基因工程復習題答案版

PAGEPAGE4基因工程原理復習題思考題考試時間：2009.06.21上午9：00-11：00地點5D305基因工程緒論1、基因工程的定義與特征。定義：在體外把核酸分子（DNA的分離、合成）插入載體分子，構成遺傳物質的新組合（重組DNA），引入原先沒有這類分子的受體細胞內，穩(wěn)定地復制表達繁殖，培育符合人們需要的新品種（品系），生產人類急需的藥品、食品、工業(yè)品等。特征：1、具跨越天然物種屏障的能力。2、強調了確定的DNA片段在新寄主細胞中的擴增。2、試述基因工程的主要研究內容。1）、目的基因的分離2）、DNA的體外重組（載體、受體系統(tǒng)等）3）、重組DNA分子轉移到受體細胞及其篩選4）、基因在受體細胞內的擴增、表達、檢測及其分析。3、基因工程在食品工業(yè)上有何應用發(fā)展？主要是通過基因重組，使各種轉基因生物提高生產谷氨酸、調味劑、酒類和油類等有機物的產率；或者改良這些有機物組成成分，提高利用價值。4、轉基因是一把雙刃劍，請客觀談談對轉基因及轉基因食品安全性的認識。轉基因技術所帶來的好處是顯而易見的，在人類歷史進步和發(fā)展中起到了積極作用。首先，通過該項技術可以提供人們所需要的特性，改良培育新品種；第二，延長食品保存時間或增加營養(yǎng)成分；第三，將抗蟲防菌基因轉入到作物中，使作物本身產生抵抗病蟲害侵襲的能力，減少了農藥的使用量，有利于環(huán)境保護；第四，轉基因技術及基因食物在醫(yī)學方面得到廣泛研究和應用。人們對轉基因技術的主要擔憂在于環(huán)境方面。外源基因的導入可能會造就某種強勢生物，產生新物種或超級雜草、損害非目標生物、破壞原有生物種群的動態(tài)平衡和生物多樣性，也即轉基因生物存在潛在的環(huán)境安全問題。轉基因作物的大面積種植已有數(shù)年，食用轉基因食品的人群至少有10億之多，但至今仍未有轉基因食品對生命造成危害的實例；更何況目前每一種基因工程食品在上市前，都要經過國家法律認可，食品衛(wèi)生部門和環(huán)境部門的嚴格檢測。只有測試合格了，才能投放市場。因此公眾完全可以安全地消費、大膽地食用轉基因食品。第一章

DNA的分子特性與利用原核生物和真核生物的基因表達調控有何差別？1）原核基因表達調控的三個水平：轉錄水平調控、翻譯水平調控、蛋白質加工水平的調控原核基因表達調控主要是在轉錄水平上的調控。2）真核生物基因表達的特點：1．基因組DNA存在的形式與原核生物不同；2．真核生物中轉錄和翻譯分開進行；3．基因表達具有細胞特異性或組織特異性；4．真核基因表達的調控在多個水平上進行：DNA水平的調控、轉錄水平調控、轉錄后水平調控、翻譯水平調控、蛋白質加工水平的調控；什么是基因？根據(jù)基因的產物，基因可分為哪三類？基因是具有生物學功能的、在染色體上占據(jù)一定位置的一段核苷酸序列，是分子遺傳的功能單位。根據(jù)基因的產物，基因可分為三類：轉錄并翻譯編碼蛋白質的基因:包括結構蛋白基因、編碼酶的基因、調節(jié)基因轉錄但不翻譯產物的基因:包括tRNA、rRNA不轉錄但有功能的DNA區(qū)段:如啟動子、操縱基因引起核酸變性的因素主要有哪些？核酸變性后性質有何變化？引起核酸變性的因素：--溫度、酸、堿、甲醛和尿素等。DNA變性后，它的一系列性質發(fā)生變化，如紫外吸收(260nm)值升高（增色效應）,粘度降低等，如DNA增加25－40%.RNA約增加1.1%。。