結(jié)構(gòu)生物學的新態(tài)勢

結(jié)構(gòu)生物學的新態(tài)勢

20世紀90年代，生命的一個重要發(fā)展是結(jié)構(gòu)生物學時代的到來。1993年，《英國自然》雜志首次舉辦了以結(jié)構(gòu)為主題的國際學術(shù)會議，宣布結(jié)構(gòu)生物學時代已經(jīng)開始，并已發(fā)展成為世界上一個重要的遺傳因素。自那以后，這個領(lǐng)域發(fā)展迅速。在本文中，作者對作者所知的一些情況發(fā)表了簡要評論。結(jié)構(gòu)生物學是以生命物質(zhì)的精確空間結(jié)構(gòu)及其運動為基礎(chǔ)來闡明生命活動規(guī)律和生命現(xiàn)象本質(zhì)的科學.現(xiàn)代分子生物學的發(fā)展已充分證實,生命現(xiàn)象的主要物質(zhì)基礎(chǔ)是以蛋白質(zhì)、核酸、糖、脂質(zhì)為代表的生物大分子,所以結(jié)構(gòu)生物學研究的核心內(nèi)容是生物大分子及其復合物和組裝體的三維結(jié)構(gòu)、運動和相互作用,以及他們與正常生物學功能和異常生理現(xiàn)象的關(guān)系.本文將以這一認識為基礎(chǔ),主要涉及與生物大分子相關(guān)的結(jié)構(gòu)-功能研究方面的新進展.1同晶置換法測定肌紅蛋白的三維結(jié)構(gòu)生物大分子及其復合物的完整、精確和動態(tài)三維結(jié)構(gòu),是結(jié)構(gòu)生物學研究的主要基礎(chǔ),也是其發(fā)展的重要標志.目前,可用于完整、精確、實時測定生物大分子三維結(jié)構(gòu)的主要物理方法包括:X射線晶體結(jié)構(gòu)分析,多維核磁共振(NMR)波譜解析,和電子顯微鏡二維晶體三維重構(gòu)(電子晶體學,EC).這些方法的不斷成熟與現(xiàn)代分子生物學最新成就的結(jié)合,使在原子水平測定的生物大分子的三維結(jié)構(gòu)在近年來出現(xiàn)了前所未有的新增長,使結(jié)構(gòu)生物學的發(fā)展呈現(xiàn)新的態(tài)勢.這體現(xiàn)在下述三個方面.a.精確測定的生物大分子結(jié)構(gòu)近年來以指數(shù)曲線(加速度)增加.根據(jù)國際蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(ProteinDataBank,PDB)的統(tǒng)計數(shù)據(jù),自從1959年首次用多對同晶置換法測定肌紅蛋白的三維結(jié)構(gòu)以來,在1988年以前的30年間,大約有400多個生物大分子空間結(jié)構(gòu)得到測定.其間每年測定結(jié)構(gòu)的數(shù)量幾乎保持不變,總量增加十分平緩,如圖1所示.到1988年,結(jié)構(gòu)測定速度急劇增加到129個/年,特別最近5年,以加速度的趨勢攀升,1995年至1997年測定結(jié)構(gòu)的速率已從3.3個/d增長到5.1個/d(圖1).這顯示出研究方法的成熟已達到廣泛應(yīng)用的程度.b.生物大分子精確三維結(jié)構(gòu)知識已有大量積累.圖2是以1998年4月PDB發(fā)布的數(shù)據(jù)為基礎(chǔ),已經(jīng)在原子水平測定的生物大分子三維結(jié)構(gòu)的分類統(tǒng)計.從中可以看到,目前已從PDB庫釋放出來可用的生物大分子原子坐標數(shù)已達7454,其中以蛋白質(zhì)所占比例最大(88.8%);由于固有的結(jié)構(gòu)多樣性,對糖的精確結(jié)構(gòu)了解至今仍然很少.