24學(xué)時(shí)細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)及研究法指導(dǎo)

細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)一不同顯微鏡的使用及細(xì)胞一般形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀測[實(shí)驗(yàn)?zāi)康腯通過本實(shí)驗(yàn)，使學(xué)生鞏固普通光學(xué)顯微鏡的使用，學(xué)習(xí)相差顯微鏡、暗視野顯微鏡和熒光顯微鏡的使用方法，學(xué)習(xí)顯微測量及顯微攝影的操作方法，增強(qiáng)對細(xì)胞的形態(tài)和真實(shí)大小的感性認(rèn)識。通過本實(shí)驗(yàn)操作，要求學(xué)生掌握細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的基本觀測方法與技術(shù)，為進(jìn)一步的細(xì)胞生物學(xué)研究打好基礎(chǔ)。[實(shí)驗(yàn)原理]應(yīng)用顯微鏡的成像原理(詳見翟中和等主編《細(xì)胞生物學(xué)》，第三章第一節(jié))，同時(shí)借助顯微鏡的鏡臺測微尺和目鏡測微尺，兩尺配合使用，進(jìn)行測量和運(yùn)算，觀察細(xì)胞形態(tài)，得出細(xì)胞的大小。該實(shí)驗(yàn)完成需時(shí)6學(xué)時(shí)。[實(shí)驗(yàn)材料、試劑和儀器]一、儀器普通光學(xué)顯微鏡、相差顯微鏡、暗視野顯微鏡、熒光顯微鏡、顯微拍攝系統(tǒng)、37℃二、材料洋蔥根尖切片標(biāo)本，念珠藻永久裝片，兔肝細(xì)胞標(biāo)本，夾竹桃花絲毛細(xì)胞，人口腔上皮細(xì)胞等。三、試劑生理鹽水，10μg/mL羅丹明123染液（溶于甲醇，避光于4℃保存[實(shí)驗(yàn)步驟]一、暗視野顯微鏡觀察夾竹桃花絲毛細(xì)胞1、取一張清潔的載玻片，滴上一滴生理鹽水。用鑷子輕輕夾下一根夾竹桃花絲，置生理鹽水中，蓋上蓋玻片，略微壓片，用濾紙條吸去蓋玻片四周多余的水分。2、將上述裝片置于顯微鏡載物臺上，在10×物鏡下找到夾竹桃花絲毛細(xì)胞清晰的圖像。3、換上暗視野聚光器，調(diào)節(jié)至最佳位置，通過聚光器上的調(diào)中螺旋調(diào)節(jié)聚光器的中心位置，得到最好的暗視野圖像效果。4、觀察夾竹桃花絲毛細(xì)胞內(nèi)部的顯微結(jié)構(gòu)和細(xì)胞質(zhì)環(huán)流現(xiàn)象，并拍照。5、換用高倍物鏡觀察時(shí)，要換用與高倍鏡相匹配的暗視野聚光器，重復(fù)以上調(diào)節(jié)步驟。二、相差顯微鏡觀察夾竹桃花絲毛細(xì)胞1、取一張清潔的載玻片，滴上一滴生理鹽水。用鑷子輕輕夾下一根夾竹桃花絲，置生理鹽水中，蓋上蓋玻片，略微壓片，用濾紙條吸去蓋玻片四周多余的水分。2、將裝片置于載物臺上，在明視野用聚焦螺旋聚焦樣品，將觀察到的夾竹桃花絲毛細(xì)胞移到視野中央。3、換上10×相差物鏡和相應(yīng)的相差聚光器，完全打開聚光器的孔徑光闌，裝上綠色濾光片，調(diào)節(jié)光源，使視野內(nèi)亮度均勻。4、撥出目鏡，插入中心望遠(yuǎn)鏡，找到環(huán)狀光闌的亮環(huán)和相板的黑環(huán)，調(diào)節(jié)聚光器，使二者完全重合。5、拔出望遠(yuǎn)鏡，插入目鏡，鏡檢、拍照。6、換用高倍相差物鏡觀察時(shí)，要換用與之相匹配的聚光器環(huán)狀光闌，重復(fù)以上調(diào)節(jié)步驟。三、熒光顯微鏡觀察人口腔上皮細(xì)胞1、用滅菌的牙簽刮取口腔上皮細(xì)胞，涂于潔凈的載玻片上，滴上一滴羅丹明123染液，于37℃2、蓋上蓋玻片，吸去多余的液體。3、將裝片置于載物臺上，10×物鏡下找到樣品焦面，關(guān)閉透射光，置于激發(fā)光為藍(lán)光、發(fā)射綠色熒光的濾片組合塊下觀察線粒體。必要的話，可換用40×熒光物鏡進(jìn)一步觀察、拍照。四、測微尺的使用操作1、卸下目鏡的上透鏡，將目鏡測微尺有刻度一面向下裝在目鏡鏡面上，再旋上目鏡的上透鏡。2、將鏡臺測微尺有刻度一面朝上放在載物臺上夾好，使測微尺刻度位于視野中央。調(diào)焦至看清鏡臺測微尺的刻度。3、小心移動(dòng)鏡臺測微尺和目鏡測微尺(如目鏡測微尺刻度模糊，可轉(zhuǎn)動(dòng)目鏡上透鏡進(jìn)行調(diào)焦)，使兩尺左邊的"0"點(diǎn)一直線重合，然后由左向右找出兩尺另一次重復(fù)的直線(圖1)。4、記錄兩條重合線間目鏡測微尺和鏡臺測微尺的格數(shù)。按下式計(jì)算目鏡測微尺每格的長度等于多少μm目鏡測微尺每格的長度（μm）=鏡臺測微尺的格數(shù)/目鏡測微尺的格數(shù)*10圖1目鏡測微尺的標(biāo)定上：目鏡測微尺，下：鏡臺測微尺五、幾種不同類型細(xì)胞形態(tài)的觀察及大小測量觀察各種裝片標(biāo)本，注意不同類型細(xì)胞的形態(tài)及大小差異。用目鏡測微尺和鏡臺測微尺測量細(xì)胞的長、短徑或半徑的長度，每類被測物測3個(gè)數(shù)據(jù)，最后取平均值。[實(shí)驗(yàn)結(jié)果]將上述觀察及測量結(jié)果記錄于下表，并計(jì)算細(xì)胞的大小。細(xì)胞名稱形態(tài)特征長、短徑或半徑（微米）細(xì)胞面積（平方微米）[注意事項(xiàng)]1、熒光鏡下觀察細(xì)胞時(shí)，由于熒光易淬滅，觀察時(shí)要盡量快。2、熒光探針都有一定的毒性，因此操作時(shí)要注意防止污染皮膚和環(huán)境，如弄到手上或桌子上，應(yīng)及時(shí)沖洗。[實(shí)驗(yàn)報(bào)告]完成上述表格。思考：不同物鏡放大倍數(shù)下，目鏡測微尺每格的單位是否相同？思考：不同類型顯微鏡的適用范圍有何不同？實(shí)驗(yàn)二細(xì)胞膜的滲透性觀察[實(shí)驗(yàn)?zāi)康腯通過本實(shí)驗(yàn)，學(xué)習(xí)、掌握觀察、研究細(xì)胞膜物質(zhì)通透性作用的實(shí)驗(yàn)方法與技能。了解細(xì)胞膜對物質(zhì)通透性的一般規(guī)律。了解溶血現(xiàn)象及其發(fā)生機(jī)制。[實(shí)驗(yàn)原理]細(xì)胞膜是細(xì)胞與環(huán)境進(jìn)行物質(zhì)交換的選擇通透性屏障。它是一種半透膜，可選擇性控制物質(zhì)進(jìn)出細(xì)胞。各種物質(zhì)出入細(xì)胞的方式是不同的，水是生物界最普遍的溶劑，水分子可以按照物質(zhì)濃度梯度從滲透壓低的一側(cè)通過細(xì)胞膜向滲透壓高的一側(cè)擴(kuò)散，這種現(xiàn)象就是滲透。滲透作用是細(xì)胞膜的主要功能之一。將紅細(xì)胞放在低滲鹽溶液中，水分子大量滲到細(xì)胞內(nèi)，可使細(xì)胞脹破，血紅蛋白釋放到介質(zhì)中，由不透明的紅細(xì)胞懸液變?yōu)榧t色透明的血紅蛋白溶液，這種現(xiàn)象稱為溶血。將紅細(xì)胞放在某些等滲鹽溶液中，由于紅細(xì)胞膜對各種溶質(zhì)的通透性不同，膜兩側(cè)的滲透壓平衡會(huì)發(fā)生改變，也會(huì)發(fā)生溶血現(xiàn)象。