DNA復性及其影響因素。變性DNA在適當?shù)臈l件下，兩條彼此分開的單鏈可以重新締合成為雙螺旋結構，這一過程稱為復性。DNA復性的程度、速率與復性過程的條件有關，也與它本身的組成和結構有關：分子量越大復性越難。濃度越大，復性越容易。（附加：注意：將熱變性的DNA驟然冷卻至低溫時，DNA不可能復性。但是將變性的DNA緩慢冷卻時，可以復性。復性的應用：核酸的雜交，分子擴增）第二章

基因工程操作的基本技術DNA凝膠電泳中核酸分子分離的機理。在堿性環(huán)境下，核酸分子帶負電荷，在外加電場的作用下，分子在凝膠多孔性剛性濾孔中從負極向正極泳動，其中主要由于分子篩效應和電荷效應達到分離不同大小核酸分子的目的。DNA凝膠電泳中影響電泳遷移率的因素主要有哪些？1）分子本身的影響?分子的大?。盒t快?帶電荷數(shù)：多則快?分子構型：超螺旋>解螺旋2）電場：直流電場?電壓高則快?電壓太高則結果不準確常用3~5V/CM3）支持物介質?種類：瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠?凝膠濃度:濃度大，篩孔小，適合小分子電泳；濃度小，篩孔大，適合大分子電泳4）電泳緩沖液üpH值：偏堿性，帶負電荷ü離子濃度：離子濃度高_電流大_發(fā)熱快_膠溶解ü種類：TAE、TBE、TPE、TNE確定文庫大小的方法：以在構建的基因組文庫中任一基因存在的概率來衡量文庫的質量或完備性，它與基因文庫最低所含克隆數(shù)N（即文庫大?。┲g的關系可用下式表示：N=ln(1–P)/ln(1–f)其中：N：文庫所需的總克隆數(shù)；P：任一基因被克?。ɑ虼嬖谟诨蛭膸熘校┑母怕剩籪：克隆片段的平均大小/生物基因組的大小?；蛭膸斓念愋桶膬煞N？各有什么特點？一般質粒DNA的構型有哪幾種？在瓊脂糖凝膠電泳中的有何特點？超螺旋質粒DNA、開環(huán)質粒DNA、線狀質粒DNA在瓊脂糖凝膠電泳的特點是：電泳的泳動速度由大到小分別是：超螺旋質粒DNA>線狀質粒DNA>開環(huán)質粒DNA堿裂解法提取質粒DNA的原理，分析影響試驗結果的各種可能因素。堿裂解法原理：在堿性條件下，雙連DNA氫鍵斷裂，結構破壞變性，環(huán)狀超螺旋質粒不充分變性。在中性條件下變性質?；謴驮瓉順嬓停€性大分子細菌DNA不能復性呈不溶物而經離心除去。（各種可能因素是上一屆的，具體其實大家可以根據(jù)那天師兄說的去寫）提取失?。?）洗去雙鏈時，將質粒DNA洗去；2）破壁失敗，質粒沒析出；3）加劑問題電泳失?。?）電壓太高2）沒加染色劑3）膠穿孔4）電泳時間過長電泳緩沖液使用一定時間后出現(xiàn)DNA在凝膠中跑不動現(xiàn)象的原因，有何解決辦法？原因：電泳緩沖液的離子的富集作用；解決方法：1.更換成新配置的電泳緩沖液；2.把電泳槽中的緩沖液倒出混勻后再重新使用電泳的指示劑和染色劑有何區(qū)別，各自的作用是什么？指示劑一定要在電泳前加入，指示劑一般與蔗糖、甘油或聚蔗糖400組成載樣緩沖液；（一般為：溴酚蘭，二甲苯青）作用：①預知電泳的速率及方向；②使樣品呈現(xiàn)顏色，便于加樣；③一些高濃度蔗糖或其它物質增加DNA的密度，可以防止DNA的擴散染色劑即可以在電泳前加入樣液，又可以電泳后再對凝膠染色；（溴化已錠[EB]、硝酸銀、Goldview染料）作用：呈現(xiàn)出核酸電泳后的帶型。