蛋白質分離純化主要方法專題培訓課件

蛋白質分離純化的一般步驟層析法電泳法超離心法超濾鹽析（硫酸銨鹽析）等電點沉淀有機溶劑沉淀透析│←前處理→│←粗分級→│←細分級→│材料選擇與處理細胞破碎（機械破碎、溶漲和自溶、酶解、化學處理）生物組織→無細胞提取液→粗產品→→結晶10/25/20231鹽析法、有機溶劑沉淀法、重金屬鹽沉淀法、生物堿或酸類沉淀法、加熱變性沉淀法離子交換層析吸附層析凝膠過濾（分子篩）親和層析等電聚集層析分離純化方法沉淀法層析法電學法電泳法等電聚焦膜分離技術透析超濾離心法10/25/20232純度鑒定分子量測定層析法：凝膠過濾;高效液相色譜法(HPLC)電泳法：PAGE、梯度凝膠電泳、等電聚焦電泳等免疫化學法：專一的沉淀線SDS-PAGE電泳法：測定亞基數(shù)超速離心：成分均一其它：如,結晶法……10/25/20233定義：利用半透膜把大小分子分開的方法。操作

蛋白質溶液置半透膜袋中，置流動溶劑（如蒸餾水）中，使小分子雜質（如無機鹽、單糖、雙糖、AA、小肽等透出）蛋白質留于袋中而得到分離。一透析10/25/20234透析工作圖半透膜原理10/25/2023510/25/20236二層析技術（chromatography）p148一、層析技術一般原理二、層析技術分類及應用10/25/20237（一）、層析技術原理

層析技術是一種物理的分離方法。無論何種層析，其系統(tǒng)通常由互不相溶的兩個相組成：一是固定相（固體或吸附在固體上的液體），一是流動相（液體或氣體）。層析時，利用混合物中各組分理化性質（如吸附力、分子形狀和大小、分子極性、分子親和力、溶解度等）的差異，使各組分不同程度地分布在兩相中，隨著流動相從固定相上流過，不同組分以不同速度移動而最終被分離。樣品在層析時的移動速度可用遷移率Rf值表示：

樣品原點到斑點中心的距離

Rf=——————————————樣品原點到溶劑前沿的距離10/25/20238(二)層析相關概念1.固定相：固定相是層析的一個基質。它可以是固體物質（如吸附劑，凝膠，離子交換劑等），也可以是液體物質（如固定在硅膠或纖維素上的溶液），這些基質能與待分離的化合物進行可逆的吸附，溶解，交換等作用。它對層析的效果起著關鍵的作用。10/25/202392.流動相：在層析過程中，推動固定相上待分離的物質朝著一個方向移動的液體、氣體或超臨界體等，都稱為流動相。柱層析中一般稱為洗脫劑，薄層層析時稱為展層劑。它也是層析分離中的重要影響因素之一。10/25/202310（三）、層析法分類（按分離原理分類）分配層析吸附層析凝膠過濾（分子篩層析）離子交換層析親和層析

聚焦層析10/25/202311層析法分類（按裝置分類）

紙層析薄膜層析

柱層析10/25/202312填充物分部收集玻璃柱洗脫液樣品10/25/202313各類層析的原理和載體類別分離原理基質或載體吸附層析

化學、物理吸附硅膠、氧化鋁、羥基磷酸分配層析兩溶劑相中的溶解效應纖維素、硅藻土、硅膠凝膠層析分子篩效應的排阻效應sepharose、sephadex離子交換層析離子基團的交換反應離子交換樹脂、纖維素、葡聚糖親和層析分離物與配體之間有帶配基的sepharose特殊親和力或sephadex聚焦層析等電點和離子交換作用多緩沖交換劑（與帶有多種電荷基團的配體相偶聯(lián)的sepharose6B）10/25/202314

原理：以吸附劑作為固定相，選擇適當?shù)娜軇┳髁鲃酉?。由于各種物質的極性不同，被吸附劑吸附的程度和在流動相中的溶解度不同。層析時，當流動相從固定相上流過時，各組分也就不同程度地被溶解（解吸），然后又再被吸附、再溶解再吸附，從而以不同速度隨流動相向前移動。吸附層析（absorptionchromatography）10/25/20231510/25/202316原理：

