基因工程總結(jié)

基因工程第一章緒論1、基因工程的含義：按照人們的意愿，進(jìn)行嚴(yán)密的設(shè)計(jì)，通過體外DNA重組和轉(zhuǎn)基因等技術(shù)，有目的地改造生物種性，使現(xiàn)有的物種在較短時(shí)間內(nèi)趨于完善，創(chuàng)造出更符合人們需求的新的生物類型。2、基因工程的優(yōu)點(diǎn)：①打破物種間基因交流的隔離界限；②克服常規(guī)育種的周期長，效率低的缺點(diǎn)，定向改造生物性狀；③可按照人的意愿去改造物種。3、基因工程理論依據(jù)：①不同基因具有相同的物質(zhì)基礎(chǔ)；②基因是可分割的；③基因是可以轉(zhuǎn)移的；④多肽與基因之間存在對(duì)應(yīng)關(guān)系；⑤遺傳密碼是通用的；⑥基因可以通過復(fù)制傳遞給下一代。注：基因工程及其應(yīng)用的圖解看看第二章DNA重組的相關(guān)技術(shù)及原理1、重組DNA技術(shù)的原理重組DNA技術(shù)是指將一種生物體（供體）的基因與載體在體外進(jìn)行拼接重組，然后轉(zhuǎn)入另一種生物體（受體）內(nèi)，使之按照人們的意愿穩(wěn)定遺傳并表達(dá)出新產(chǎn)物或新性狀的DNA體外操作程序2、堿性SDS法提取質(zhì)粒DNA原理：強(qiáng)堿使所有DNA變性沉淀，而pH為中性時(shí)，質(zhì)粒DNA復(fù)性快，形成閉合環(huán)狀從沉淀物中分離。3、提取DNA總的原則①保證核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性；②其他生物大分子如蛋白質(zhì)、多糖和脂類分子的污染應(yīng)降低到最低程度；③核酸樣品中不應(yīng)存在對(duì)酶有抑制作用的有機(jī)溶劑和過高濃度的金屬離子；④其他核酸分子，如RNA，也應(yīng)盡量去除。4、核酸鑒定①濃度鑒定②純度鑒定③完整性鑒定5、限制性核酸內(nèi)切酶：是一類能夠識(shí)別雙鏈DNA分子中的某種特定核苷酸序列（4-8bp），并使每條鏈的一個(gè)磷酸二酯鍵斷開的內(nèi)脫氧核糖核酸酶。6、限制性內(nèi)切酶的命名①用屬名的第一個(gè)字母和種名的頭兩個(gè)字母組成3個(gè)字母的略語表示寄主菌的物種名。大腸桿菌（Escherichiacoli）Eco流感嗜血菌（Haemophilusinfluenzae）Hin用一個(gè)右下標(biāo)的大寫字母表示菌株或型。如Ecok,EcoR（現(xiàn)在都寫成平行，如EcoR）。如果一種特殊的寄主菌內(nèi)有幾種不同的限制性內(nèi)切酶，用羅馬字母表示。如EcoRI，EcoRV。屬名種名株名HaemophilusinfluenzaeD嗜血流感桿菌D株HindIIIEcoRI—EscherichiacoliRIHindⅢ—HaemophilusinfluensaedⅢSacI(II)—StreptomycesachromagenesI(Ⅱ)7、限制性核酸內(nèi)切酶的作用機(jī)制以環(huán)狀和線形的雙鏈DNA為底物，在適合的反應(yīng)條件下，識(shí)別一定的核苷酸序列，使兩條核糖鏈上特定位置的磷酸二酯鍵斷開，產(chǎn)生具有3’－OH基團(tuán)和5’－P基團(tuán)的片段。8、同裂酶：能識(shí)別相同序列但來源不同的兩種或多種限制酶完全同裂酶：識(shí)別位點(diǎn)和切點(diǎn)完全相同。如HindⅢ和HsuI。不完全同裂酶：識(shí)別位點(diǎn)相同，但切點(diǎn)不同。如XmaI和SmaI。9、同尾酶：識(shí)別的序列不同，但能切出相同的粘性末端。如BamHI、BglⅡ、BclI、XhoⅡ等10、酶活性單位（U)：在最適反應(yīng)條件下，一個(gè)DNA分子上含有一個(gè)酶切位點(diǎn)，60min內(nèi)切割1mgλDNA所需的酶量稱為一個(gè)單位。