如以研究方法分類,可以看到X射線晶體結(jié)構(gòu)分析方法測定的結(jié)構(gòu)仍占主導地位(81.9%);用統(tǒng)計時間到1998年4月,基本數(shù)據(jù)取自文獻.NMR方法測定的結(jié)構(gòu)數(shù)量也有了迅速的增長(15.7%),而且其完整結(jié)構(gòu)測定的分子質(zhì)量上限已經(jīng)突破35000;電子晶體學方法(electroncryslallography,EC)測定的高分辨率結(jié)構(gòu)仍然十分有限.這種研究對象和研究方法的格局,在可以預見的將來大概仍會基本保持.顯然,我們已經(jīng)有了豐富的原子水平的結(jié)構(gòu)知識,可以用于許多生命活動的機理研究.按此態(tài)勢發(fā)展,專家預計,到2000年,將有15000～25000原子水平的生物大分子結(jié)構(gòu)可資利用.c.“結(jié)構(gòu)研究”與“生物學研究”的結(jié)合越來越緊密,重要的結(jié)構(gòu)生物學研究課題具有越來越強的學科綜合性、協(xié)同性和邊緣性.事實上,結(jié)構(gòu)生物學的主要方法和技術(shù)基礎(chǔ)全部來自現(xiàn)代物理、化學、數(shù)學的最新發(fā)展,沒有這種多學科的交叉貢獻,就沒有結(jié)構(gòu)生物學時代的出現(xiàn).同時,沒有分子生物學和生物化學提供的廣泛的功能研究基礎(chǔ),特別是如果沒有分子生物學發(fā)展提供的DNA重組蛋白,就不可能有現(xiàn)在這樣色彩紛呈的功能結(jié)構(gòu)被測定,也不可能有一系列重要生物功能在精確結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上的闡明.這種態(tài)勢必將推動結(jié)構(gòu)生物學不斷發(fā)展進入新的深度和廣度.2膜蛋白晶體結(jié)構(gòu)模擬研究在技術(shù)和方法方面,近年來對結(jié)構(gòu)生物學影響最大的莫過于第三代同步輻射的出現(xiàn)和實際應(yīng)用.第一個將硬X射線建于第三代同步輻射上的是歐洲同步輻射裝置(ESRF),于1994年開放使用.繼之,在美國的Argonne(1996)和日本的Nishi-Harima(1997)建立和開放了能量更大的第三代同步輻射中心(表1),這被《Science》列為1997年10大科學成就之一.第三代同步輻射產(chǎn)生的X射線新光源具有的主要特點包括:極高的亮度(brightness)(比過去的同步輻射光源至少強100倍),極細銳的聚焦(可比過去細100倍),以及可靈活“裁剪”波長(提供多種波長).如在ESRF的細微聚焦線上,可在1s內(nèi)將2000億光子聚焦到只有10μm直徑的點上.這一新的技術(shù)條件與一些新的方法相結(jié)合,對于生命物質(zhì)精細結(jié)構(gòu)的研究產(chǎn)生了重大影響,使其達到前所未有的水平(表2).a.極大地降低對晶體大小的要求,從而有力地推動了如膜蛋白這類極難結(jié)晶的重要生命物質(zhì)的精細結(jié)構(gòu)研究.迄今,X射線晶體結(jié)構(gòu)分析仍然是生物大分子精細結(jié)構(gòu)測定的主要方法,但其成功運用的前提條件是必須有足夠大的優(yōu)質(zhì)單晶體.對一般光源,高分辨率結(jié)構(gòu)要求有接近mm量級的晶體;對過去的同步輻射光源,也要求晶體尺度有0.1mm左右.運用第三代同步輻射的X光源,對高分辨率結(jié)構(gòu)的最新水平的晶體大小是20～40μm,其具體實例是膜蛋白菌紫紅質(zhì)(bacteriorhodopsin,bR)的結(jié)構(gòu)解析.bR的晶體結(jié)構(gòu)研究經(jīng)歷了20年未獲結(jié)果,其主要原因是晶體或者過小或者質(zhì)量不好(disorder).直到運用ESRF的第三代同步輻射光源,僅用20～40μm×20～40μm的六方晶體,于1997年成功地解析了0.25nm分辨率的精細結(jié)構(gòu).