因此，發(fā)生溶血現(xiàn)象所需時(shí)間長短可作為測量物質(zhì)進(jìn)入紅細(xì)胞速度的一種指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)選用紅細(xì)胞作為細(xì)胞膜透性的實(shí)驗(yàn)材料，將其放入不同的介質(zhì)溶液中，觀察紅細(xì)胞的變化。當(dāng)紅細(xì)胞置于不同等滲溶液中時(shí)，由于對各種溶質(zhì)的通透性不同，因此有的溶質(zhì)分子可透入，有的溶質(zhì)分子則不能透入，能透入的溶質(zhì)分子的速度也不同。當(dāng)溶質(zhì)分子進(jìn)入紅細(xì)胞使細(xì)胞內(nèi)溶質(zhì)濃度增加時(shí)，導(dǎo)致水的攝入。當(dāng)紅細(xì)胞吸水膨脹到一定程度時(shí)，細(xì)胞膜破裂，血紅素溢出即紅細(xì)胞發(fā)生溶血。由于溶質(zhì)透入速度不同，溶血時(shí)間也不同。該實(shí)驗(yàn)完成需時(shí)3學(xué)時(shí)。[實(shí)驗(yàn)材料、試劑和儀器]一、儀器普通光學(xué)顯微鏡、手術(shù)刀、秒表、載玻片、蓋玻片、吸管、小燒杯、試管等。二、材料雞或鴨血細(xì)胞三、試劑1.5％氯化鈉，生理鹽水，0.17mol／L氯化鈉，0.17mol／L硝酸鈉，0.12mol／L硫酸鈉，0.12mol／L草酸鈉，0.32mol／L葡萄糖，0.32mol／L甘油，0.32mol／L乙醇，0.32mol／L丙醇。[實(shí)驗(yàn)步驟]一、紅細(xì)胞滲透壓的觀測取一小燒杯，加入新鮮雞血，迅速以十倍生理鹽水稀釋，制成雞血細(xì)胞懸浮液。取5支試管，編號后依次向各試管加入1.5％氯化鈉5，3，2.16，1，0mL，然后分別向各試管加入蒸餾水，使每一試管總體積達(dá)到5mL，配成一濃度梯度的氯化鈉溶液。向每一試管加入0.5mL雞血細(xì)胞懸液，立即輕輕搖勻。稍停片刻后，觀察溶血情況，并記錄于表一。二、紅細(xì)胞對不同溶質(zhì)的滲透性觀察取8支試管編號，依次向各試管加入等滲溶液0.17mol／L氯化鈉，0.17mol／L硝酸鈉，0.12mol／L硫酸鈉，0.12mol／L草酸鈉，0.32mol／L葡萄糖，0.32mol／L甘油，0.32mol／L乙醇，0.32mol／L丙醇各5mL。向每一試管加入0.5mL雞血細(xì)胞懸液，立即輕輕搖勻。觀察溶血情況，并記錄于表二。[實(shí)驗(yàn)結(jié)果]將實(shí)驗(yàn)結(jié)果記錄于表一、二，并加以分析。試管編號實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目123451.5％氯化鈉（mL）532.1610蒸餾水（mL）022.8445氯化鈉濃度（％）1.50.90.650.30血細(xì)胞懸液（mL）0.50.50.50.50.5細(xì)胞形態(tài)及溶血情況結(jié)果分析表一紅細(xì)胞滲透壓的觀測試管編號是否溶血溶血時(shí)間結(jié)果分析1、0.17mol／L氯化鈉2、0.17mol／L硝酸鈉3、0.12mol／L硫酸鈉4、0.12mol／L草酸鈉5、0.32mol／L葡萄糖6、0.32mol／L甘油7、0.32mol／L乙醇8、0.32mol／L丙醇表二紅細(xì)胞對不同溶質(zhì)的滲透性觀察[注意事項(xiàng)]新鮮雞血提取后要立即稀釋，否則會(huì)凝固結(jié)塊，影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作。[實(shí)驗(yàn)報(bào)告]完成表一、表二并對實(shí)驗(yàn)結(jié)果加以分析。實(shí)驗(yàn)三活體染色及不同細(xì)胞結(jié)構(gòu)的觀察[實(shí)驗(yàn)?zāi)康腯通過本實(shí)驗(yàn)，使學(xué)生掌握活體染色的基本原理和一般方法，并通過對綠豆根根尖細(xì)胞液泡系和洋蔥鱗莖表皮細(xì)胞線粒體的活體染色觀察、了解液泡系和線粒體的形態(tài)及其在細(xì)胞中的分布。觀察胞間連絲及葉綠體的形態(tài)及其在細(xì)胞中的分布。[實(shí)驗(yàn)原理]活體染色是利用某些無毒或毒性較小的染色劑顯示出細(xì)胞內(nèi)某些天然構(gòu)造存在的真實(shí)性，而不影響細(xì)胞的生命活動(dòng)和產(chǎn)生任何物理、化學(xué)變化以至引起細(xì)胞死亡的一種染色方法。其主要特征是染料的堆積，即染料的膠粒固定、堆積在細(xì)胞內(nèi)某種特殊的構(gòu)造里面。這種堆積主要是受染料分子的電荷影響。因?yàn)閴A性染料的膠粒表面帶有陽離子，酸性染料的膠粒表面帶有陰離子，它們彼此之間會(huì)發(fā)生電吸附作用（靜電吸附）?；铙w染色的另一特征是專一性。例如中性紅只染液泡系，詹納斯綠－B只染線粒體，而細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核在活體染色過程中并不被染色。只有當(dāng)細(xì)胞死亡或開始死亡時(shí)，細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核才能被染成均勻一致的顏色。該實(shí)驗(yàn)完成需時(shí)4學(xué)時(shí)。[實(shí)驗(yàn)材料、試劑和儀器]一、儀器普通光學(xué)顯微鏡、雙面刀片、載玻片、蓋玻片、吸管等。二、試劑Ringer氏溶液、1/3000濃度的中性紅溶液、1/5000濃度的詹納斯綠－B溶液三、實(shí)驗(yàn)材料黃豆（或綠豆）幼根根尖，洋蔥鱗片葉表皮細(xì)胞，菠菜葉，胞間連絲永久裝片[實(shí)驗(yàn)步驟]一、液泡系的活體染色及觀察1、用雙面刀片把初生的黃豆（或綠豆）幼根根尖（約1－2cm長）小心切一縱斷面薄片，放在預(yù)先滴有一滴1/3000濃度的中性紅溶液的載玻片中央，染色15分鐘。2、用滴管吸去染液，滴加一滴Ringer氏液，蓋上蓋玻片，鏡檢。二、線粒體的活體染色及觀察1、用鑷子撕下一小塊洋蔥鱗片葉表皮，放在預(yù)先滴有一滴1/5000濃度的詹納斯綠－B溶液的載玻片中央，染色30分鐘。2、用滴管吸去染液，滴加一滴Ringer氏液，蓋上蓋玻片，鏡檢。三、葉綠體的觀察1、取一小塊菠菜葉，放在預(yù)先滴有一滴Ringer氏溶液的載玻片中央，用鑷子將菠菜葉夾碎，蓋上蓋玻片，鏡檢。四、胞間連絲的觀察取一片胞間連絲永久裝片，置顯微鏡下認(rèn)真觀察。[實(shí)驗(yàn)結(jié)果]1、中性紅溶液染色結(jié)果：可見生長點(diǎn)細(xì)胞內(nèi)有很多大小不等的被染成玫瑰紅色的圓形液泡。若觀察已分化長大的細(xì)胞，可見到較大的液泡，數(shù)目較少，有時(shí)只有一個(gè)淺紅色的中央大液泡，其中有些深紅色顆粒作布朗運(yùn)動(dòng)。2、詹納斯綠－B溶液染色結(jié)果：可見線粒體被染成蘭綠色，呈顆粒狀或線條狀，在細(xì)胞核周圍分布得特別多。[實(shí)驗(yàn)報(bào)告]繪圖示黃豆（或綠豆）幼根根尖細(xì)胞液泡系。繪圖示洋蔥表皮線粒體。思考：用一種活體染色劑處理細(xì)胞，為什么不能同時(shí)看到多種細(xì)胞器被染色。實(shí)驗(yàn)四細(xì)胞組分的分離與觀察[實(shí)驗(yàn)?zāi)康腯掌握細(xì)胞組分的分離方法（差速離心法）的原理及操作步驟，掌握離心機(jī)、組織搗碎機(jī)的使用方法。