第三章基因克隆的酶學基礎限制性核酸內切酶的類型，基因工程常用的是哪種限制性核酸內切酶？（常用II型）什么是星活性，產生星活性的因素可能有哪些？在非最適合的條件下酶的識別特異性降低，產生非特異性帶，這種活性稱星活性。產生Star活性的因素：（書上P46-P47答案）高濃度甘油，堿性pH，存在Mn2+，低離子強度，低鹽濃度，低pH結合已做的實驗，分析影響酶切的因素。（這個答案是上屆的，僅供參考）1）DNA的純度：DNA中的雜質如蛋白質、酚、氯仿、乙醇、SDS、EDTA等都會影響酶的活性。2）DNA的甲基化程度：dam甲基化酶（修飾GATC中的A）；dcm甲基化酶（修飾CCA/TGG的C）。3）溫度：不同的限制性內切酶的最適反應溫度不同。大多數(shù)是37oC，少數(shù)要求40-65oC。4）緩沖液(Buffer)：是影響限制酶活性的重要因素。MgCl2、NaCl/KCl：提供Mg2+和離子強度；Tris-HCl：維持pH；二硫蘇糖醇（DTT）：保持酶穩(wěn)定性；牛血清白蛋白BSA等：有助于酶的穩(wěn)定；β－巰基乙醇：保持酶的穩(wěn)定性，防止酶失活限制性核酸內切酶命名規(guī)則及各字母代表的含義。（例子和圖幫助大家理解而已）命名規(guī)則：寄主菌屬名的第1個字母＋種名的前兩個字母＋菌株或菌型代號（大寫）＋空白＋發(fā)現(xiàn)序列（羅馬數(shù)字）例子：EcoRⅠ(E：屬名；co：種名；R：株；Ⅰ：發(fā)現(xiàn)次序)簡單敘述同尾酶和同裂酶的差別。同尾酶：來源不同，識別的序列不同，但能切出相同的粘性末端，連接后不能被相關的酶同時切割。同裂酶：識別序列相同，切割位點有些相同，有些不同。分完全同裂酶和不完全同裂酶（PS：完全同裂酶：識別位點和切點完全相同。不完全同裂酶：識別位點相同，但切點不同。）連接酶主要有哪些類型？有何異同點？影響連接酶連接效果的因素主要有哪些？類型：DNA連接酶和RNA連接酶異同點：相同點：都能以DNA為模板，從5'向3'進行核苷酸或脫氧核苷酸的聚合反應。不同點：DNA聚合酶識別脫氧核糖核苷酸，在DNA復制中起作用；而RNA聚合酶聚合的是核糖核苷酸，在轉錄中起作用。影響因素：（影響因素就四個，后面分析覺得煩的話大家自己看著辦啦）1）連接所用的目的片段的狀態(tài)：1效率：粘性末端>平端(100倍)；15，突出>3，突出；1平端：HaeIII>AluI>HinCII>SmaI2）連接溫度1連接效果最好在37℃，但形成的互補不穩(wěn)定;1最佳連接溫度：12-16℃，較好的連接效果，互補又較穩(wěn)定;3）反應液中的成分：1ATP：反復凍熔，ATP活性降低，ATP溶解度不高，連接緩沖液宜分裝；1單價離子：150-200mMNaCl，提高連接效果；1PEG：5%以下可以提高連接效率4）插入片段與載體的濃度比例1載體DNA與外源DNA的分子摩爾比通常為1﹕3左右，甚至1﹕10或更高。1目的或作用：增加插入片段與載體的接觸機會，減少載體自我連接的現(xiàn)象。試分析提高平端DNA連接效率的可能方法。（傳說中的網(wǎng)上答案）1、低溫下長時間的連接效率比室溫下短時間連接的好。

2、在體系中加一點切載體的酶，只要連接后原來的酶切位點消失。這樣可避免載體自連，應該可以大大提高平端連接的效率。

