健康茶樹內(nèi)生真菌的分離及其分布特征

健康茶樹內(nèi)生真菌的分離及其分布特征

植物內(nèi)科醫(yī)生是指以生活史為一定階段生活在植物組織中，對植物組織無顯著的外部特征或疾病癥狀的微生物，包括細(xì)菌、細(xì)菌和放線菌。到目前為止,已研究過的植物均發(fā)現(xiàn)有內(nèi)生真菌的存在,僅按平均每種植物含有6種內(nèi)生真菌計(jì)算,其數(shù)量是十分龐大的。植物與真菌的共生現(xiàn)象在生物進(jìn)化過程中歷史悠久而又極其普遍。雖然人們很早就知道內(nèi)生真菌的存在,但直到1977年才對其重要性有所認(rèn)識。通過20多年的研究,人們發(fā)現(xiàn),作為地球上一類古老而又普遍的共生生物,植物內(nèi)生真菌不僅可以提供人類豐富的藥用性次生代謝產(chǎn)物,而且有可能從整體上參與和協(xié)調(diào)植物與環(huán)境因子(包括病原微生物)的互作過程,從而對植物的抗逆性和環(huán)境適應(yīng)性產(chǎn)生積極的影響。大量的研究結(jié)果表明,禾草內(nèi)生真菌能與寄主形成抗性互惠共生關(guān)系,其對寄主明顯的有益方面包括抗牲畜取食、抗害蟲、抗干旱、抗病菌和促進(jìn)寄主的生長。然而,木本植物中內(nèi)生菌的多樣性與分布、共生機(jī)制與生理效應(yīng)等方面缺乏系統(tǒng)研究,本文則報(bào)道茶樹(Camelliasinensis(L.)O.Kuntze)內(nèi)生真菌分離與分布特征的初步試驗(yàn)結(jié)果。1材料和方法1.1茶樹組織的表面消毒處理茶樹樣本采自福建農(nóng)林大學(xué)實(shí)驗(yàn)茶園(福州金山)和福建省安溪縣官橋鎮(zhèn)草坂村茶園。樣本采回實(shí)驗(yàn)室后在24h內(nèi)用于微生物的分離。樣本先用自來水沖洗干凈,自然晾干備用。茶樹組織的表面消毒處理采用以下方法:70%酒精中浸泡60s;后用3.5%次氯酸鈉(有效氯)溶液處理3～6min(芽處理3min,幼嫩葉片和花處理4min,其它組織處理6min);其后再用70%酒精浸泡30s,經(jīng)表面消毒處理的組織塊用無菌水清洗3次,每次5min;清洗后的茶樹組織在無菌濾紙上,于超靜工作臺(tái)上適當(dāng)晾干后移入培養(yǎng)基中培養(yǎng),每直徑為9cm的培養(yǎng)皿放入6～8個(gè)組織塊。1.2有利于慢食性真菌的生長本研究的真菌分離工作全部采用PDA培養(yǎng)基和LCA培養(yǎng)基。LCA培養(yǎng)基因?yàn)檩^低的葡萄糖含量,可以抑制一些真菌的過度生長,因而有利于慢生性真菌的生長。LCA培養(yǎng)基的配方為:葡萄糖0.1%、KH2PO40.1%、MgSO4.7H200.02%、KCl0.02%、NaNO40.2%、酵母浸膏0.02%、瓊脂1.3%。細(xì)菌分離采用牛肉蛋白胨培養(yǎng)基。1.3方法1.3.1茶樹內(nèi)生真菌分離分別采集茶樹的芽、葉、莖、根、花、花托、種子、種托和種皮,經(jīng)表面消毒后,用無菌解剖刀將葉片和花分別切成約5mm×5mm大小的組織塊;芽、莖、根分別切成約5mm長度的組織塊;每個(gè)花托和種托切成兩半;將以上茶樹組織塊經(jīng)表面消毒后分別放置于培養(yǎng)基上,25～27℃恒溫培養(yǎng)。在7～15d的培養(yǎng)過程中,逐日觀察自茶樹組織塊上長出的內(nèi)生真菌,及時(shí)移菌保存,統(tǒng)計(jì)分離結(jié)果。分離率計(jì)算為長出內(nèi)生真菌的組織塊數(shù)占組織塊總數(shù)的百分比。另外,從安溪茶園中,按五點(diǎn)取樣,從每一取樣點(diǎn)隨機(jī)取成熟葉片10片,共50片葉片,按圖1所示從每一葉片中用無菌解剖刀分別切取8個(gè)約5mm×5mm大小的組織塊,經(jīng)表面消毒后,每一葉片所取組織塊放入同一培養(yǎng)皿中恒溫培養(yǎng)。經(jīng)7～15d培養(yǎng)后,統(tǒng)計(jì)每一葉片中分離所得的內(nèi)生真菌。