目前,國際蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中已有近7000個蛋白質(zhì)精細三維結(jié)構(gòu),但高分辨率的膜蛋白僅有10來個(表3).這極大地限制了我們對這類重要生命物質(zhì)結(jié)構(gòu)-功能的了解.造成這種狀況的重要原因來自膜蛋白固有的兩親性特性,因而極難在水溶性體系中結(jié)晶.最近,Landau和Rosenbusch超脫純水溶體系,提出運用模擬的脂立方相(lipidiccubicphase)來生長膜蛋白的三維晶體,被認為是膜蛋白結(jié)晶的新觀念新途徑.這一模擬的膜系統(tǒng)包含適當比例的脂、水和蛋白質(zhì),形成一個結(jié)構(gòu)化的、透明的三維脂排列,它被可相互溝通的水通道系統(tǒng)所充滿.由于這種組織方式更加適應(yīng)于膜蛋白的兩親特性,有望從中獲得更多更好的膜蛋白單晶體.這種結(jié)晶方法的改善和晶體工程(crystalengineering)的應(yīng)用與新一代同步輻射光源的結(jié)合,很有可能打開膜蛋白精細結(jié)構(gòu)測定的閘門.b.以前所未有的技術(shù)優(yōu)越性提供了測定極大而復雜的蛋白質(zhì)、DNA、RNA及其復合物,特別是一些細胞器、亞細胞器精細結(jié)構(gòu)的可能性.用通常的X光源,可以測定原子水平結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)分子的尺寸大體局限于直徑7.5nm左右;對于病毒這樣大的分子組裝體,其晶胞大體在100nm左右,測定其精細結(jié)構(gòu)就十分困難.問題主要在兩個方面:一是大晶胞內(nèi)所含原子數(shù)極多,經(jīng)X光照射后產(chǎn)生的衍射點也很多,在普通光源(甚至過去的同步輻射光源)上經(jīng)常會發(fā)生重疊,無法辨識和探測;另一是含大晶胞的晶體所產(chǎn)生衍射點強度過弱,特別在高分辨率,一般都不能與背景相區(qū)分.高亮度和極細聚焦的第三代同步輻射X光源使第一個問題獲得基本解決,使第二個問題獲得明顯改善.現(xiàn)在研究的病毒比Rossmman等在1985年測定的第一個動物病毒(感冒病毒,分子質(zhì)量8.5×106)大多了.目前,用第三代同步輻射光源(ESRF)測定的最大結(jié)構(gòu)是藍舌病毒(bluetonguevirus),它包含約1000個蛋白質(zhì)亞基,晶胞一邊長約110nm,高160nm.當然,隨著技術(shù)的進一步發(fā)展,還可能有更大的精細結(jié)構(gòu)得到測定.這種可精細測定結(jié)構(gòu)的尺度的急劇增加,具有重要的生物學意義.事實上,幾乎所有重要生物功能都是通過多種重要生物大分子相互作用實現(xiàn)的,因此測定這些大分子復合物,特別是它們的高級組織形式亞細胞器和細胞器的原子水平的精細結(jié)構(gòu)無疑是結(jié)構(gòu)生物學的重要目標.由于第三代同步輻射光源的應(yīng)用,近年來在這方面已有了長足的進展.1997年9月,《Nature》報道了核小體核心顆粒(nucleosomecoreparticle)的0.28nm分辨率結(jié)構(gòu),其中80%的蛋白質(zhì)原子和全部DNA原子的位置均被測定.這是一個含有8個組蛋白和一條復雜纏繞的DNA鏈(146bp)的高度復雜結(jié)構(gòu)(分子質(zhì)量206ku),由于它提供了詮釋染色質(zhì)中與DNA相關(guān)的調(diào)節(jié)過程的許多分子機理的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ),因而被認為具有里程碑意義.以此為基礎(chǔ),測定一串核小體結(jié)構(gòu)從而闡釋更有序的染色質(zhì)(chromatin)結(jié)構(gòu)的研究已在籌劃中.