掌握細(xì)胞組分的鑒定方法。為進(jìn)一步研究亞細(xì)胞組分的化學(xué)組成、理化特性及其功能奠定基礎(chǔ)。[實(shí)驗(yàn)原理]差速離心是指低速與高速離心交替進(jìn)行，使各種沉降系數(shù)不同的顆粒先后沉淀下來，達(dá)到分離的目的。沉降系數(shù)差別在一個(gè)或幾個(gè)數(shù)量級的顆粒，可以用此法分離。樣品離心時(shí)，在同一離心條件下，沉降速度不同，通過不斷增加相對離心力，使一個(gè)非均勻混合液內(nèi)的大小、形狀不同的粒子分步沉淀。操作過程中一般是在離心后用傾倒的辦法把上清液與沉淀分開，然后將上清液加高轉(zhuǎn)速離心，分離出第二部分沉淀，如此往復(fù)加高轉(zhuǎn)速，逐級分離出所需要的物質(zhì)。將細(xì)胞充分破碎后，可用差速離心法分離細(xì)胞各組份。如用一定的介質(zhì)進(jìn)行組織勻漿，然后通過差速離心，先用較低的轉(zhuǎn)速把比重較大的細(xì)胞核從細(xì)胞質(zhì)組分及其它碎片的懸浮液中分開，再經(jīng)過反復(fù)洗滌，就能得到純凈的細(xì)胞核。再用較高的轉(zhuǎn)速把上清夜中的較小顆粒沉淀下來（如線粒體），從而使各種細(xì)胞結(jié)構(gòu)得以分離。為了保護(hù)細(xì)胞組分的活性，全部操作過程應(yīng)在0℃~4葉綠體是植物細(xì)胞中較大的一種細(xì)胞器，能發(fā)生特有的能量轉(zhuǎn)換。利用低速離心機(jī)可以分離葉綠體，其分離在等滲溶液（0.35mol/L氯化鈉或0.4mol/L蔗糖溶液）中進(jìn)行，目的是為了防止?jié)B透壓的改變引起葉綠體的損傷。將勻漿液在1000r/min離心，去除其中的組織殘?jiān)鸵恍┪幢黄扑榈耐暾?xì)胞，然后，3000r/min離心，可獲得沉淀的葉綠體（混有部分細(xì)胞核）。在室溫下進(jìn)行分離要迅速。某些物質(zhì)在一定短波長的光（如紫外光）的照射下吸收光能進(jìn)入激發(fā)態(tài)，從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時(shí)，就能在極短的時(shí)間內(nèi)放射出比照射光波長更長的光（如可見光），這種光就稱為熒光。若停止供能，熒光現(xiàn)象立即停止。有些生物體內(nèi)的物質(zhì)受激發(fā)光照射后，可直接發(fā)出熒光（稱為自發(fā)熒光），如葉綠素的火紅色熒光。有的生物材料本身不發(fā)熒光，但它吸收熒光染料后同樣也能發(fā)出熒光（稱為間接熒光），如葉綠體吸附吖啶橙后可發(fā)橘紅色熒光。本實(shí)驗(yàn)利用熒光顯微鏡對發(fā)熒光的葉綠體進(jìn)行觀察。該實(shí)驗(yàn)完成需時(shí)6學(xué)時(shí)。[實(shí)驗(yàn)材料、試劑和儀器]一、儀器冷凍離心機(jī)、組織搗碎機(jī)、熒光顯微鏡、普通光學(xué)顯微鏡、解剖針、燒杯、量筒、載玻片、蓋玻片等。二、材料鴨肝、菠菜三、試劑1.5%檸檬酸水溶液、0.25mol/L蔗糖-1.5%檸檬酸水溶液(pH7.4)、0.88mol/L蔗糖-1.5%檸檬酸水溶液(pH7.4)、0.35mol/LNaCl溶液、詹納斯綠B染液、0.01%吖啶橙、生理鹽水等。[實(shí)驗(yàn)步驟]一、細(xì)胞核與線粒體的分離與觀察1、鴨子饑餓24小時(shí)后處死，剖腹取肝，剪成小塊，用生理鹽水洗干凈。2、稱取10g鴨肝，在冰浴上剪碎，加入100mL1.5%檸檬酸水溶液，用組織搗碎機(jī)充分破碎細(xì)胞（10000－20000r/min，5－10秒/次）。3、勻漿液用四層紗布過濾，取1.5mL濾液經(jīng)1500g離心10min，取上清夜，移入高速離心管，保存于有冰塊的燒杯中，（待分離線粒體用），沉淀即為粗核沉淀。4、在上述沉淀中加入1.5mL1.5%檸檬酸水溶液。離心（同步驟3），棄上清夜，重復(fù)步驟4兩次。5、在上述沉淀中加入1.5mL0.25mol/L蔗糖-1.5%檸檬酸水溶液，制成懸浮液A，另取一離心管，加入1.0mL0.88mol/L蔗糖-1.5%檸檬酸水溶液，然后在其上滴加0.5mLA液，經(jīng)3000g離心20min，棄上清夜，得到較為純凈的細(xì)胞核沉淀。6、在上述沉淀中加入0.2mL0.25mol/L蔗糖-1.5%檸檬酸水溶液，制成細(xì)胞核懸浮液。7、取一片潔凈的載玻片，滴上一滴0.01%吖啶橙熒光染料，然后滴一滴細(xì)胞核懸浮液，用牙簽混勻，加蓋玻片，鏡檢。8、將步驟3中保留有上清夜的高速離心管取出，以離心力8000g離心10min，棄上清夜，留沉淀。9、在上述沉淀中加入1.5mL0.25mol/L蔗糖-1.5%檸檬酸水溶液，懸浮后離心（同步驟8），棄上清夜，留沉淀。10、在上述沉淀中加入0.2mL0.25mol/L蔗糖-1.5%檸檬酸水溶液，制成線粒體懸浮液。11、取一片潔凈的載玻片，滴上一滴詹納斯綠B染液，然后滴一滴線粒體懸浮液，用牙簽混勻，染色5min，加蓋玻片，鏡檢。二、葉綠體的分離與觀察1、選取新鮮的菠菜嫩葉，洗擦干后去除葉梗及粗脈，稱3g于0.35mol/L氯化鈉溶液15mL中置組織搗碎機(jī)中。2、利用組織搗碎機(jī)低速（5000r/min）勻漿，3~5min。3、用6層紗布過濾，濾液盛于燒杯中。4、取濾液4mL在1000r/min下離心2min，棄去沉淀。5、將上清液在3000r/min下離心5min，棄去上清液，沉淀即為葉綠體（混有部分細(xì)胞核）。6、沉淀用0.35mol/L氯化鈉溶液懸浮。7、取葉綠體懸液1滴置于載玻片上，加蓋玻片后用普通光學(xué)顯微鏡觀察。使用熒光顯微鏡觀察時(shí)，將葉綠體懸液滴在無熒光的載玻片上，再滴加1滴0.01%吖啶橙熒光染料，蓋上無熒光的蓋玻片后即可觀察。8、觀察葉綠體的形態(tài)結(jié)構(gòu)、葉綠體發(fā)射熒光的現(xiàn)象。[實(shí)驗(yàn)結(jié)果]普通顯微鏡下，細(xì)胞核呈圓球形，可清楚地看到細(xì)胞核內(nèi)的核仁。線粒體呈顆粒狀或線狀，被染成蘭綠色。熒光顯微鏡下，細(xì)胞核發(fā)出綠色熒光。普通顯微鏡下，可看到葉綠體為綠色橄欖形，內(nèi)部含有較深的綠色小顆粒－基粒。熒光顯微鏡下，未染色的葉綠體發(fā)出火紅色熒光，吸附吖啶橙后發(fā)橘紅色熒光，其中混有細(xì)胞核的發(fā)綠色熒光。[注意事項(xiàng)]1、為了保護(hù)細(xì)胞組分的活性，全部操作過程應(yīng)在0℃~42、熒光鏡下觀察細(xì)胞時(shí)，由于熒光易淬滅，觀察時(shí)要盡量快。3、熒光探針都有一定的毒性，因此操作時(shí)要注意防止污染皮膚和環(huán)境，如弄到手上或桌子上，應(yīng)及時(shí)沖洗。[實(shí)驗(yàn)報(bào)告]1、繪圖表示觀察結(jié)果。2、思考題：要獲得高活性的細(xì)胞組分，在分離過程中有哪些注意事項(xiàng)。3、思考題：細(xì)胞內(nèi)各組分如何分離？分離原理是什么？實(shí)驗(yàn)五細(xì)胞化學(xué)成分的分析[實(shí)驗(yàn)?zāi)康腯通過本實(shí)驗(yàn)，了解細(xì)胞化學(xué)方法的基本原理，掌握DNA、RNA、酸性蛋白和堿性蛋白在細(xì)胞內(nèi)分布的檢測方法。