分配層析是利用混合物(樣品)在二種或二種以上的不同溶劑中的分配系數(shù)不同而使物質分離的方法分配層析實際上是一種連續(xù)抽提方式。如紙層析中濾紙的結合水為固定相，以水飽和的有機溶劑為流動相（展開劑）。分配層析(p148)10/25/202317物質在紙上移動的速度可以用Rf表示：色斑中心至原點中心的距離Rf=──────────────溶劑前緣至原點中心的距離載體：纖維素硅藻土硅膠應用：各種生化物質的分離鑒定10/25/202318凝膠層析（gelfiltration）又稱為凝膠排阻層析（gelexclusionchromatography）、分子篩層析（molecularsievechromatography）、凝膠過濾（gelfiltration）、凝膠滲透層析（gelpermeationchromatography）等。10/25/202319原理p303凝膠層析是依據(jù)分子大小這一物理性質進行分離純化的。凝膠層析的固定相是惰性的珠狀凝膠顆粒，凝膠顆粒的內部具有立體網狀結構，形成很多孔穴。當含有不同分子大小的組分的樣品進入凝膠層析柱后，各個組分就向固定相的孔穴內擴散，組分的擴散程度取決于孔穴的大小和組分分子大小。10/25/202320載體

葡聚糖凝膠（sephadex）

瓊脂糖凝膠（sepharose）應用:

測定分子量脫鹽和濃縮分離提純生物大分子除去熱原物質10/25/202321離子交換層析（ion-changechromatography）原理離子交換層析是依據(jù)各種離子或離子化合物與離子交換劑的結合力不同而進行分離純化的。離子交換層析的固定相是離子交換劑，它是由一類不溶于水的惰性高分子聚合物基質通過一定的化學反應共價結合上某種電荷基團形成的。10/25/202322分類：根據(jù)交換劑上吸附的離子交換基團不同，陽離子交換劑;陰離子交換劑；按其解離度的大小，分為強、中強、弱三種：

10/25/202323磷酸基團（PO3H2）和亞磷酸基團（PO2H）

結合磺酸基團（SO3H）弱酸型

強酸型中等酸型結合酚羥基（OH）或羧基（COOH）

弱堿型

強堿型中等堿型季胺基團（N(CH3)3），

叔胺（N(CH3)2）、仲胺（NHCH3）、伯胺（-NH2）

二乙基氨基乙基（DEAE）

離子交換層析分類陰離子交換劑陽離子交換劑10/25/20232410/25/202325交換過程2.吸附階段：樣品與反離子進行交換3、4.解吸附階段：用梯度緩沖溶液洗脫，先洗下弱吸附物質，后洗下強吸附物質5.再生階段：用原始平衡液進行充分洗滌，既可重復使用12345原始緩沖溶液的反離子樣品溶液梯度濃度1.平衡階段:離子交換劑與反離子結合10/25/20232610/25/202327應用

制備、純化生物物質定量、定性測定混合物中各組分10/25/202328原理欲分離的大分產物質S和相對應的專一物質L(配體)以次級鍵結合，能生成一種可解離的絡合物L—S。其中的L又能與活化的基質M以共價鍵首先結合，而形成M—L—S復合物。根據(jù)L—S之間能可逆地結合與解離的原理發(fā)展起來的層橋方法稱為親和層析法。親和層析（affiuitychromatography）

10/25/202329+待純化分子配體a.待純化分子和配體間具有親和性+基質b.活性基質與配體結合產生親和吸附劑++雜質c.待純化分子與親和吸附劑結合，與雜質分離+d.偶聯(lián)復合物經解離后，得到純的待純化分子配體L基質M待分離物質SL-S復合物10/25/20233010/25/202331應用分離純化酶、抗原、抗體分離純化核酸研究酶的結構與功能基質纖維素、聚丙烯酰胺凝膠、sepharose、sephadex10/25/202332聚焦層析（Chromatofocusing）