1.3.2葉片組織分離從安溪茶園中,按5點(diǎn)取樣,從每一取樣點(diǎn)隨機(jī)取葉芽、幼葉(未完全展開)、成熟葉(已展開)、老葉各5片,每處理各25個(gè)葉片,從每一葉片中隨機(jī)切取4個(gè)約5mm×5mm大小的組織塊,葉芽則視大小不同,分別切成約5mm長度的組織塊,經(jīng)表面消毒后,放入培養(yǎng)基中恒溫培養(yǎng),統(tǒng)計(jì)分離結(jié)果。1.3.3葉生物分離和回收率的測定,步驟確定從福建安溪茶園中,按5點(diǎn)取樣,從每一取樣點(diǎn)隨機(jī)取成熟葉片10片,共50片葉片;葉片從中脈一分為二,一半用于內(nèi)生真菌的分離,另—一半按以下處理用于葉面微生物的分離。從每一葉片中隨機(jī)切取大小約5mm×5mm大小的組織塊4個(gè),混合均勻后,從中稱取茶葉組織塊10g,放入裝有無菌水90ml的三角瓶中,在搖床上充分振蕩60min后,按稀釋分離的方法從10-1、10-2、10-3、10-4等稀釋度各取0.1ml涂布平板,每處理3個(gè)重復(fù)。經(jīng)培養(yǎng)4d后,以10-3稀釋度計(jì)算每克樣品含菌量。2結(jié)果與分析2.1茶樹內(nèi)生真菌的分離分離及其篩選茶樹組織的表面消毒方法會(huì)直接影響內(nèi)生真菌的分離效果,參照前人的植物組織表面消毒方法,采用70%的乙醇和3.5%次氯酸鈉(有效氯)溶液作為表面消毒劑,設(shè)計(jì)不同的處理方式和處理時(shí)間。茶樹組織經(jīng)表面消毒處理后,在PDA培養(yǎng)基平板上稍微輕壓,使組織塊表面緊貼培養(yǎng)基表面,5min后移去茶樹組織,經(jīng)25～27℃恒溫培養(yǎng)7d后,觀察培養(yǎng)結(jié)果,發(fā)現(xiàn)經(jīng)以下方法處理,沒有葉片表面微生物的生長:茶樹組織經(jīng)70%酒精中浸泡60s;再用3.5%次氯酸鈉(有效氯)溶液處理3～6min(芽處理3min,幼嫩葉片和花處理4min,其它組織處理6min);其后再用70%酒精浸泡30s,經(jīng)表面消毒處理的組織塊用無菌水清洗3次,每次5min。這種表面消毒方法能有效地殺滅茶樹組織表面的附生菌。經(jīng)表面消毒的茶樹組織塊在培養(yǎng)3～4d后,逐漸可見有菌絲從組織塊的切口處長出(圖2-A)。在PDA培養(yǎng)基上,菌絲的生長明顯比LCA培養(yǎng)基上快,分離到的真菌也大多不同。自茶樹組織中,能分離到多種在PDA上菌落形態(tài)明顯不同的內(nèi)生真菌(圖2-B)。在3批次的茶樹不同組織內(nèi)生真菌分離過程中,從994個(gè)不同的茶樹組織塊中共分離到553個(gè)真菌分離物。以滅菌后的茶樹枝條和葉片接種內(nèi)生真菌,經(jīng)培養(yǎng)和誘導(dǎo),發(fā)現(xiàn)有多種不同的內(nèi)生真菌分別能在茶樹的枝條和葉片上產(chǎn)生繁殖體,其中占優(yōu)勢的內(nèi)生真菌分別屬于球座菌屬(Guignardiasp.)、擬盤多毛孢屬(Pestalotiopsissp.)、炭疽菌屬(Colletotrichumsp.)和黑曲霉(Aspergillusniger)。一些難于產(chǎn)生繁殖體的內(nèi)生真菌,則要利用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù),作深入的研究。從圖3可以看出,茶樹內(nèi)生真菌在不同的茶樹組織中的分布存在明顯的組織特異性,根據(jù)試驗(yàn)條件,在茶樹的葉、枝條和種托中可以分離到更為豐富的內(nèi)生真菌,特別是葉中,分離率為93.88%～100%;而在花瓣、種胚、根、芽和種皮中,內(nèi)生真菌的分離率則明顯下降。