[實(shí)驗(yàn)原理]細(xì)胞化學(xué)方法，是在保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上，利用某些化學(xué)試劑和細(xì)胞內(nèi)的某些物質(zhì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生在顯微鏡下可觀察的有顏色的反應(yīng)產(chǎn)物，從而可對該物質(zhì)在細(xì)胞中的含量及所處位置進(jìn)行定性與定量分析的一種細(xì)胞組分的分析方法。DNA經(jīng)弱酸（1mol/LHCl）水解，其上的嘌呤堿和脫氧核糖之間的鍵打開，使脫氧核糖的一端形成游離的醛基，這些醛基在原位與希夫試劑反應(yīng)，形成紫紅色的化合物，使細(xì)胞內(nèi)含有DNA的部位呈現(xiàn)紫紅色陽性反應(yīng)。這就是顯示DNA的傳統(tǒng)細(xì)胞化學(xué)方法Feulgen反應(yīng)。DNA和RNA由于聚合程度不同而對堿性染料有不同的親和力，可進(jìn)行選擇性染色。由于甲基綠分子上有兩個(gè)相對的正電荷，它對聚合程度高的DNA有強(qiáng)的親和力，而派羅寧分子只有一個(gè)相對正電荷，它僅和聚合程度較低的RNA結(jié)合，因而DNA和RNA可被甲基綠和派羅寧分別染色。由于不同蛋白質(zhì)分子中所帶有的堿性基團(tuán)和酸性基團(tuán)的數(shù)量不同，在不同的pH溶液中，整個(gè)蛋白質(zhì)所帶的正負(fù)電荷也就不同，如在生理?xiàng)l件下，整個(gè)蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷多，則為酸性蛋白質(zhì)，反之為堿性蛋白。據(jù)此，可將標(biāo)本（經(jīng)三氯醋酸處理，除去核酸，消除影響因素）用不同pH的固綠染色液染色，使細(xì)胞內(nèi)的酸性和堿性蛋白分別顯示出來。該實(shí)驗(yàn)完成需時(shí)6學(xué)時(shí)。[實(shí)驗(yàn)材料、試劑和儀器]一、儀器普通光學(xué)顯微鏡、水浴鍋、載玻片、蓋玻片、吸管、小燒杯、試管、手術(shù)刀、解剖剪、鑷子、解剖盤等。二、材料洋蔥根尖、蟾蜍三、試劑希夫試劑、亞硫酸水、1M鹽酸、5％三氯醋酸、45％醋酸、70％乙醇、甲基綠－派羅寧混合液、0.1％酸性固綠染液（pH2.0－2.5）、0.1％堿性固綠染液（pH8.0－8.5）、乙醚等。[實(shí)驗(yàn)步驟]一、細(xì)胞內(nèi)DNA和RNA的顯示方法（一）Feulgen反應(yīng)1、切取長約0.5cm的洋蔥根尖末端，在60℃的1M2、希夫試劑染色30min，直至根尖出現(xiàn)紫紅色為止。3、用亞硫酸水浸泡2min。4、重復(fù)步驟3三次。5、流水沖洗5min。6、將根尖放在載玻片上，加一滴45％醋酸，壓片鏡檢。7、對照：在材料進(jìn)入1M熱鹽酸水解前，用5％三氯醋酸在90℃（二）Brachet反應(yīng)1、取一只經(jīng)乙醚麻醉的蟾蜍，取血制成血涂片，晾干。2、70％乙醇固定10min，晾干。3、將甲基綠－派羅寧混合液滴于涂片上，覆蓋血膜，染色20min。4、用清水洗凈染液，吸去多余水分，晾干后鏡檢。二、細(xì)胞內(nèi)酸性蛋白和堿性蛋白的顯示方法1、取一只經(jīng)乙醚麻醉的蟾蜍，取血制成血涂片，晾干。2、取兩張晾干的血涂片與70％乙醇固定5min，清水洗凈。3、將涂片浸于5％三氯醋酸，90℃4、將一張涂片浸入0.1％酸性固綠染液（pH2.0－2.5）染色3min，清水洗凈染液，晾干鏡檢；另一張涂片浸入0.1％堿性固綠染液（pH8.0－8.5）染色30min，清水洗凈染液，晾干鏡檢。[實(shí)驗(yàn)結(jié)果]經(jīng)Feulgen反應(yīng)的洋蔥根尖細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)、核仁無色，染色質(zhì)被染成紫紅色。對照組洋蔥根尖細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核均無色。經(jīng)Brachet反應(yīng)染色的蟾蜍血涂片細(xì)胞核被染成蘭綠色，核仁和細(xì)胞質(zhì)被染成紅色。經(jīng)酸性固綠染色的蟾蜍血涂片，整個(gè)細(xì)胞質(zhì)和核仁中蛋白質(zhì)被染成綠色。經(jīng)堿性固綠染色的蟾蜍血涂片，只有細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)被染成綠色。[注意事項(xiàng)]希夫試劑見光易氧化分解，失去染色能力。因而在實(shí)驗(yàn)操作過程中，應(yīng)注意遮光操作。[實(shí)驗(yàn)報(bào)告]繪圖并說明實(shí)驗(yàn)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)六動(dòng)物細(xì)胞的原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)[實(shí)驗(yàn)?zāi)康腯通過本實(shí)驗(yàn)，了解、掌握動(dòng)物細(xì)胞的基本培養(yǎng)技術(shù)，為進(jìn)一步的以培養(yǎng)細(xì)胞為材料的細(xì)胞生物學(xué)及分子生物學(xué)研究打下基礎(chǔ)。[實(shí)驗(yàn)原理]動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是用無菌操作的方法將動(dòng)物體內(nèi)的細(xì)胞、組織(或器官)取出，模擬動(dòng)物體內(nèi)的生理?xiàng)l件，在體外進(jìn)行培養(yǎng)，使其不斷地生長、繁殖，人們借以觀察研究細(xì)胞的生長、繁殖、細(xì)胞分化以及細(xì)胞衰老等過程的生命現(xiàn)象的一種細(xì)胞生物學(xué)研究技術(shù)。動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)廣泛地被應(yīng)用于生物學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。如分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、細(xì)胞工程學(xué)、遺傳學(xué)、免疫學(xué)、腫瘤學(xué)及病毒學(xué)等。細(xì)胞培養(yǎng)是一種操作繁瑣而又要求十分嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)技術(shù)。要使細(xì)胞能在體外長期生長，必須滿足兩個(gè)基本要求：一是供給細(xì)胞存活所必需的條件，如適量的水、無機(jī)鹽、氨基酸、維生素、葡萄糖及其有關(guān)的生長因子、氧氣、適宜的溫度，注意外環(huán)境酸堿度和滲透壓的調(diào)節(jié)。二是嚴(yán)格控制無菌條件。由動(dòng)物體內(nèi)直接取出組織或細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)叫原代培養(yǎng)。