11、星號(hào)（*）活性：如果改變反應(yīng)條件就會(huì)影響酶的識(shí)別位點(diǎn)專一性和切割效率，稱為星號(hào)（*）活性。12、基因工程的其他酶（1）DNA連接酶:DNA連接酶能催化雙鏈DNA切口處的5’-磷酸和3’-羥基生成磷酸二酯鍵。;（2）DNA聚合酶（Klenowfragment）性質(zhì)①5’?3’聚合酶活性。②3’?5’外切酶活性。（失去了5’?3’外切酶活性）用途①3’端補(bǔ)平②DNA的3’末端標(biāo)記，在3’隱蔽端加上標(biāo)記的dNTP。③cDNA第二鏈的合成④雙脫氧末端終止法測(cè)定DNA序列（3）核酸酶S1催化反應(yīng)類型:ss-DNA;ss-RNA;雙螺旋變性區(qū)13、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR:PCR技術(shù)就是在體外中通過酶促反應(yīng)有選擇地大量擴(kuò)增（包括分離）一段目的基因的技術(shù)。加入4種物質(zhì)：（1）作為模板的DNA序列；

（2）與被分離的目的基因兩條鏈各自5’端序列相互補(bǔ)的DNA引物（20個(gè)左右堿基的短DNA單鏈）；

（3）TaqDNA聚合酶；

（4）dNTP（dATP,dTTP,dGTP和dCTP）。14、PCR技術(shù)的原理（1）DNA模板變性（2）DNA模板與引物復(fù)性（3）DNA鏈的延伸15、PCR的過程第一步預(yù)變性（pre-denature）90-95oC下5分鐘，模板DNA雙鏈完全變性成單鏈。第二步變性（denature）雙鏈完全變性成單鏈第三步復(fù)性（anneal）37-60oC下1分鐘，引物優(yōu)先與模板復(fù)性。①引物的濃度高②引物的鏈短。第四步延伸（extend）72oC下1-2分鐘，TaqDNA聚合酶在引物的3‘端上加上核苷酸。第五步變性進(jìn)入循環(huán)重復(fù)94oC下1分鐘，新合成的DNA雙鏈又變性成單鏈模板。16、PCR擴(kuò)增特異性DNA片段的主要條件（1）TaqDNA聚合酶（2）引物（primer)（4）模板（template)（5）dNTPs（6）Mg2+的濃度17、PCR的特點(diǎn)（1）特異性強(qiáng)（2）敏感性高（3）快速（4）簡(jiǎn)便（5）可以擴(kuò)增mRNA18、電泳的基本原理DNA在中性或偏堿性的緩沖液中帶負(fù)電，在電泳過程中處于凝膠靠負(fù)極端的DNA通過凝膠分子篩向正極端移動(dòng)。19、電泳遷移率：與DNA分子的構(gòu)型和大小有關(guān)與DNA分子中的堿基組成和順序無關(guān)DNA分子的構(gòu)象（型）：Ⅰ型：超螺旋環(huán)狀Ⅱ型：帶切口環(huán)狀Ⅲ型：線狀相同分子量的DNA:閉合環(huán)狀卷曲超螺旋遷移最快；線性分子次之；伸展開環(huán)狀最慢20、影響連接反應(yīng)的因素（1）插入片段與載體的濃度比例（10~20倍增加插入片段與載體的接觸機(jī)會(huì)，減少載體自我連接的現(xiàn)象。）（2）反應(yīng)溫度（一般14~16℃）（3）反應(yīng)緩沖液第三章基因的克隆載體1、載體：在基因工程操作中，攜帶目的基因、實(shí)現(xiàn)目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞,并在其中得以無性繁殖或表達(dá)有意義的蛋白質(zhì)所采用的一些DNA分子。2、按功能劃分：①克隆載體(cloningvector):使目的片段能在細(xì)菌細(xì)胞中復(fù)制的載體。②表達(dá)載體（expressionvector）:使目的基因能在細(xì)菌細(xì)胞中表達(dá)為RNA或蛋白質(zhì)的載體。