此外,蛋白酶體(26S,2000ku),細菌核糖體(2500ku,大亞基含30個蛋白+2RNA,小亞基含20個蛋白+1RNA)等細胞器的高分辨率精細結(jié)構(gòu)測定都在緊張地進行之中.這一方向的繼續(xù)發(fā)展,特別是結(jié)構(gòu)研究與基因組研究的有機結(jié)合,將完全打通細胞生物學與分子生物學的界限.c.同步輻射可產(chǎn)生多波長X射線,與通過重組DNA途徑定位引進重原子的分子生物學方法相結(jié)合,將大大減少重原子衍生物制備的困難,加快結(jié)構(gòu)測定的速度.目前測定生物大分子新結(jié)構(gòu)的基本方法仍然是多對同晶置換法,運用這一方法,除母體外,至少需一個引入重原子衍生物的結(jié)晶.80年代后期,Hendrickson成功地運用不同波長作用于同一金屬離子(或重原子)測定了蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu),被稱為多波長反常衍射法(multiwavelengthanomalousdiffraction,MAD).第三代同步輻射的強光源可在更大范圍調(diào)制出多波長.同時,通過基因定位誘變可在蛋白質(zhì)中引進專一結(jié)合特定金屬離子的氨基酸.此二者相結(jié)合,使MAD方法獲得越來越多的應(yīng)用,正在成為一個常用方法,從而使結(jié)構(gòu)測定的速度大大加快.d.運用高亮度強光源可以極快速度獲取衍射數(shù)據(jù),從而使研究快速運動和動力學過程成為現(xiàn)實可能.APS用極高強度的光記錄衍射可達30幅/s;ESRF稱已可在納秒(ns)的尺度,以100ps的重復速率,觀察分子事件以及與其他分子的反應(yīng)或形貌變化.因此,確已可能用類似“拍電影”的方法反映事件發(fā)生的動態(tài)過程,這是前所未有的.已有報道,運用Laue法,在ESRF上實現(xiàn)了在ns尺度觀測肌紅蛋白與CO復合物光解過程中的結(jié)構(gòu)變化.因此,已經(jīng)產(chǎn)生了“納秒時間分辨晶體學”這一嶄新的領(lǐng)域.此外,多維核磁共振波譜技術(shù)測定完整生物大分子結(jié)構(gòu)的分子質(zhì)量已突破35ku.價值700萬美元的900MHz核磁共振儀將于1998年夏季在美國PacificNorthwestNationalLaboratory安裝.為適應(yīng)后基因組時代中對結(jié)構(gòu)測定的需求,1000MHz(GHz)的新一代NMR譜儀也已在籌劃中.用電子晶體學解析膜蛋白結(jié)構(gòu)的分辨率已接近0.3nm,已可使大多數(shù)非氫原子準確定位.生命物質(zhì)精細結(jié)構(gòu)的研究極大地依賴于復雜的技術(shù)條件,長期以來科學家在這一領(lǐng)域中主要是處于“能夠研究什么就研究什么”的被動狀態(tài).由于近年來技術(shù)的長足進步,加上在原則上已可以通過重組DNA方法(基因工程)產(chǎn)生自然界中已存在的蛋白質(zhì),一個“想研究什么就可以研究什么”的新時期正向結(jié)構(gòu)生物家迎面走來.3細胞功能結(jié)構(gòu)的不斷優(yōu)化,是覆蓋細胞的限制近年來,以精確三維結(jié)構(gòu)知識為基礎(chǔ)揭示重要生命活動的規(guī)律已達到前所未有的深度和廣度.幾乎每一個重要生物大分子及其復合物高分辨率結(jié)構(gòu)的闡明都揭示了一項基本的結(jié)構(gòu)-功能相關(guān)機理,其范圍已經(jīng)涉及大多數(shù)重要的生命活動,如生長、運動、呼吸、免疫、消化、光合作用、信號傳導、遺傳信息的傳遞、表達和調(diào)控等.下面就最近一年多來筆者所見報道,列舉一些實例:a.