培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)一段時(shí)間的培養(yǎng)后，由于密度過大、生存空間不足，易引起營養(yǎng)枯竭，細(xì)胞不再生長。這時(shí)將細(xì)胞從一個(gè)培養(yǎng)瓶以1：2或1：2以上的比例轉(zhuǎn)移，接種到另一培養(yǎng)瓶培養(yǎng)，使細(xì)胞得以繼續(xù)分裂生長，此即為傳代培養(yǎng)。該實(shí)驗(yàn)完成需時(shí)12學(xué)時(shí)。[實(shí)驗(yàn)器材]一、儀器倒置顯微鏡、二氧化碳培養(yǎng)箱、超凈工作臺、高壓滅菌鍋、磁力攪拌器、過濾器、干燥箱、解剖剪、解剖鑷、眼科剪(尖頭、彎頭)、眼科鑷(尖頭、彎頭)、培養(yǎng)皿、量筒、試管、錐形瓶、吸管、橡皮頭、培養(yǎng)瓶(小方瓶或中方瓶)、血細(xì)胞計(jì)數(shù)器、血細(xì)胞計(jì)數(shù)板、酒精燈、酒精棉球、碘酒棉球、試管架、標(biāo)記筆、解剖板等。二、材料小鼠、Hela細(xì)胞[實(shí)驗(yàn)試劑]PBS緩沖液、RPMI1640培養(yǎng)液（含10％小牛血清和青霉素、鏈霉素）、細(xì)胞消化液（0.5％胰蛋白酶和0.4%EDTA混合液）、75％乙醇、Hanks液等。[實(shí)驗(yàn)步驟]一、動(dòng)物細(xì)胞的原代培養(yǎng)1、用頸椎脫臼法迅速處死小鼠，將小鼠浸入75％乙醇中消毒1min后取出，放在超凈工作臺上的解剖盤上，剖腹取出肝臟或腎臟，置無菌培養(yǎng)皿中，用滅菌的PBS緩沖液沖洗三次，用手術(shù)剪將組織修剪成1mm3左右的小塊，用PBS緩沖液洗至發(fā)白，用無菌濾紙吸去多余緩沖液，將組織塊移入無菌離心管。2、在離心管中加入1mL混合消化液，蓋上蓋子，于37℃3、向離心管中加入3mLPBS緩沖液，制成細(xì)胞懸液，于300g離心力下離心5min，棄上清夜。4、向離心管中加入3mLRPMI1640培養(yǎng)液（含10％小牛血清和青霉素、鏈霉素），制成細(xì)胞懸液。5、將上述細(xì)胞懸液接種至培養(yǎng)瓶中，置于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。二、動(dòng)物細(xì)胞的傳代培養(yǎng)1、將Hela細(xì)胞或上述原代培養(yǎng)細(xì)胞從培養(yǎng)箱中取出，于超凈工作臺上，將舊的培養(yǎng)液倒掉，加入少許混合消化液，消化10min（消化過程中隨時(shí)在顯微鏡下觀察被消化細(xì)胞的形態(tài)，如果細(xì)胞開始變圓，即可終止消化）。2、倒掉消化液，加入5mL新鮮培養(yǎng)液，制成細(xì)胞懸浮液。3、取一半細(xì)胞懸浮液至另一培養(yǎng)瓶中，在兩個(gè)培養(yǎng)瓶中分別3mL新鮮培養(yǎng)液，蓋好瓶塞，至二氧化碳培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。[實(shí)驗(yàn)結(jié)果]原代培養(yǎng)接種后幾個(gè)小時(shí)即能觀察到細(xì)胞開始貼壁生長，7天左右形成單層。傳代后的細(xì)胞在2小時(shí)左右開始貼壁生長，4天左右形成單層，此時(shí)需再次進(jìn)行傳代培養(yǎng)。[注意事項(xiàng)]1、注意無菌操作，防止細(xì)胞污染。2、如發(fā)現(xiàn)細(xì)胞有污染現(xiàn)象，應(yīng)及時(shí)采取措施處理。[實(shí)驗(yàn)報(bào)告]1、記錄實(shí)驗(yàn)過程和細(xì)胞生長狀況。2、思考：在動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過程中如何達(dá)到無菌操作？實(shí)驗(yàn)七培養(yǎng)細(xì)胞的計(jì)數(shù)和活性鑒定[實(shí)驗(yàn)?zāi)康腯通過本實(shí)驗(yàn)，了解、掌握培養(yǎng)細(xì)胞的計(jì)數(shù)方法及活性的鑒定方法。[實(shí)驗(yàn)原理]細(xì)胞計(jì)數(shù)法是細(xì)胞培養(yǎng)過程中的一項(xiàng)基本技術(shù)，在細(xì)胞生物學(xué)的實(shí)驗(yàn)中，往往要進(jìn)行細(xì)胞的計(jì)數(shù)，以調(diào)整細(xì)胞的密度，確保細(xì)胞順利生長，同時(shí)細(xì)胞計(jì)數(shù)方法也是繪制細(xì)胞生長曲線的基礎(chǔ)。細(xì)胞計(jì)數(shù)的原理較簡單，只要從需要計(jì)數(shù)的細(xì)胞懸液中取一定體積的懸液，稀釋后在顯微鏡下利用細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)，即可換算出原始細(xì)胞懸液中細(xì)胞的密度以及細(xì)胞總數(shù)。培養(yǎng)細(xì)胞活力的鑒定也是細(xì)胞培養(yǎng)必不可少的一種基本技能。細(xì)胞培養(yǎng)中檢查細(xì)胞死活可以通過死、活細(xì)胞對色素不同的吸附能力來判斷細(xì)胞死活。如在臺盼藍(lán)染料作用下，死細(xì)胞被染成藍(lán)色，活細(xì)胞不著色。該實(shí)驗(yàn)完成需時(shí)3學(xué)時(shí)。[實(shí)驗(yàn)器材]一、儀器血細(xì)胞計(jì)數(shù)板、普通光學(xué)顯微鏡、乳頭吸管等。二、材料各種培養(yǎng)細(xì)胞。[實(shí)驗(yàn)試劑]0.5%臺盼藍(lán)生理鹽水溶液、0.25%胰蛋白酶/0.02%EDTA混合消化液、0.1％結(jié)晶紫生理鹽水溶液、生理鹽水、Hanks液等。[實(shí)驗(yàn)步驟]一、培養(yǎng)細(xì)胞活性鑒定1、臺盼藍(lán)染色法：用混合消化液消化培養(yǎng)細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液。取0.5mL的細(xì)胞懸液，加入0.5mL0.5%臺盼藍(lán)染液，染色3min后即可鏡檢?；罴?xì)胞不著色，死細(xì)胞被染成藍(lán)色。2、結(jié)晶紫染色法：0.1％的結(jié)晶紫染液與細(xì)胞懸浮液按體積1：2混合，立即鏡檢，活細(xì)胞染成藍(lán)色。二、培養(yǎng)細(xì)胞的計(jì)數(shù)1、細(xì)胞計(jì)數(shù)板的結(jié)構(gòu)。細(xì)胞計(jì)數(shù)板有兩個(gè)正方形計(jì)數(shù)室組成，每個(gè)計(jì)數(shù)室被分為25個(gè)體積為0.1mm3的大方格，每個(gè)大格又均分為16個(gè)小格。2、用擦鏡紙將計(jì)數(shù)板擦干凈，滴加上述已染色的細(xì)胞懸液于計(jì)數(shù)板上蓋玻片的邊緣，使細(xì)胞懸液自然流入計(jì)數(shù)室內(nèi)（注意不要產(chǎn)生氣泡）。3、在10×物鏡下計(jì)算四個(gè)大格內(nèi)的總細(xì)胞數(shù)和死亡細(xì)胞數(shù)，如果細(xì)胞正好停留在格線上，按照數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右的原則計(jì)數(shù)。