內(nèi)生真菌的分離過程中發(fā)現(xiàn),根和種皮組織塊放置于PDA培養(yǎng)基上后,培養(yǎng)至2～3d,則可見組織塊附近的培養(yǎng)基中呈現(xiàn)紅棕色(圖2-C、D),似有紅棕色的色素滲入培養(yǎng)基中,這些色素成份有可能影響根和種皮組織塊中內(nèi)生真菌的分布;在茶樹的葉芽中,有時(shí)可分離到一些在PDA培養(yǎng)基上菌落帶黃色的細(xì)菌,真菌則較少,培養(yǎng)基上也未見有色素產(chǎn)生;然而,在福州市龍山鎮(zhèn)2株多年無人管理的老茶樹的葉芽中分離到較豐富的內(nèi)生真菌,分離率可達(dá)72.97%。在茶樹種子中,除1批次分離到3個(gè)真菌分離物外,其余2次則均未分離到真菌,也未見有色素產(chǎn)生。2.2內(nèi)生真菌的分離利用2種培養(yǎng)基的分離結(jié)果表明,在茶樹同一葉片中,生長有不同的內(nèi)生真菌。其中能分離到3種以上(包括3種)的內(nèi)生真菌占100%,分離到4種以上的占88%,分離到5種以上的占64%,分離到6種以上的占36%。在同一組織塊中,有時(shí)可同時(shí)生長出2～3種菌落形態(tài)明顯不同的內(nèi)生真菌。2.3內(nèi)生菌的種類從附表中可見,在不同發(fā)育期的葉片中,雖然內(nèi)生菌總分離率都較高,但在葉芽中,內(nèi)生菌主要以細(xì)菌為主,占65%;在已展開的茶樹葉片中,內(nèi)生菌則以真菌為主,分別占89.28%和93.88%,內(nèi)生細(xì)菌的分離率低,占0～2.04%。2.4不同葉表的真菌培養(yǎng)對比茶樹內(nèi)生真菌與葉面微生物的分離結(jié)果相比較表明,在茶樹葉部微生物中,成熟葉片內(nèi)部以真菌的分布為主,而在葉片表面以細(xì)菌的分布為主;在茶葉的表面,細(xì)菌的數(shù)量為2.833×105cfu/g,真菌的數(shù)量為9×104cfu/g。從所得真菌在PDA培養(yǎng)基上的培養(yǎng)形態(tài)相比較,內(nèi)生真菌與葉表的附生真菌存在較大的差異;葉片表面生長著較多的青霉菌,而作者多批次內(nèi)生真菌分離的結(jié)果表明,按作者的方法在葉片內(nèi)部未分離到青霉菌。2.5不同菌株在葉中的分離率在分離到的茶樹內(nèi)生真菌中,經(jīng)?？梢姷挠幸韵?種內(nèi)生真菌:球座菌(I型)(Guignardiasp.)在PDA培養(yǎng)基上表現(xiàn)為黑綠色菌落;炭疽菌(Ⅱ型)(Colletotrichumsp.)表現(xiàn)為灰綠色菌落;擬盤多毛孢菌(Ⅲ型)(Pestalotiopsissp.)表現(xiàn)為白色菌落。從圖4可以看出,球座菌在成熟葉片和老葉中占明顯優(yōu)勢,分離率高達(dá)87.57%;在枝條中較少,分離率只有6.12%;根和葉芽中很難分離到。炭疽菌在枝條和葉片中均占優(yōu)勢,分離率分別為73.47%和55.62%,但在芽和根中的分布相對較少;擬盤多毛孢菌在葉芽、葉、枝和根中都有分布,但相對都較少,難以形成優(yōu)勢菌群。3討論3.1生物界cohen在多批次的茶樹內(nèi)生真菌分離中,除茶樹花瓣中尚未分離到內(nèi)生真菌外,在其它的茶樹組織中均不同程度地分離到內(nèi)生真菌,特別是在葉片和枝條中,可分離到豐富的內(nèi)生真菌,成熟葉片中內(nèi)生真菌的分離率可達(dá)93.88%～100%。這些分離結(jié)果與Arnold等和Rubini等在可可樹(Theobromacacao)的研究結(jié)果基本一致。自印度尼西亞西爪哇地區(qū)生長的茶樹莖桿中,Agusta等分離到35株內(nèi)生真菌。經(jīng)初步鑒定屬于6種真菌,分別是鐮孢菌屬(Fusariumsp.)1種,青霉屬(Penicilliumsp.)1種,裂褶菌屬(Schizophyllumsp.)2種和間座殼屬(Diaporthesp.)2種。而在山茶屬(Camellia)的另一植物茶花(C.japonica)中,Koide等自葉片中分離到的內(nèi)生真菌分別屬于齒裂菌屬(Coccomycesnipponicum),散斑殼屬(Lophodermiumsp.),Geniculosporiumsp.和膠孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)等。