3、足夠多的載體和插入片段是最重要的。

4、平端的連接對于離子濃度很敏感

5、盡可能縮小連接反應的體積6、建議放在四度冰箱連接兩天效率更高比14度好基因工程中常用的DNA聚合酶主要有哪些？1）大腸桿菌DNA聚合酶2）Klenowfragment3）T7DNA聚合酶4）T4DNA聚合酶5）修飾過的T7DNA聚合酶6）逆轉錄酶7）TaqDNA聚合酶基因克隆的載體系統(tǒng)作為基因工程載體，其應具備哪些條件？!具有針對受體細胞的親緣性或親和性（可轉移性）；!具有合適的篩選標記；!具有較高的外源DNA的載裝能力；!具有多克隆位點（MCS）；!具有與特定受體細胞相適應的復制位點或整合位點。質粒的不相容性及其分子機理。●定義：任何兩種含有相似復制子結構的不同質粒，不能同時存在于一個細胞中，這種現(xiàn)象稱為質粒的不相容性。●分子機理：兩種含有相似復制子結構的不同質粒，在復制同時受到同一種拷貝數(shù)控制系統(tǒng)的干擾，致使兩種質粒的最終拷貝數(shù)不同，其中拷貝數(shù)多的質粒在以后的細胞分裂周期中更具優(yōu)勢。載體的類型主要有哪些？在基因工程操作中如何選擇載體？基因工程中常用的載體(vector)主要包括質粒(plasmid)、噬菌體(phage)和病毒(virus)三大類。這些載體均需經人工構建，除去致病基因，并賦予一些新的功能，如有利于進行篩選的標志基因、單一的限制酶切點等。質粒轉化原理，影響轉化率的因素有哪些？化學法（CaCl2法)轉化原理：是Ca2+與細菌外膜磷脂在低溫下形成液晶結構，后者經熱脈沖發(fā)生收縮作用，使細胞膜出現(xiàn)空隙，質?；駾NA重組分子便可進入細胞內（感受態(tài)細胞）。電穿孔轉化轉化原理：將待轉化的質?；駾NA重組連接液加在電穿孔轉化儀的樣品池中，兩極施加高壓電場，在強大電場的作用下，細菌細胞壁和細胞膜產生縫隙，質?；駾NA重組分子便可進入細胞內。影響轉化率的主要影響因素:1）載體本身的性質及其空間構象：超螺旋構象轉化率最高；2）插入片段的大?。翰迦肫卧酱螅D化效率越低；3）受體細胞的類型及預處理；4）轉化方法：電擊法高于化學法。5、重組體分子的選擇方法主要有哪些？并簡單闡述其原理。從總體上看，重組體分子的選擇與鑒定方法基本上可以分為如下幾個類型：（1）基于載體遺傳標記檢測法在構建基因工程載體系統(tǒng)時，載體DNA分子上通常攜帶了一定的選擇性遺傳標記基因，轉化或轉染宿主細胞后可以使后者呈現(xiàn)出特殊的表型或遺傳學特性，據(jù)此可進行轉化子或重組子的初步篩選。（2）基于克隆DNA序列檢測法Southern印跡雜交：根據(jù)毛細管作用的原理，使在電泳凝膠中分離的DNA片段轉移并結合在適當?shù)臑V膜上，然后通過與已標記的單鏈DNA探針的雜交作用以檢測這些被轉移的DNA片段。（3）基于外源基因產物檢測法如果目的基因產物能降解某些藥物使菌株呈現(xiàn)出抗性標記，或者基因產物與某些藥物作用是顯顏色反應，則可根據(jù)抗性或顏色直接篩選含目的基因的克隆子。6、用已學過的重組體分子的選擇與鑒定技術，試設計一個試驗方案，假如一特異PCR擴出的基因或基因片斷重組進T載體并轉化大腸桿菌，如何鑒定并獲得真實轉化子？(自理)第五章基因的克隆一般方法1、基因的克隆方法主要有哪些？并闡述其克隆原理（至少3種，都是書上找的，自選哈，建議必選DDRT-PCR和SSH，原因請看下題）？