[實(shí)驗(yàn)結(jié)果]按下列公式計(jì)算細(xì)胞濃度和細(xì)胞活力：細(xì)胞濃度(個(gè)/mL)=4大格中細(xì)胞總數(shù)×104×稀釋倍數(shù)/4活細(xì)胞百分比＝（細(xì)胞總數(shù)－死亡細(xì)胞數(shù)）/細(xì)胞總數(shù)×100％[注意事項(xiàng)]1、因臺盼藍(lán)有輕度的毒性，染色時(shí)間不宜太長。染色時(shí)間若超過15min以上，活細(xì)胞也會(huì)因受損而著色，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。2、臺盼藍(lán)不宜久存，陳舊者有毒性。[實(shí)驗(yàn)報(bào)告]1、計(jì)算所計(jì)數(shù)的細(xì)胞懸液的細(xì)胞濃度、1mL細(xì)胞懸液中的細(xì)胞總數(shù)及活細(xì)胞的百分比。2、思考:為什么臺盼藍(lán)染色的時(shí)間太長會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)八培養(yǎng)細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇[實(shí)驗(yàn)?zāi)康腯細(xì)胞的冷凍保存與復(fù)蘇是細(xì)胞培養(yǎng)的常規(guī)工作和必須掌握的基礎(chǔ)技術(shù)，通過本實(shí)驗(yàn)，了解、掌握培養(yǎng)細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇的基本技術(shù)方法，為以后的綜合實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。[實(shí)驗(yàn)原理]長期培養(yǎng)的細(xì)胞生物特性容易發(fā)生變化，并且到了一定代數(shù)，就不可避免地會(huì)發(fā)生衰老和凋亡。為了保持培養(yǎng)細(xì)胞的生物學(xué)特性和活力，保持實(shí)驗(yàn)結(jié)果的一致性，一般在傳代培養(yǎng)的早期就要把一部分細(xì)胞保存?zhèn)溆?。?xì)胞凍存是細(xì)胞保存的主要方法，將培養(yǎng)細(xì)胞及時(shí)凍存，使細(xì)胞暫時(shí)脫離生長狀態(tài)，在必要的時(shí)候再進(jìn)行細(xì)胞復(fù)蘇，可以達(dá)到維持和保存細(xì)胞系的目的。冷凍過程中細(xì)胞內(nèi)外水分都會(huì)結(jié)冰，形成的冰晶會(huì)造成細(xì)胞膜和細(xì)胞器的破壞并引起細(xì)胞死亡。在培養(yǎng)液中添加保護(hù)劑，如甘油和二甲亞砜，可以降低溶液的冰點(diǎn)，使細(xì)胞免受冰晶形成及滲透壓改變導(dǎo)致的傷害。液氮是細(xì)胞長期儲(chǔ)存的理想冷凍劑。在使用過程中，常將液氮貯于特制的容器中，而細(xì)胞凍存于液氮中。冷凍細(xì)胞和復(fù)蘇細(xì)胞有不同的要求，一般采用“慢凍快融”的方法。緩慢凍結(jié)，能使細(xì)胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細(xì)胞外，提高細(xì)胞內(nèi)的電解質(zhì)濃度，減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，從而減少由于冰晶形成造成的細(xì)胞損傷?？焖偃诨梢员ＷC細(xì)胞外結(jié)晶在很短的時(shí)間內(nèi)融化，使之迅速通過最易受損的－5℃~0℃，避免由于緩慢融化使水分滲入形成細(xì)胞內(nèi)再結(jié)晶而對細(xì)胞造成損害。一般在細(xì)胞從0℃降溫到－25℃階段，冷凍速度為－1～－2℃該實(shí)驗(yàn)完成需時(shí)6學(xué)時(shí)。[實(shí)驗(yàn)器材]一、儀器二氧化碳培養(yǎng)箱、離心機(jī)、倒置顯微鏡、4℃二、材料各種培養(yǎng)細(xì)胞。[實(shí)驗(yàn)試劑]DMEM培養(yǎng)液、小牛血清、二甲亞砜（DMSO）或甘油、0.25%胰蛋白酶溶液、Hanks培養(yǎng)液、臺盼藍(lán)染液等。[實(shí)驗(yàn)步驟]一、培養(yǎng)細(xì)胞的凍存1、選對數(shù)生長期培養(yǎng)細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化液消化并收集細(xì)胞，細(xì)胞懸浮液在700g離心力條件下離心5min，棄上清液，用Hanks液清洗細(xì)胞1~2次。2、以細(xì)胞凍存液[70％DMEM培養(yǎng)液＋20%小牛血清＋10%DMSO（或甘油）]稀釋細(xì)胞，用吸管輕輕吹打重新懸浮細(xì)胞，充分混勻，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/mL。3、將細(xì)胞懸液分裝于2mL無菌細(xì)胞凍存管內(nèi)，每管加入細(xì)胞懸液約1.8mL，擰緊管蓋，并在凍存管壁上做好記號。4、凍存管在4℃下存放30min，在－20℃下存放2h，在－二、凍存細(xì)胞的復(fù)蘇1、用長鑷子從液氮罐中取出凍存管（注意安全），立即投入盛有37℃2、取出凍存管，用75％乙醇消毒凍存管后，打開管蓋，用吸管吸出細(xì)胞懸液，注入離心管，并立即加入10mL37℃Hanks液，混勻后，700g3、用DMEM培養(yǎng)液重新懸浮細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度約1×105個(gè)/mL，分裝入培養(yǎng)瓶，置37℃4、用臺盼藍(lán)染液檢測凍存細(xì)胞的活力。[實(shí)驗(yàn)結(jié)果]記錄細(xì)胞凍存和復(fù)蘇的全部程序，按下列公式計(jì)算細(xì)胞活力：活細(xì)胞百分比＝（細(xì)胞總數(shù)－死亡細(xì)胞數(shù)）/細(xì)胞總數(shù)×100％[注意事項(xiàng)]1、凍存操作和添加液氮時(shí)注意戴保護(hù)眼睛和手套，以免液氮傷人。切勿直接用手接觸液氮，以免凍傷。2、塑料凍存管的管間膠圈易破，使用前一定要仔細(xì)檢查。凍存細(xì)胞時(shí)，塑料凍存管一定要擰緊，以免解凍時(shí)空氣突然膨脹引起爆炸和解凍時(shí)發(fā)生污染。3、液氮數(shù)量要定期檢查，在發(fā)現(xiàn)液氮揮發(fā)1/2時(shí)要及時(shí)補(bǔ)充。4、凍存一年后，最好復(fù)蘇培養(yǎng)一次，再繼續(xù)凍存。5、DMSO在室溫下易損傷細(xì)胞，因此，在細(xì)胞加入含DMSO凍存液后，應(yīng)盡快冷凍。[實(shí)驗(yàn)報(bào)告]1、觀察細(xì)胞冷凍與復(fù)蘇后形態(tài)變化，計(jì)算細(xì)胞復(fù)蘇后的存活率。2、思考：冷凍過程中為什么要用慢凍快融的方法。實(shí)驗(yàn)九細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)與觀察[實(shí)驗(yàn)?zāi)康腯通過本實(shí)驗(yàn)，了解、掌握凋亡細(xì)胞的誘導(dǎo)與鑒定的基本原理和實(shí)驗(yàn)技術(shù)。