3、基因克隆載體的必備條件：①多克隆位點(diǎn)；②能自我復(fù)制,有一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)；③選擇性標(biāo)記；④安全。4、標(biāo)記基因的作用：①指示外源DNA分子（載體或重組分子）是否進(jìn)入宿主細(xì)胞；②指示外源DNA分子是否插入載體分子形成了重組子。這種指示也可以是選擇性的，也可以是非選擇性的，絕大多數(shù)為后者。5、質(zhì)粒：獨(dú)立于染色體以外的能自主復(fù)制的雙鏈閉合環(huán)狀DNA分子。6、重組DNA導(dǎo)入真核細(xì)胞（1）酵母細(xì)胞①利用原生質(zhì)體進(jìn)行轉(zhuǎn)化②利用Li+鹽進(jìn)行轉(zhuǎn)化（2）植物細(xì)胞①農(nóng)桿菌介導(dǎo)法②電擊法③基因槍法（3）哺乳動(dòng)物細(xì)胞①磷酸鈣沉淀法②脂質(zhì)體（lipofectin）載體法③顯微注射法③DEAE---葡聚糖轉(zhuǎn)染法7、重組體克隆的篩選和鑒定①遺傳表型直接篩選法②DNA電泳檢測(cè)法③核酸雜交檢測(cè)法④免疫化學(xué)檢測(cè)法⑤轉(zhuǎn)譯篩選法⑥真核生物常用的重組基因選擇方法⑦DNA序列測(cè)定8、根據(jù)載體的抗藥性標(biāo)記進(jìn)行篩選pBR322抗菌素標(biāo)記選擇（圖已省---打出來黑的）①四環(huán)素抗性基因②氨芐青霉素抗性基因③b-半乳糖苷酶顯色反應(yīng)選擇法9、核酸雜交檢測(cè)法①Southernhybridization原理根據(jù)毛細(xì)血管作用的原理，使在凝膠電泳中分離的DNA片段轉(zhuǎn)移并結(jié)合到適當(dāng)?shù)臑V膜上，然后通過同已標(biāo)記的單鏈DNA或RNA探針進(jìn)行雜交，以檢測(cè)被轉(zhuǎn)移DNA片段，成為DNA印跡雜交技術(shù)。也稱Southern雜交②Northernhybridization原理指根據(jù)毛細(xì)管作用的原理，使在凝膠電泳中已分離的RNA轉(zhuǎn)移并結(jié)合到適當(dāng)?shù)臑V膜上，然后通過同已標(biāo)記的單鏈DNA或RNA探針進(jìn)行雜交，以檢測(cè)被轉(zhuǎn)移RNA片段，稱為RNA印跡雜交技術(shù)，也稱為Northern雜交（Northernblot）③Dotblothybridization原理在雜交的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的用于快速檢測(cè)特異核酸分子的雜交技術(shù)。將核酸樣品直接轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)臑V膜上，然后進(jìn)行雜交檢測(cè)。④Colonyandplaquehybridization原理將菌落或噬菌斑直接轉(zhuǎn)移到濾膜上，使溶菌班變性的DNA同濾膜原位結(jié)合，然后進(jìn)行雜交測(cè)驗(yàn)。雜交后根據(jù)雜交信號(hào)及其相對(duì)應(yīng)的菌落或噬菌斑的位置，便可從大量菌落或噬菌斑中篩選出含有目標(biāo)基因序列（與探針同源）的菌落或噬菌斑。所以，有時(shí)也稱菌落（噬菌斑）原位雜交。11、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）原理：一抗（primaryantibody）:與目標(biāo)分子的特異結(jié)合。二抗（secondaryantibody）：與一抗的特異性結(jié)合。酶聯(lián)（enzyme-link）：二抗上攜帶一種酶能催化一種反應(yīng)將無色的底物轉(zhuǎn)變?yōu)橛猩奈镔|(zhì)（或發(fā)光），再通過比色測(cè)定有色物質(zhì)的含量（或光強(qiáng)度），從而推測(cè)目標(biāo)分子的含量。