該法是在等電點聚焦方法基礎上發(fā)展起來的，其分離純化蛋白質的依據(jù)是等電點的差異和離子交換行為。蛋白質按其等電點在pH梯度環(huán)境中進行排列的過程叫做聚焦效應。原理10/25/202333pH梯度的形成(由多緩沖劑和多緩沖交換劑形成)是聚焦效應的先決條件，如果一種蛋白質加到已形成pH梯度的層析柱上時，由于洗脫液的連續(xù)流動，蛋白質將迅速地遷移到與它等電點相同的pH處。從此位置開始，該蛋白質將以緩慢的速度進行吸附、解吸附，直到在等電點pH時被洗出。在聚焦層析過程中，一種樣品分次加入時，只要先加入者尚未洗出，并且有一定的時間進行聚焦，剩余樣品還可以加到柱上，其聚焦過程都能順利完成。10/25/2023341、pH梯度的形成2、蛋白質行為3、聚焦效應10/25/202335層析時的聚焦效應示意圖pH梯度溶液的形成示意圖蛋白質1（pI=7）蛋白質2（pI=8）流速移動速率10/25/202336幾種主要層析方法比較10/25/202337二、電泳技術

電泳的一般原理電泳技術的分類電泳的影響因素常用電泳技術10/25/202338電泳的一般原理

電泳是帶電顆粒在電場作用下向著與其電荷相反的電極移動的現(xiàn)象。許多生物分子都帶有電荷，其電荷的多少取決于分子組成、性質及其所在介質的pH。如果混合物中各組分的結構組成不同，在某一pH溶液中，各組分所帶電荷性質、電荷數(shù)量不同，加之其分子量不同，在同一電場的作用下，各組分泳動的方向和速度也各異，而達到分離鑒定各組分的目的。10/25/202339電泳分類（一）按原理分四種1.區(qū)帶電泳：是當前應用最為廣泛的電泳技術。

2.自由界面電泳：這是瑞典Uppsala大學的著名科學家Tiselius最早建立的電泳技術，是在Ｕ形管中進行電泳，無支持介質，因而分離效果差，現(xiàn)已被其他電泳技術所取代。

3.等速電泳：需使用專用電泳儀，當電泳達到平衡后，各電泳區(qū)帶相隨，分成清晰的界面，并以等速向前運動。

4.等電聚焦電泳：由兩性電解質在電場中自動形成pH梯度，當被分離的生物大分子移動到各自等電點的pH處聚集成很窄的區(qū)帶。10/25/202340（二）按支持介質的不同可分為：

1.紙電泳

2.醋酸纖維薄膜電泳3.瓊脂凝膠電泳4.聚丙烯酰胺凝膠電泳

5.SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS－PAGE）。10/25/202341（三）按支持介質形狀不同1.薄層電泳；

2.板電泳；

3.柱電泳。（四）按用途不同可分為：

1.分析電泳；2.制備電泳；

3.定量免疫電泳；10/25/202342（五）按所用電壓不同可分為：

1.低壓電泳：100V～500V，電泳時間較長，適于分離蛋白質等生物大分子。

2.高壓電泳：1000V～5000V，電泳時間短，有時只需幾分鐘，多用于氨基酸、多肽、核苷酸和糖類等小分子物質的分離。（六）按pH的連續(xù)性不同可分為：1.連續(xù)pH電泳：如紙電泳、醋酸纖維素薄膜電泳；2.非連續(xù)pH電泳：如聚丙烯酰胺凝膠盤狀電泳；10/25/202343電泳技術分類（按實驗裝置分類）

紙電泳

薄膜電泳

凝膠電泳

毛細管電泳10/25/202344毛細管電泳10/25/202345三、影響電泳的因素（一）帶電顆粒的物理性狀（二）支持物介質：（三）緩沖溶液(pH離子強度)（四）電場強度：（五）電滲現(xiàn)象：（六）焦耳熱對電泳的影響10/25/202346四、常用電泳技術1、醋酸纖維薄膜電泳2、聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamidegelelectrophoresis,PAGE）3、SDS4、PAGE等電點聚焦3、瓊脂糖電泳4、毛細管電泳10/25/202347聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）