[實(shí)驗(yàn)原理]細(xì)胞凋亡是細(xì)胞在一定的生理或病理?xiàng)l件下按照自身的程序結(jié)束生命的過程，即由基因決定的自動(dòng)結(jié)束生命的過程。由于細(xì)胞凋亡受到嚴(yán)格的由遺傳機(jī)制決定的程序性調(diào)控，所以又稱為細(xì)胞編程性死亡（PCD）。細(xì)胞凋亡對于多細(xì)胞生物個(gè)體的胚胎發(fā)育、維持器官組織細(xì)胞數(shù)目相對平衡及抵御外來因素的干擾都有著重要意義。誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的外在因子包括物理性因子和化學(xué)性因子，前者如紫外線，后者如超氧自由基、放線菌素D等。細(xì)胞在凋亡過程中有一系列特征性的形態(tài)學(xué)、生物化學(xué)、細(xì)胞學(xué)及分子生物學(xué)的改變，如凋亡過程中，細(xì)胞內(nèi)Ca2＋/Mg2＋依賴性的核酸內(nèi)切酶被激活，導(dǎo)致染色質(zhì)DNA在核小體連接部位斷裂，產(chǎn)生以180－200bp為最小單位的單體或寡聚體片段，在電泳時(shí)會(huì)呈現(xiàn)180－200bp整數(shù)倍大小的階梯狀條帶，這是識別凋亡細(xì)胞的可靠生化特征。Hochest33258熒光染料能夠和DNA特異結(jié)合，對正常細(xì)胞和凋亡細(xì)胞均能染色，受到紫外光激發(fā)可發(fā)出綠色熒光。但凋亡細(xì)胞由于染色質(zhì)發(fā)生凝縮，并且有凋亡小體產(chǎn)生，因而呈致密濃染，而正常細(xì)胞則發(fā)出均勻熒光，因而，通過二者熒光染色的不同，可將凋亡細(xì)胞和正常細(xì)胞區(qū)分開來。該實(shí)驗(yàn)完成需時(shí)6學(xué)時(shí)。[實(shí)驗(yàn)器材]一、儀器倒置熒光顯微鏡、二氧化碳培養(yǎng)箱、超凈工作臺、倒置顯微鏡、冷凍離心機(jī)、低溫冰箱、電泳儀、電泳槽、凝膠成像分析儀、微量加樣器、Eppendorf離心管、10mL培養(yǎng)瓶、載玻片、蓋玻片等。二、材料人早幼粒白血病HL－60細(xì)胞[實(shí)驗(yàn)試劑]PBS緩沖液、RPMI1640培養(yǎng)液（含10％小牛血清和青霉素、鏈霉素）、三尖杉酯堿（HT，1mg/mL的針劑）、放線菌素D（1mg/mL）、canoy固定液（甲醇：冰醋酸＝3：1）、Hochest33258染料、細(xì)胞凋亡DNA提取試劑盒等。Hochest33258染料的配制：5mgHochest33258、10mg硫柳汞溶于100mL無NaHCO3和酚紅的Hanks液中，溶解40min（室溫），分裝后－20℃[實(shí)驗(yàn)步驟]一、三尖杉酯堿誘導(dǎo)HL－60細(xì)胞凋亡1、實(shí)驗(yàn)前兩天接種2瓶HL－60細(xì)胞，每瓶含6mL培養(yǎng)基，37℃、5％CO22、實(shí)驗(yàn)前2小時(shí)，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到70％－80％時(shí)，作以下處理：a瓶加入三尖杉酯堿，使其終濃度為1μg/mL；b瓶加入等量PBS（pH7.4）作對照。3、將a、b瓶共同放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)3小時(shí)。4、2000r/min離心10min，去上清液，收集細(xì)胞。5、加入1mLPBS懸浮細(xì)胞，加入3mL固定液，固定10min。6、2000r/min離心10min，去上清液，收集細(xì)胞，加入0.5mL固定液，懸浮細(xì)胞。7、取一滴細(xì)胞懸液，滴于潔凈的蓋玻片上，傾斜玻片使細(xì)胞均勻分散，自然干燥。8、將蓋玻片置平皿內(nèi)，滴加3mLHochest33258染液，遮光染色30min后，蒸餾水洗3次，自然干燥。9、在蓋玻片上有細(xì)胞的一面滴一滴封片液，迅速翻轉(zhuǎn)蓋玻片，封片于潔凈的載玻片上。10、在熒光顯微鏡下鏡檢。二、放線菌素D誘導(dǎo)HL－60細(xì)胞凋亡1、取處于對數(shù)增長期的2瓶HL－60細(xì)胞（每瓶含6mL培養(yǎng)基），作以下處理：a瓶加入放線菌素D，使其終濃度為1μg/mL，b瓶加入等量PBS（pH7.4）作對照。將a、b瓶共同放入培養(yǎng)箱，37℃、5％CO22、以下步驟同一、4－9。三、凋亡細(xì)胞DNA的電泳檢測1、收集上述培養(yǎng)瓶中剩余細(xì)胞（2000r/min離心10min，去上清液）。2、提取細(xì)胞DNA（按試劑盒使用說明操作）。3、瓊脂糖凝膠電泳（1％瓊脂糖，75mA，1.5小時(shí)）。4、凝膠成像分析儀內(nèi)觀察、拍照。[實(shí)驗(yàn)結(jié)果]在熒光顯微鏡下，正常細(xì)胞呈現(xiàn)均勻的藍(lán)色，凋亡細(xì)胞表現(xiàn)為團(tuán)塊狀分布的致密濃染顆粒。電泳結(jié)果顯示正常細(xì)胞（即對照組細(xì)胞）DNA呈一條帶，為細(xì)胞總DNA圖譜；凋亡細(xì)胞DNA電泳形成典型的“梯狀帶”。[注意事項(xiàng)]1、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的時(shí)間要準(zhǔn)確。2、熒光鏡下觀察細(xì)胞時(shí)，由于熒光易淬滅，觀察時(shí)要盡量快。[實(shí)驗(yàn)報(bào)告]1、記錄實(shí)驗(yàn)過程和實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并作簡要分析。2、思考:凋亡細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征有哪些？實(shí)驗(yàn)十植物原生質(zhì)體分離與融合[實(shí)驗(yàn)?zāi)康腯通過本實(shí)驗(yàn)，掌握植物原生質(zhì)體分離純化的方法；原生質(zhì)體活力鑒定的方法；了解、掌握細(xì)胞融合的基本原理、程序和技術(shù)方法。[實(shí)驗(yàn)原理]植物原生質(zhì)體培養(yǎng)和原生質(zhì)體融合是植物遺傳改良的重要手段之一，而且原生質(zhì)體也是研究植物細(xì)胞壁再生、細(xì)胞分裂和分化等一系列細(xì)胞遺傳和生理過程的良好實(shí)驗(yàn)材料。不同植物細(xì)胞去壁后形成的原生質(zhì)體可在人工誘導(dǎo)的條件下融合，產(chǎn)生雜種細(xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)可再生體細(xì)胞雜種植株，從而可以打破植物遠(yuǎn)緣雜交有性不親和障礙，是農(nóng)作物改良育種的有力工具之一。人工誘導(dǎo)植物原生質(zhì)體融合的方法很多，如病毒介導(dǎo)法、電場誘導(dǎo)法和高聚分子誘導(dǎo)法等。PEG和高鈣高pH相結(jié)合誘導(dǎo)融合的化學(xué)方法是目前應(yīng)用較為廣泛且效果較好的一種人工誘導(dǎo)植物原生質(zhì)體融合的方法。該法應(yīng)用PEG分子引起原生質(zhì)體的聚集和粘連，然后在高鈣高pH液處理下，產(chǎn)生高頻率的融合。該實(shí)驗(yàn)完成需時(shí)12學(xué)時(shí)。