎn)錄調(diào)控規(guī)律的學(xué)科。簡言之，是從RNA尤其是mRNA水平上研究基因表達(dá)情況的學(xué)科。研究的主要內(nèi)容是針對不同條件下基因表達(dá)方式的表征。轉(zhuǎn)錄組學(xué)是基因組學(xué)的重要分支，也是連接基因結(jié)構(gòu)和功能的一個橋梁和紐帶，更是基因調(diào)控研究的主要基礎(chǔ)和層面。研究方法基于雜交技術(shù)：1.基因芯片技術(shù)基于測序的技術(shù)：2.基因表達(dá)系列分析（SAGE）3.大規(guī)模平行信號測序（MPSS）4.RNA測序技術(shù)是一種以測序?yàn)榛A(chǔ),采用數(shù)字化分析手段，在轉(zhuǎn)錄物水平上分析特定組織或細(xì)胞中基因群體表達(dá)狀態(tài)的（基因組表達(dá)模式）的技術(shù)。通過快速和詳細(xì)分析成千上萬個EST來尋找出表達(dá)豐度不同的SAGE標(biāo)簽序列，從而比較完整的獲得基因組的表達(dá)信息。已成為基因表達(dá)定量和定性研究的一種有效工具。2.

基因表達(dá)系列分析技術(shù)（serialanalysisofgeneexpression，SAGE）。1999年發(fā)明基因表達(dá)系列分析技術(shù)SAGE技術(shù)理論上可以檢測到一個細(xì)胞內(nèi)所有轉(zhuǎn)錄體的表達(dá)，而且可以給每一個轉(zhuǎn)錄體定量。SAGE技術(shù)的理論基礎(chǔ)①一個來自轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物3′端特定位置的一個短的寡核苷酸序列(10～14bp)含有足夠信息，能夠鑒定一個特異轉(zhuǎn)錄本，可以作為區(qū)別轉(zhuǎn)錄本的標(biāo)簽(tag);例如：一個10堿基的序列能有410=1048576種不同的排列組合，因此在理論上每一個10堿基標(biāo)簽就能夠代表一種轉(zhuǎn)錄本的特征序列。②將短的標(biāo)簽通過簡單的方法串聯(lián)在一起,形成大量多聯(lián)體,對每個克隆到載體的多聯(lián)體進(jìn)行測序,得到代表轉(zhuǎn)錄本信息的標(biāo)簽序列。并將得到的短序列核苷酸順序以連續(xù)的數(shù)據(jù)形式輸入計(jì)算機(jī)中進(jìn)行處理。③將標(biāo)簽串聯(lián)體的測序信息與已知的標(biāo)簽數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較分析,可確定在特殊條件或生理狀態(tài)下生物體基因的真實(shí)表達(dá)模式,并可根據(jù)標(biāo)簽出現(xiàn)的頻率確定基因的表達(dá)豐度。那么，如何獲得標(biāo)簽?zāi)兀?/p>

(1)提取植物mRNA,以生物素標(biāo)記的oligo(dT)為引物將mRNA反轉(zhuǎn)錄成雙鏈cDNA;(2)錨定酶(AnchoringEnzyme,AE)酶切。AE是一種具有4bp識別位點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶,常用NlaⅢ,識別位點(diǎn)為CATG。能使每一種轉(zhuǎn)錄本至少被酶切一次,獲得mRNApolyA尾部與最近的酶切位點(diǎn)之間的片段；將其作為該轉(zhuǎn)錄物的獨(dú)特信息;(3)將所得cDNA等分為兩部分,分別與接頭1和接頭2（40bp）連接：基本結(jié)構(gòu)為引物1/2結(jié)合序列+標(biāo)簽酶識別位點(diǎn)+錨定酶識別位點(diǎn);(4)標(biāo)簽酶（TE）切割：常用的標(biāo)簽酶如:BsmFI,其切割位點(diǎn)距識別位點(diǎn)10-14bp。產(chǎn)生連有40bp接頭和9－14bp轉(zhuǎn)錄本特異序列的約50bp的cDNA標(biāo)簽1、2。標(biāo)簽1標(biāo)簽2連接酶連接雙標(biāo)簽(ditag)根據(jù)連接子1和2的序列引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增錨定酶（AE）切掉接頭連接雙標(biāo)簽成收含20～50個標(biāo)簽的多標(biāo)簽串聯(lián)體，克隆串聯(lián)體到載體中,得到SAGE文庫、測序。用SAGE軟件分析所得標(biāo)簽數(shù)據(jù)進(jìn)行表達(dá)頻率的分析。將每30～50個雙標(biāo)簽連接起來，并克隆到載體中，建立SAGE文庫；

常規(guī)SAGE方法（shortSAGE）基本流程P194SAGE分析軟件。SAGEmap是NCBI開發(fā)的基于公用SAGE數(shù)據(jù)庫的基因表達(dá)譜分析工具。SAGE結(jié)果分析SAGE技術(shù)的應(yīng)用正常細(xì)胞或組織基因表達(dá)譜研究疾病相關(guān)基因表達(dá)研究染色體表達(dá)圖譜繪制基因功能研究藥物作用機(jī)制的研究毒理學(xué)研究尋找新的基因SAGE實(shí)例LongSAGE技術(shù)標(biāo)簽來自轉(zhuǎn)錄物3’端一段21bp的序列，可以進(jìn)行快速分析并與基因組序列數(shù)據(jù)相匹配。其原理與ShortSAGE方法類似，只是用了不同的IIS類標(biāo)簽酶（MmeI），并將程序做了相應(yīng)修改。第九章藥物蛋白質(zhì)組學(xué)蛋白質(zhì)組（Proteome）這一概念是由澳大利亞學(xué)者Wilkins和Williams等人于1994年提出，并首次公開發(fā)表在1995年7月的Electrophoresis雜志上。其英文PROTEOME是由PROTEins和genOME兩個詞組合而成，意思是“proteinsexpressedbyagenome”。

蛋白質(zhì)組指某一基因組、一個細(xì)胞、一個有機(jī)體或某一特定的組織所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)組學(xué)（proteomics）是指研究蛋白質(zhì)組的科學(xué)，實(shí)質(zhì)上采用大規(guī)模、高通量、高效率的技術(shù)手段研究蛋白質(zhì)的特征、功能，整體上研究基因組所表達(dá)的所有蛋白質(zhì)在不同時間與空間的表達(dá)譜，全景式地揭示生命活動的本質(zhì)。蛋白質(zhì)組學(xué)研究主要涉及的內(nèi)容：一是表達(dá)蛋白質(zhì)組學(xué)，研究差異樣品間蛋白質(zhì)表達(dá)量的變化；二是結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組學(xué)，也稱為細(xì)胞圖譜蛋白質(zhì)組學(xué)，對蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，定位，和相互關(guān)系。三是功能蛋白質(zhì)組學(xué)，研究執(zhí)行某種功能的蛋白質(zhì)復(fù)合體，蛋白質(zhì)間相互作用，蛋白質(zhì)-DNA/RNA相互作用和翻譯后修飾等。新的研究趨勢亞細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)定量蛋白質(zhì)組學(xué)磷