泛素化蛋白檢測方法

蛋白檢測方法化蛋白檢測方法蛋白質(zhì)泛素化簡介蛋白質(zhì)泛素化修飾過程在人體免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)過程中起到了關(guān)鍵性的作用。與磷酸化修飾過程一樣，泛素化修飾過程也是一種可逆的共價(jià)修飾過程，它能夠調(diào)節(jié)被修飾蛋白的穩(wěn)定性、功能活性狀態(tài)以及細(xì)胞內(nèi)定位等情況。泛素蛋白是一個(gè)由76個(gè)氨基酸殘基組成的非常保守的多肽，它能在E1、E2、E3酶等一系列酶促反應(yīng)催化下與細(xì)胞內(nèi)靶蛋白上的一個(gè)或多個(gè)賴氨酸殘基發(fā)生共價(jià)連接。泛素蛋白本身也含有7個(gè)賴氨酸殘基，因此它們之間也可以通過這些位點(diǎn)互相連接，形成多泛素蛋白鏈(polyubiquitinchain)。目前研究顯殘基相連，則靶蛋白可以發(fā)揮信號通路功能而不會被降解。與磷酸化修飾途徑一樣，泛素化修飾途徑也是可逆的，即可以通過去泛素化酶(DUB)將泛素蛋白修飾物去除掉。靶蛋白經(jīng)泛素化途徑修飾之后，連接在靶蛋白上的泛素蛋白單體或多聚體可以被各種泛素蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域(UBD)所識E蛋白質(zhì)泛素化的檢測方法發(fā)生了泛素化的蛋白質(zhì)，具體是哪個(gè)位點(diǎn)的賴氨酸殘基發(fā)生了泛素化；進(jìn)行定明確了上述幾點(diǎn)后，進(jìn)一步需要弄清楚的是，我們感興趣的泛素化蛋白，是如何發(fā)生泛素化的，影響這一泛素化過程的關(guān)鍵分子是什么？或者說這一過然后需要研究的是，這一蛋白質(zhì)發(fā)生泛素化之后可以產(chǎn)生那些分子效應(yīng)？對下游的信號通路有什么影響？研究上述內(nèi)容的實(shí)驗(yàn)方法和實(shí)驗(yàn)流程：方法一：westernblotandstrip與特定蛋白的抗體和特定泛素化位點(diǎn)的抗體反應(yīng)，顯色拍照。通過陽性條帶的對比來初步判斷某一特定蛋白的特定位點(diǎn)發(fā)生了泛素化。【具體實(shí)驗(yàn)流程附后】方法二：westernblotandimmunoprecipitations通過免疫共沉淀方法將某一特定蛋白以及與其結(jié)合的蛋白分離出來。方法三：invitroubiquitinationassay的那個(gè)蛋白)與UBE1，UbeH13-Uev1aheterodimercomplex，方法四：invitroubiquitin-bindingassay將我們要研究的蛋白(被泛素化的蛋白)基因轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，大量表行檢測。這一方法可以明確要研究的蛋白哪個(gè)賴氨酸殘基容易發(fā)生泛，以及 了泛素化的蛋白 了泛素化的蛋白StrippiMerge如果總的泛素化蛋白的條帶，方法二：Westernblotandimmunopr