(12.7.2.14)-電泳司法鑒定的奧秘

瓊脂糖|聚丙烯酰胺|凝膠電泳|PCR產物分析凝膠電泳分瓊脂糖電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳兩種.一、瓊脂糖凝膠電泳:瓊脂糖凝膠電泳是一種非常簡便、快速、最常用的分離純化和鑒定核酸的方法.瓊脂糖是從海藻中提取的一種線狀高聚物.根據(jù)瓊脂糖的溶解溫度，把瓊脂糖分為一般瓊脂糖和低熔點瓊脂糖.低熔點瓊脂糖熔點為62～65℃，溶解后在37℃下維持液體狀態(tài)約數(shù)小時，主要用于DNA片段的回收，質粒與外源性DNA的快速連接等.(一)凝膠濃度凝膠濃度的選擇依DNA分子的大小而定.瓊脂糖凝膠的濃度與DNA分離范圍瓊脂糖濃度(%)線型DNA分子的分離范圍(Kb)0.35～600.61～200.70.8～100.90.5～71.20.9～61.50.2～312.00.1～2(二)電泳緩沖液核酸電泳緩沖液有三種，即Tris-硼酸(TbE)、Tris-乙酸(TAE)和Tris-磷酸(TpE).TbE與TpE緩沖容量高，DNA分離效果好，但TpE在DNA片段回收時含磷酸鹽濃度高，容易使DNA沉淀.TAE緩沖容量低，但價格較便宜，因而推薦選用TbE.緩沖液中的EDTA可螯合二價陽離子，從而抑制DNA酶的活性，防止pCR擴增產物降解.10XTbE緩沖液的配制Tris鹼，108克EDTA，9.3克硼酸，55克H2O至，1000ul(其pH應為8.0～8.2)臨用時用水稀至0.5XTbE(20倍稀釋.(三)核酸電泳的指示劑與染色劑1.指示劑:核酸電泳常用的指示劑有溴酚蘭和二甲苯青及銀染色.溴酚蘭在堿性液體中呈紫蘭色，在0.6%、1%、1.4%和2%瓊脂糖凝膠電泳中，溴酚蘭的遷移率分別與1Kb、0.6Kb、0.2Kb和0.15Kb的雙鏈線性DNA片段大致相同.二甲苯青的水溶液呈蘭色，它在1%和1.4%瓊脂糖中電泳時，其遷移速率分別與2Kb和1.6Kb的雙鏈線性DNA大致相似.指示劑一般與蔗糖、甘油或聚蔗糖400組成載樣緩沖液.載樣緩沖液的作用有①增加樣品密度，使其比重增加，以確保DNA均勻沉入加樣孔內.②在電泳中形成肉眼可見的指示帶，可預測核酸電泳的速度和位置.③使樣品呈色，使加樣操作更方便.染色劑:核酸電泳后，需經染色后才能顯現(xiàn)出帶型，最常用的是溴化乙錠染色法，其次是銀染色.溴化乙錠(ethidiumbromide，Eb)是一種熒光染料，Eb分子可嵌入核酸雙鏈的堿基對之間，在紫外線激發(fā)下，發(fā)出紅色熒光.根據(jù)情況可在凝膠電泳液中加入終濃度為0.5ug/ml的Eb，有時亦可在電泳后，將凝膠浸入該濃度的溶液中染色10～15min.瓊脂糖凝膠Eb染色，肉眼可見核酸電泳帶，其DNA量一般>5ng，當溴化乙錠太多，凝膠染色過深，核酸電泳帶看不清時，可將凝膠放入蒸餾水浸泡30min后再觀察.銀染色:銀染色液中的銀離子(Ag+)可與核酸形成穩(wěn)定的復合物，然后用還原劑如甲醛使Ag+還原成銀顆粒，可把核酸電泳帶染色黑褐色.主要用于聚丙烯酰胺凝膠電泳染色.也用于瓊脂糖凝膠染色.其靈敏度比Eb高200倍.但銀染色后，DNA不宜回收.(四)電泳1.電泳裝置:電泳裝置主要有電泳儀，電泳槽及灌膠模具等.2.電泳方法:(1)用蒸餾水將電泳槽和梳子沖洗干凈.放在水平桌面上，并架好梳子.(2)根據(jù)核酸分子量的大小配制不同濃度的瓊脂糖凝膠，一般200～400bp的DNA片段，可配制1.2～1.7%濃度的瓊脂糖用于電泳.3.