1）差減雜交（SH）通過DNA復性動力學原理富集目的基因序列，并以此構建減數(shù)文庫的方式來進行目的基因分離克隆的。2）抑制性差減雜交（SSH）SSH的核心技術是抑制性PCR，它是一種將檢測子cDNA單鏈標準化步驟和消減雜交步驟結合為一體的技術。其中標準化步驟均等了檢測子中的cDNA單鏈豐度，而消減雜交步驟去除了檢測子和驅趕子之間的共同序列，使檢測子和驅趕子之間不同的序列得到擴增。3）差異顯示PCR（DDRT-PCR）利用真核生物mRNA結尾處有POLY（A）結構，在其3`端設計象5`-T11GA樣引物，該引物可與mRNA總數(shù)的十二分之一結合，從而使這部分基因得到逆轉錄，同時結合5`端的隨機引物（20條10-mer），可以使不同長度的基因得到擴增。4）DNA代表性差異分析（DNARDA）代表性差別分析是通過突變型（驅趕DNA，driverDNA）與野生型（檢測DNA，testerDNA）基因組之間的差異來分離和鑒定突變基因的方法。5）擴增限制性片段長度多樣性（AFLP）基因組DNA經過限制性內切酶消化后，產生粘性末端。使用人工合成的短的雙鏈接頭，該接頭一端具有同樣的內切酶識別粘性末端，互補連接后成為DNA模板。接頭和與接頭相鄰的酶切片斷的幾個堿基序列作為引物的結合位點。[參考文獻：關德軍.AFLP技術原理及其在植物研究中的應用.安徽農業(yè)科學，2006，34（15）：3625-3628）]6）cDNA微陣列建立一套統(tǒng)一且具有高質量、高代表性的cDNA列陣膜，在這一列陣膜上每個cDNA克隆都有固定的位置和編號，這樣大大方便了數(shù)據(jù)的綜合比較分析，并可對每個cDNA克隆子進行定量分析。在列陣雜交的基礎上，還可以進行雜交測序，從而測定每個cDNA克隆子的序列。2、簡單闡述差異顯示PCR克隆基因的原理及其優(yōu)缺點，有何應用？主要原理：利用真核生物mRNA結尾處有POLY（A）結構，在其3`端設計象5`-T11GA樣引物，該引物可與mRNA總數(shù)的十二分之一結合，從而使這部分基因得到逆轉錄，同時結合5`端的隨機引物（20條10-mer），可以使不同長度的基因得到擴增。優(yōu)點：簡便、靈敏、高效、省時，能快速顯示mRNA的組成。所需的mRNA量少。各樣本mRNA的差異可同時進行比較。擴出的cDNA可直接用于測序、文庫篩選等。缺點：假陽性條帶多，對低豐度的基因表達不容易檢測。工作量大。無法定量研究。擴出的條帶往往是3`端比較短的UTR區(qū)的一段序列，提供的信息較少。利用該技術，目前已有越來越多的差別表達基因得以分離和鑒定，在分子生物學和基因工程研究領域發(fā)揮了極大的作用。（P221）3、抑制性差減雜交的原理與應用。原理：SSH的核心技術是抑制性PCR，它是一種將檢測子cDNA單鏈標準化步驟和消減雜交步驟結合為一體的技術。其中標準化步驟均等了檢測子中的cDNA單鏈豐度，而消減雜交步驟去除了檢測子和驅趕子之間的共同序列，使檢測子和驅趕子之間不同的序列得到擴增。應用：l基因突變體的研究：如基因的表達與不表達；l基因時空表達的研究：如根、莖、葉；l不同處理條件下的基因表達差異：如施肥與不施肥、光照與不光照。4、酵母雙雜交技術、噬菌體表面展示技術的原理。A．