凝膠聚合反應及催化系統(tǒng)

不連續(xù)PAGE

可產生的三種效應：電荷效應、分子篩效應、濃縮效應10/25/202348聚丙烯酰胺凝膠電泳（PolyacrylamidegelelectrophoresisPAGE），是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質。聚丙烯酰胺凝膠是由單體的丙烯酰胺（CH2=CHCONH2Acrylamide）和甲叉雙丙烯酰胺（CH2(NHCOHC=CH2)2N,N’-methylenebisacrylamide）聚合而成，這一聚合過程需要有自由基催化完成。10/25/202349光聚合催化劑是核黃素，核黃素在光照下能夠產生自由基，催化聚合反應。聚合方式化學聚合通常是加入催化劑過硫酸銨（AP）以及加速劑四甲基乙二胺（TEMED），四甲基乙二胺催化過硫酸銨產生自由基10/25/202350不連續(xù)表現(xiàn)：緩沖液及凝膠pH不連續(xù)凝膠孔徑不連續(xù)電位梯度不連續(xù)10/25/202351⊕–電極緩沖液pH8.3

Tris-Gly

分離膠pH：8.9Tris-HCl電極緩沖液pH8.3Tris-Gly

濃縮膠pH：6.7Tris-HCl

樣品

10/25/20235210/25/20235310/25/202354SDS原理：

當SDS（SodiumDodecylSulfate）與蛋白質結合后，蛋白質分子即帶有大量的負電荷，并遠遠超過了其原來的電荷，從而使天然蛋白質分子間的電荷差別就降低乃至消除了。與此同時蛋白質在SDS的作用下結構變得松散，形狀趨向一致，所以各種SDS-蛋白質復合物在電泳時產生的泳動率差異，就反映了分子量的差異。在此條件下，樣品分子量的對數(shù)與其在凝膠中的遷移率呈直線關系。應用:測定蛋白質分子量測定蛋白質亞基數(shù)10/25/202355SDSseparatesproteinsbyMW10/25/20235610/25/202357等電點聚焦（isoelectricfocusing）

原理:在一定抗對流介質（如凝膠）中加入兩性電解質載體(Ampholyte,是一種多氨基多羧基的混合物，由異構物和同系物組成，其pK和pI值各自相異卻又相近），當直流電通過時，便形成一個由陽極到陰極pH值逐步上升的梯度。兩性化合物在此電泳過程中，就被濃集在與其等電點相等的pH區(qū)域，從而使不同化合物能按其各自等電點得到分離。應用：

高效率分離純化蛋白質測定蛋白質分子量10/25/202358等電聚焦電泳：當?shù)鞍踪|在其等電點時，凈電荷為零，在電場中不再移動。++－－－－+－－－－－5.06.07.0穩(wěn)定pH梯度5.06.07.0穩(wěn)定pH梯度通電++－－－－+－－－－－++－－－－+－－－－－++－－－－+－－－－－++－－－－+－－－－－10/25/20235910/25/202360等電聚焦電泳法測定蛋白質pI10/25/202361雙向電泳10/25/20236210/25/20236310/25/202364毛細管電泳

毛細管電泳又稱毛細管區(qū)帶電泳，它是在毛細管（

2-75μm）中裝入緩沖液，從其一端注入樣品，在毛細管兩端加高壓直流電實現(xiàn)對樣品的分離，分離后的樣品依次通過設在毛細管一端的檢測器檢出。該法克服了傳統(tǒng)區(qū)帶電泳的熱擴散和樣品擴散的問題，實現(xiàn)了快速和高效分離。

毛細管電泳是近年來發(fā)展起來的一項新技術，被認為是90年代最有影響的分離手段之一。目前已廣泛用于氨基酸分析、蛋白質高效分離、指紋圖譜研究、分離合成的寡核苷酸、DNA序列測定及PCR產物的分析鑒定等。10/25/202365毛細管電泳裝置示意圖高壓電源光源光電倍增管數(shù)據(jù)采集毛細管