12、一般克隆與篩選策略13、HAT法原理選擇培養(yǎng)基中有次黃嘌呤、氨基喋啉和胸苷,培養(yǎng)基中的氨基喋啉阻斷細(xì)胞核苷酸的全程合成，但啟動(dòng)以次黃嘌呤為底物進(jìn)行核苷酸的補(bǔ)救合成途徑，不受氨基喋啉的抑制，另外培養(yǎng)基中的胸苷可通過胸苷激酶的作用合成核苷酸，tk+能合成核苷酸，而tk－不能合成而死亡。14、二氫葉酸還原酶基因（DHFR）（看圖背原理）（1）選擇原理①二氫葉酸還原酶的必要性：真核細(xì)胞核苷酸的合成需要四氫葉酸提供甲基。二氫葉酸還原酶合成四氫葉酸DHFR+細(xì)胞能產(chǎn)生二氫葉酸還原酶，所以能合成四氫葉酸。能在無胸腺嘧啶和次黃嘌呤的培養(yǎng)基中生存，不需要補(bǔ)救！DHFR-細(xì)胞不能產(chǎn)生二氫葉酸還原酶，所以不能合成四氫葉酸。不能在無胸苷和次黃嘌呤的培養(yǎng)基中生存。當(dāng)加入胸苷和次黃嘌呤，DHFR-細(xì)胞可通過補(bǔ)救合成途徑維持生長。需要補(bǔ)救?、谛剀蘸痛吸S嘌呤補(bǔ)救無四氫葉酸提供甲基，dNTP合成受阻時(shí)，胸苷和次黃嘌呤分別補(bǔ)救:（2）選擇過程①宿主細(xì)胞DHFR-細(xì)胞株（不能在無核苷酸的培養(yǎng)基中生長）。需要胸苷和次黃嘌呤補(bǔ)救?、跓o核苷酸的培養(yǎng)基透析除去血清中的內(nèi)源性核苷酸，以免補(bǔ)救。③氨甲喋啉“加壓”添加少量氨甲喋啉抑制內(nèi)源性DHFR的補(bǔ)救作用，可提高選擇。④載體標(biāo)記DHFR+基因。只有轉(zhuǎn)入DHFR+基因的細(xì)胞才能生存。15、報(bào)告基因：是一種編碼可被檢測(cè)的蛋白質(zhì)或酶的基因，也就是說，是一個(gè)其表達(dá)產(chǎn)物非常容易被鑒定的基因。16、幾種常用的報(bào)告基因（1）大腸桿菌的β-D-葡萄糖醛酸糖苷酶（β-D-glucuronidase，GUS）；（2）細(xì)菌和螢火蟲的熒光素酶（luciferase，luc）；（3）水母綠色熒光蛋白（GFP）基因（GreenFluorescentProtein）。17、DNA序列測(cè)定的方法（1）化學(xué)降解法測(cè)序原理：一個(gè)末端標(biāo)記的DNA片段在4組互相獨(dú)立的化學(xué)反應(yīng)中分別得到部分降解，其中每一組反應(yīng)特異的針對(duì)某一種或某一類堿基。造成堿基的特異性切割，由此產(chǎn)生的一系列具有不同長度的DNA寡聚核苷酸鏈，經(jīng)凝膠電泳分離和檢測(cè)，讀出核苷酸序列。（2）雙脫氧鏈終止法測(cè)序原理：（1）DNA聚合酶在模板指導(dǎo)下，聚合酶不斷將dNTP加到引物的3’-OH末端，能利用單鏈的DNA作為模板合成出準(zhǔn)確的DNA互補(bǔ)鏈；（2）如果加入雙脫氧三磷酸核苷(ddNTP）,由于雙脫氧核糖的3’位置上缺少一個(gè)羥基，故不能同后續(xù)的dNTP形成磷酸二酯鍵，從而終止DNA鏈的延長。即形成一種全部具有相同5’-引物端和以ddNMP殘基為3’端結(jié)尾的一系列長短不一片段的混合物。聚丙烯酰胺凝膠電泳區(qū)分長度差一個(gè)核苷酸的單鏈DNA，從而讀取DNA的核苷酸序列。18、雙脫氧終止法測(cè)序反應(yīng)體系包括：①DNA聚合酶②單鏈DNA模板③引物，通常由20-23個(gè)堿基構(gòu)成，G+C=12，A+T=8到11，Tm=60-68℃，避免形成引物二聚體或形成發(fā)卡樣結(jié)構(gòu)Mg2+④4種dNTP(dATP,dGTP,dCTP和dTTP)⑤4種ddNTP(ddATP,ddGTP,ddCTP和ddTTP)第六章外源基因的表達(dá)1、外源基因的表達(dá)系統(tǒng)：基因工程的主要目的之一，就是要制備大量有用的蛋白質(zhì)和多肽，尤其是人體蛋白。