酵母雙雜交技術原理：大部分真核生物的位點特異轉錄激活因子通常具有兩個可分隔開的結構域，一個是DNA特異結合域（DNA-bingingdomain,BD），一個是轉錄激活域(transcriptionalactivationdomain,AD)。這兩個結構域各具功能，互不影響，但一個完整的、具有激活特定基因表達的激活因子必須同時含有這兩個結構域，否則無法完成其激活功能。不同來源的激活因子的BD區(qū)與AD區(qū)結合后則能特異地激活BD結合基因的表達。B．噬菌體表面展示技術原理：當外源DNA片段插入絲狀噬菌體基因組的一個外被蛋白基因中時，如果兩者讀碼框結構保持一致，這個外源DNA片段所編碼的產物可與此外被蛋白一起以融合蛋白的形式表達，并顯示在噬菌體的表面。利用抗此外源基因編碼產物（多肽或蛋白）的抗體，通過親和純化，就能從大量的噬菌體中富集、分離出含有所要的基因的融合噬菌體。然后，通過基因擴增，得到大量所要的目的基因。5、T-DNA標簽法克隆基因的一般技術路線。農桿菌侵染植物得到轉化苗，篩選出表現(xiàn)某種突變性狀的個體。建立突變體基因組文庫及野生型基因組文庫.用T-DNA片段做probe篩選突變體文庫，獲得陽性克隆。用獲得的陽性克隆篩選野生型基因組文庫，獲得野生型的陽性克隆。把陽性克隆轉化突變體進行功能互補及進行測序分析。第七章克隆基因的表達1、通過比較，分析大腸桿菌表達系統(tǒng)和酵母表達系統(tǒng)各有何優(yōu)缺點。大腸桿菌表達外源基因的優(yōu)勢：ò全基因組測序，共有4405個開放型閱讀框架；ò基因克隆表達系統(tǒng)成熟、完善；ò繁殖迅速、培養(yǎng)簡單、操作方便、遺傳穩(wěn)定；ò被FDA批準為安全的基因工程受體生物。大腸桿菌表達外源基因的劣勢：ò缺乏對真核生物蛋白質的復性功能；ò缺乏對真核生物蛋白質的修飾加工系統(tǒng)；ò內源性蛋白酶降解空間構象不正確的異源蛋白；ò周質內含有種類繁多的內毒素。甲醇酵母表達系統(tǒng)的優(yōu)點：具有強的受嚴格調控的AOX1啟動子表達蛋白的翻譯后的加工和修飾營養(yǎng)要求低，工業(yè)化生產成本低可高密度發(fā)酵表達蛋白可存在于胞內和胞外酵母表達系統(tǒng)的缺點：酵母表達蛋白有時會出現(xiàn)蛋白切割問題（這個找不到，百度的）2、如何提高克隆基因的表達水平？1）、表達載體的優(yōu)化設計；2）、提高目標基因mRNA和目標基因產物的穩(wěn)定性；3）、密碼子偏愛性；4）、表達環(huán)境條件的優(yōu)化。3、克隆基因目的蛋白的表達的形式主要有哪些類型？表達蛋白按溶解特性通常包括：不溶性蛋白和可溶性蛋白兩類，具體包括如下幾種結構形態(tài)：包涵體型蛋白、融合型蛋白、分泌型蛋白4、啟動子從轉錄模式上可分為哪兩種？表達系統(tǒng)常選用哪一種？其機理是什么？啟動子從轉錄模式上分為：組成型啟動子和誘導型啟動子表達系統(tǒng)常選用誘導型啟動子機理：指在某些特定的物理或化學信號的刺激下，該種類型的啟動子可以大幅度地提高基因的轉錄水平。表達載體和基因工程一般克隆載體在元件構成上有何差別？表達載體：啟動子；終止子；核糖體結合位點（SD序列）；篩選標記；復制子（質?？截悢?shù)）；多克隆位點克隆載體：篩選標記；復制子（質?？截悢?shù)）；多克隆位點根據(jù)表達蛋白用途的不同，設計選擇基因的表達策略。（1）表達蛋白用于生物化學和分子生物學研究——主要考慮保持蛋白質原有的功能不變；表達策略：融合