配制0.5XTbE電泳緩沖液100ml于三角燒瓶中，稱取一定量的瓊脂糖粉放入后沸水鍋或微波爐內加熱熔化.冷卻至60℃(需要時可加入溴乙錠)，倒入電泳槽中，待凝固.4.向電泳槽中倒入0.5XTbE，其量以沒過膠面2mm為宜，小心移去梳子.如樣品孔內有氣泡，應設法除去.5.在DNA樣品中加入0.2體積的載樣緩沖液，混勻后，加入樣品孔內.6.接通電源，一般紅色為正極黑色為負極，切記DNA樣品由負極往正極泳動(靠近加樣孔的一端為負).電壓為1-5V/cm(長度以兩個電極之間的距離計算).7.根據(jù)指示劑泳動的位置，判斷是否終止電泳.一般200～400bp的pCR產物50V電壓，電泳20～40min即可.(3)溴化乙錠染色后，紫外儀上觀察電泳帶及其位置，并與核酸分子量標準比較被擴增產物的大小.二、聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳適宜分離鑒定低分子量蛋白質、小于1Kb的DNA片段和DNA序列分析.其裝載的樣品量大，回收DNA純度高.長度僅相差0.2%(即500bp中的1bp)的核苷酸分子即能分離.聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺單體，在催化劑TEMED(N，N，N，N'一四甲基乙二胺)和過硫酸銨的作用下，丙烯酰胺聚合形成長鏈，聚丙烯酰胺鏈在交聯(lián)劑，N，N'一亞甲雙丙烯酰胺參與下，聚丙烯胺鏈與鏈之間交*聯(lián)接而形成凝膠.聚丙烯酰胺凝膠孔徑的大小是由丙烯酰胺的濃度決定的，不同濃度丙烯酰胺和DNA的有效分離范圍見表2.丙烯酰胺(%)有效分離范圍(bp)溴酚蘭*二甲苯青*3.5100～20001004605.080～500652608.060～4004516012.040～200307015.025～150156020.010～1001245*表中給出的數(shù)字為與指示劑遷移率相等的雙鏈DNA分子所含堿基對數(shù)目(bp).(一)材料1.電泳儀器:電泳儀，垂直電泳槽及其附件.2.30%丙烯酰胺丙烯酰胺，29克N，N'一亞甲基雙丙烯酰胺，1克H2O，加至100ml裝于棕色瓶內，4℃可保存二個月.3.10%過硫酸銨過硫酰銨，1克加水至，10ml4℃可保存一周，-20℃可保存一個月.4.1XTbE電泳緩沖液5.TEMED(四甲基乙烯基二胺)(二)聚丙烯酰胺凝膠的制備與電泳根據(jù)分離DNA片段的大小及需凝膠的容積，配制聚丙烯酰胺凝膠.1.按要求裝配好垂直電泳板，兩塊玻璃板的兩側及底部用1%的瓊脂糖封邊，防止封閉不嚴而使聚丙烯酰胺液漏出.2.將裝好的玻璃電泳板傾斜成45～60℃角.3.按表3配制所需%濃度凝膠的毫升數(shù).4.加入TEMED后，立即混勻，緩緩倒入兩玻璃板間的膠床中，直到液體接近溢出時為止.5.立即插入適當?shù)氖嶙樱芮凶⒁夥乐故猃X下產生氣泡，用一有力的夾將梳子夾在一邊的玻璃板上，然后將玻璃板斜靠在物體上，使成10°角，可減少液體泄漏的機會.6.室溫聚合一小時后，將玻璃板插入電泳槽中，上緊，倒入0.1XTbE緩沖液.7.小心取出梳子，立即用緩沖液沖洗加樣孔，因為梳子取出后，梳子上吸附的及凝膠頂部未聚合的丙烯酰胺會流入加樣孔內聚合，產生不規(guī)則的表面，將導致以后DNA電泳帶型不規(guī)則.8.將DNA樣品與適量的載樣緩沖液混勻后，加到樣品孔內，加樣時不要產生氣泡.9.接好電極，電壓為1-8V/cm，進行電泳.10.根據(jù)指示劑遷移位