作者在福建分離的結(jié)果表明,不同地區(qū)的茶樹中生長的內(nèi)生真菌種群有一定差異。而茶樹品種對內(nèi)生真菌的分布也有明顯的影響。作者自茶樹中分離到的內(nèi)生真菌與Agusta等分離到的內(nèi)生真菌明顯不同,表明在不同的地理區(qū)域生長的茶樹中內(nèi)生真菌的分布可能有明顯的差異。已有的研究結(jié)果表明,內(nèi)生真菌的分離結(jié)果與研究中所采用的培養(yǎng)基、組織表面消毒劑及消毒方法、組織塊的大小等有密切的相關(guān)性。作者在2種培養(yǎng)基上分別可以分離得到不同的真菌,其中PDA培養(yǎng)基有利于快生性真菌的生長,而LCA培養(yǎng)基則有利于慢生性真菌的生長。近年來,應(yīng)用分子生物學(xué)方法于真菌物種多樣性的研究的結(jié)果表明,植物組織中真菌的物種多樣性比人們預(yù)料的要豐富得多。因此,采用常規(guī)人工培養(yǎng)基分離和分子生物學(xué)方法相結(jié)合,將大大促進(jìn)人們對地球上真菌物種多樣性的認(rèn)識。作者取樣研究的所有茶樹葉片中,均可以分離到多種不同的內(nèi)生真菌,而且多種真菌可從同一個(gè)組織塊中生長出來,表明茶樹葉片中生存有一個(gè)復(fù)雜的內(nèi)生真菌群體。這些真菌之間的相互作用關(guān)系以及這種相互作用對茶樹的影響尚不清楚。如此豐富的內(nèi)生真菌對茶樹是否有影響?有什么樣的影響?是需要進(jìn)一步探究的課題。共生真菌與寄主的相互作用關(guān)系及其在宿主生態(tài)適應(yīng)性中的地位是菌物生物學(xué)和生態(tài)學(xué)的基本內(nèi)容。在以往的植物生態(tài)學(xué)研究中,大多沒有考慮植物內(nèi)生微生物這一因素。作為植物體內(nèi)微生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分,在長期的協(xié)同進(jìn)化過程中,內(nèi)生真菌有可能從整體上參與和協(xié)調(diào)植物和環(huán)境因子的互作過程,從而對植物的生態(tài)適應(yīng)性產(chǎn)生積極的影響。3.2分生組織中內(nèi)生真菌的分布相對于禾本科植物的內(nèi)生真菌,木本植物的內(nèi)生真菌具有種類豐富、水平傳播和具組織?；缘忍卣鳌９P者的分離結(jié)果表明,茶樹內(nèi)生真菌的分布在不同的組織間具有明顯的組織?；?。在內(nèi)生真菌的種類和數(shù)量上,表現(xiàn)為葉、枝條>花托、種托>種皮、根>芽、種胚、花的明顯趨勢。而且不同的內(nèi)生真菌在不同的茶樹組織間的分布也表現(xiàn)為明顯的組織?；?一些內(nèi)生真菌容易在葉片中分離到,而另一些真菌在茶樹枝條中更容易分離到。茶樹是多年生木本植物,在生長過程中,茶樹不同的組織與飄浮于空氣中的真菌孢子接觸的機(jī)會(huì)是有差異的,葉和枝條由于生長期較長,其與真菌接觸的機(jī)會(huì)明顯比花和果實(shí)大,這可能是內(nèi)生真菌在葉和枝條中分布較多的部分原因;茶樹的芽和種子,由于分生組織的特性,其組織內(nèi)的內(nèi)生微生物相對較少,這種現(xiàn)象在許多的植物中都有發(fā)現(xiàn)。但在一些植物的芽和種子中,內(nèi)生菌的存在也是很普遍的現(xiàn)象,如在歐洲赤松(Pinussylvestris)的芽中經(jīng)?？煞蛛x到細(xì)菌,牧草內(nèi)生真菌可通過種子傳播到下一代等。什么因素決定某些微生物可以在植物的分生組織中生存和發(fā)展,是個(gè)需要進(jìn)一步研究的問題。在茶樹內(nèi)生真菌的組織分離過程中,筆者發(fā)現(xiàn),種皮和樹根中所含的化學(xué)物質(zhì)可能與內(nèi)生真菌的分布有一定的關(guān)系。能分泌出紅棕色物質(zhì)的組織中,分離到內(nèi)生真菌的概率明顯下降;而且分離到的內(nèi)生真菌與不能分泌出紅棕色物質(zhì)的組織中的內(nèi)生真菌明顯不