在闡明細菌光合作用中心復合物的三維結(jié)構(gòu)之后,近來又測定了細菌集光蛋白復合物(light-harvestingcomplexLH1和LH2)的三維結(jié)構(gòu),從而較完整地揭示了細菌光合作用系統(tǒng)Ⅰ的運行機理.特別對其中光能高效傳遞的時-空關(guān)系和分子機制的了解,已為提高現(xiàn)有光能利用機構(gòu)(如光電池)顯示了新的方向和途徑.b.在首次測定抗體-抗原復合物三維結(jié)構(gòu)之后,近年先后測定了一系列白細胞抗原MHCⅠ,Ⅱ,特別是CD1d1以及多種T細胞受體及其復合物的晶體結(jié)構(gòu),使免疫反應(yīng)的體液途徑和細胞途徑的本質(zhì)規(guī)律得到越來越清晰的了解.由此推動與醫(yī)學應(yīng)用相關(guān)的“抗體工程”已經(jīng)成為一個廣泛矚目的極為活躍的領(lǐng)域.c.1997年底,由8個組蛋白亞基和146bpDNA分子組成的核小體的三維結(jié)構(gòu)在0.28nm分辨率闡明,其中80%的蛋白質(zhì)原子和全部DNA原子的空間位置都被準確測定(圖3).這是目前在原子水平測定的最大也是最復雜的蛋白質(zhì)-核酸復合物三維結(jié)構(gòu),是復雜結(jié)構(gòu)研究的一個里程碑.這一結(jié)構(gòu)的闡明為揭示細胞核功能的動態(tài)圖景,包括作為蛋白質(zhì)合成第一步的基因轉(zhuǎn)錄、DNA復制和修復,提供了精確的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ).復合物骨架全貌,包括146bpDNA和8個組蛋白分子的主鏈.左圖為沿DNA超螺旋軸觀察,右圖為垂直此軸.近似二次軸與頂部的DNA中心垂直.d.近一年多,連續(xù)有幾個高分辨率膜蛋白三維結(jié)構(gòu)測定成功,先是細胞呼吸鏈中兩個關(guān)鍵酶細胞色素c氧化酶0.28nm分辨率和細胞色素bc1復合物0.29nm晶體結(jié)構(gòu)測定,使我們對細胞呼吸中的電子傳遞機制有了新認識.這是目前測定的分子質(zhì)量最大的膜蛋白結(jié)構(gòu)(200ku/獨立單位).緊接著是菌紫紅質(zhì)0.25nm分辨率精細三維結(jié)構(gòu)的測定,以及最近報道的第一個離子通道(K+通道)蛋白0.32nm分辨結(jié)構(gòu)的闡明(圖4).e.在癌基因發(fā)現(xiàn)整20年之后,第一個癌基因蛋白Src(酪氨酸激酶cSrc)及其同源蛋白HcK的精細三維結(jié)構(gòu)也在1997年被首次測定.這是一種同時具有正常功能和在一定條件誘發(fā)下可引起細胞惡性生長(致癌)的“兩面派”分子,精確的結(jié)構(gòu)顯示了Src的“變臉”機制.在此基礎(chǔ)上開辟了運用分子開/關(guān)機理,尋求使Src分子保持關(guān)閉狀態(tài)以使其對細胞無害,進行藥物設(shè)計用于癌癥防治的新途徑.在這期間報道的與重要疾病密切相關(guān)的另一個重要結(jié)構(gòu)是一全長重組朊病毒(prion)蛋白mPrP(23～231)的NMR溶液結(jié)構(gòu),顯示其C端肽段(121～231)是螺旋,N端20～120片段是柔性無序的基本特征,為研究朊病毒的特殊致病機理——構(gòu)象轉(zhuǎn)換致病建立了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ).此外,目前最大的RNA晶體結(jié)構(gòu)(groupⅠribozymedomain),第一個一氧化氮合成酶、第一個關(guān)鍵細胞骨架蛋白(微管蛋白tubulin)的三維結(jié)構(gòu)都在近期相繼報道.相對于已經(jīng)積累的生物大分子三維結(jié)構(gòu)信息庫而言,上述這些只能算是掛一漏千的舉例,但已可顯出這方面研究已經(jīng)達到的深度和廣度.近年來,由于人類基因組計劃異乎尋常的快速進展,已經(jīng)