得到了克隆的基因或cDNA后，按照正確的方向插入表達(dá)載體，連在啟動(dòng)子的后面，導(dǎo)入相應(yīng)的宿主細(xì)胞，即可進(jìn)行表達(dá)。在不同的表達(dá)系統(tǒng)中，其表達(dá)方式不盡相同。2、外源基因的有效表達(dá)關(guān)鍵：起始轉(zhuǎn)錄。3、mRNA的延伸與穩(wěn)定性：外源基因的有效表達(dá)的關(guān)鍵：保持mRNA的有效延伸、終止及穩(wěn)定存在。構(gòu)建載體需考慮因素：①避免非特異性終止，加入抗終止序列；②加入正常轉(zhuǎn)錄終止序列，減少DNA反向轉(zhuǎn)錄為反義mRNA的機(jī)會(huì)；③選擇受體菌Rnase缺失（原核）；④加入poly(A)的信號(hào)序列AAUAAA有利于mRNA的正確加工（真核）。4、表達(dá)蛋白在細(xì)胞中的穩(wěn)定性幾個(gè)方面考慮：①融合蛋白，外源蛋白與受體蛋白有良好的雜合構(gòu)像；②分泌蛋白，外源蛋白能分泌到細(xì)胞周質(zhì)腔或直接分泌到培養(yǎng)基；③包涵體，外源蛋白以包涵體的形式存在與于受體細(xì)胞；④選擇蛋白水解酶基因缺陷型的受體系統(tǒng)5、融合蛋白的優(yōu)點(diǎn)：①融合蛋白較穩(wěn)定，不易被細(xì)菌蛋白酶水解。②可利用針對(duì)原核部分的單抗進(jìn)行親和層析，便于純化。③原核蛋白部分可用蛋白酶切掉，釋放出天然的真核蛋白質(zhì)。④目的蛋白溶解性好，融合蛋白往往能在胞內(nèi)形成良好的空間構(gòu)象，且大多具有水溶性。6、分泌蛋白的優(yōu)點(diǎn)：①目的蛋白穩(wěn)定性高；②目的蛋白易于分離；③目的蛋白末端完整。7、包涵體形式的優(yōu)點(diǎn)：①能簡(jiǎn)化外源基因表達(dá)產(chǎn)物的分離操作；②能在一定程度上保持表達(dá)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定8、啟動(dòng)子：能與RNA聚合酶結(jié)合并能起始mRNA合成的DNA序列。9、啟動(dòng)子的分離：①隨機(jī)克隆法；②聚合酶保護(hù)法；③過濾膜結(jié)合法；④PCR擴(kuò)增法10、隨機(jī)克隆法：①選用適當(dāng)?shù)暮怂醿?nèi)切酶消化切割的染色體DNA分子；②接著將切割產(chǎn)生的DNA限制片段與一種無啟動(dòng)子的質(zhì)粒載體重組，使克隆的片段恰好插入在緊鄰報(bào)告基因（galK）的上游位置；③隨后把此重組混合物轉(zhuǎn)化給大腸桿菌寄主細(xì)胞，構(gòu)成質(zhì)粒載體基因文庫，并檢測(cè)報(bào)告基因的表達(dá)活性。11、增強(qiáng)子：遠(yuǎn)離轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)數(shù)千個(gè)堿基的能增強(qiáng)啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的DNA順式作用元件，對(duì)轉(zhuǎn)錄有增強(qiáng)作用，約為100～200bp,有單拷貝或多拷貝。特征：①雙向性；②重復(fù)序列；③無位置特定性；④特異性（組織）；⑤功能不受基因來源影響12、終止子：轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)后，RNA酶沿DNA鏈移動(dòng)，持續(xù)合成RNA鏈，直到遇到轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)。13、原核表達(dá)系統(tǒng)的注意事項(xiàng)：①外源基因不能帶有內(nèi)含子。②必須用cDNA，不能直接用真核基因組DNA。③必須利用原核細(xì)