[實(shí)驗(yàn)器材]一、儀器倒置熒光顯微鏡、超凈工作臺、倒置顯微鏡、顯微數(shù)碼拍攝系統(tǒng)、冷凍離心機(jī)、搖床、高壓滅菌鍋、除菌過濾器、微孔濾膜、不銹鋼篩網(wǎng)、血球計(jì)數(shù)板、微量加樣器、Eppendorf離心管、注射器、載玻片、蓋玻片等。二、材料西瓜、甜瓜或黃瓜愈傷組織。[實(shí)驗(yàn)試劑]75％乙醇、原生質(zhì)體洗液、0.5－0.7M甘露醇溶液、酶液（2％纖維素酶＋1％離析酶）、20％蔗糖溶液、0.1％熒光增白劑溶液（用甘露醇溶液配制，過濾）、FDA溶液、D2原生質(zhì)體培養(yǎng)基、PEG溶液、高鈣高pH液等1、原生質(zhì)體洗液的配制：CaCl2.2H2O（終濃度10mmol/L）、KH2PO4（終濃度0.7mmol/L）、甘露醇（終濃度0.55mmol/L），用KOH調(diào)pH＝5.7，高壓滅菌，置4℃2、酶液配制：纖維素酶（終濃度1％）、果膠酶（終濃度1％）。將酶粉溶于原生質(zhì)體洗液中，4000r/min離心10min，用注射器抽取上清夜，0.45微孔濾膜過濾除菌后，分裝小瓶，置－20℃3、雙醋酸酯熒光素（FDA）溶液的配制：將FDA配制呈0.1mg/mL的丙酮溶液，于冰箱保存?zhèn)溆谩?、PEG融合液的配制：PEG（相對分子量1500～6000、濃度40%）、葡萄糖（濃度0.3×10－3mol/mL）、二水氯化鈣（濃度3.5×10－6mol/mL）、磷酸二氫鉀（濃度0.7×10－6mol/mL）5、D2原生質(zhì)體培養(yǎng)基的配制：成分含量（mg/L）成分含量（mg/L）無機(jī)成分（mg/L）NH4NO3270H3BO32.0KNO31480MnSO44H2O5.0CaCl22H2O900ZnSO44H2O1.5MgSO47H2O900KI0.25KH2PO480Na2MoO42H2O0.10FeSO47H2O27.8CuSO45H2O0.015Na-EDTA37.3CoCl26H2O0.010有機(jī)成分（mg/L）m-肌醇100生物素0.04煙酸4.06－BA0.6硫胺素－HCl4.0水解乳蛋白10％甘氨酸1.42，4-D1吡哆醇－HCl0.7葡萄糖0.4mol/L葉酸0.4蔗糖2000PH=5.8[實(shí)驗(yàn)步驟]一、原生質(zhì)體的分離與純化1、按2g原生質(zhì)體：10mL酶液的比例，將生長旺盛的原生質(zhì)體和酶液放入無菌三角瓶中，置于搖床上，60r/min，25℃2、用200目的不銹鋼網(wǎng)過濾酶解后的原生質(zhì)體，除去未消化的組織殘?jiān)?、濾液加入等體積的原生質(zhì)體洗液，取1.5mL以800r/min速度離心5min，棄上清液。加入1.5mL原生質(zhì)體洗液懸浮原生質(zhì)體，重復(fù)離心一次，棄上清液。4、加入1.5mL20％蔗糖溶液，懸浮原生質(zhì)體，以500r/min速度離心5min。5、小心吸取上層原生質(zhì)體，移入另一離心管，用原生質(zhì)體洗液和D2培養(yǎng)基各洗一次。6、棄上清液，將原生質(zhì)體懸浮于D2培養(yǎng)基，調(diào)密度為1×106/mL，培養(yǎng)。二、原生質(zhì)體純度與活力的鑒定1、將FDA染液稀釋10倍，取0.5mL原生質(zhì)體懸液，加入稀釋的FDA溶液0.01mL，室溫下染色5min。2、取一滴染色后的原生質(zhì)體，制成臨時(shí)裝片，置熒光顯微鏡下鏡檢。3、取0.5mL原生質(zhì)體懸液，加入等體積0.1％熒光增白劑溶液，室溫下染色5min。4、用0.55M甘露醇溶液洗滌3次，加入0.5mL培養(yǎng)液重新懸浮。5、取一滴染色后的原生質(zhì)體，制成臨時(shí)裝片，置熒光顯微鏡下鏡檢。三、原生質(zhì)體融合1、將1～2滴不同原生質(zhì)體混合物（密度分別為105～106/mL）滴入小培養(yǎng)皿，靜置8～10min。相對方向加入2滴40%的PEG溶液，靜置10min，每間隔5min，依次加入0.5mL、1mL和2mL原生質(zhì)體洗液洗滌。最后用培養(yǎng)基洗1～2次即可進(jìn)行培養(yǎng)。2、將上述培養(yǎng)皿置倒置顯微鏡下觀察原生質(zhì)體融合過程。[實(shí)驗(yàn)結(jié)果]1、原生質(zhì)體經(jīng)FDA染色后，在熒光顯微鏡下觀察，有活力的原生質(zhì)體發(fā)出綠色熒光（這是由于FDA進(jìn)入原生質(zhì)體，經(jīng)脂酶的作用而發(fā)出綠色熒光），無活力的原生質(zhì)體沒有熒光。2、經(jīng)熒光增白劑染色后，在熒光顯微鏡下觀察，細(xì)胞壁完全脫凈的原生質(zhì)體周圍不會(huì)發(fā)出綠色熒光，而細(xì)胞壁沒有脫凈的原生質(zhì)體周圍會(huì)呈現(xiàn)綠色熒光。3、兩種原生質(zhì)體加入PEG融合液后，只發(fā)生粘連，在洗滌過程中才發(fā)生膜融合。核融合通常發(fā)生于融合體第一次有絲分裂過程中。[注意事項(xiàng)]1、整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程注意無菌操作。2、原生質(zhì)體融合時(shí)，在第二、三次洗液加入前，用移液器輕輕吸走部分溶液，但不能吸干，否則原生質(zhì)體會(huì)破碎死亡。[實(shí)驗(yàn)報(bào)告]1、根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，按下列公式計(jì)算原生質(zhì)體活力與純度。原生質(zhì)體活力（％）＝有活力的原生質(zhì)體數(shù)/原生質(zhì)體總數(shù)×100原生質(zhì)體純度（％）＝完全脫壁的原生質(zhì)體數(shù)/原生質(zhì)體總數(shù)×1002、拍攝或圖繪原生質(zhì)體融合過程。3、思考：酶解液、原生質(zhì)體洗液及原生質(zhì)體培養(yǎng)液中，為何要保持較高的滲透壓？如何測定原生質(zhì)體的活力與純度？實(shí)驗(yàn)十一脂質(zhì)體介導(dǎo)的GFP在培養(yǎng)細(xì)胞中的表達(dá)[實(shí)驗(yàn)?zāi)康腯通過本實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)脂質(zhì)體介導(dǎo)法轉(zhuǎn)染技術(shù)；以GFP為例，了解、學(xué)習(xí)報(bào)告蛋白在細(xì)胞生物學(xué)中的應(yīng)用。[實(shí)驗(yàn)原理]綠色熒光蛋白（greenfluorescentprotein，GFP）是從水母體內(nèi)分離得到的蛋白質(zhì)，該蛋白能夠自身催化形成發(fā)色結(jié)構(gòu)并在藍(lán)光或紫外光激發(fā)下發(fā)出綠色熒光。GFP是一種獨(dú)特的報(bào)告蛋白，是目前唯一能在活細(xì)胞中表達(dá)的發(fā)光蛋白，可在多種原核細(xì)胞和真核生物中表達(dá)，沒有細(xì)胞或位置表達(dá)的專一性，無需外源反應(yīng)底物，無需進(jìn)行細(xì)胞或組織的固定和滲透處理。GFP既具有敏感的標(biāo)記檢測率，又沒有放射性的危害，表達(dá)檢測方便，可廣泛用于基因的表達(dá)與調(diào)控、蛋白質(zhì)的定位、轉(zhuǎn)移及相互作用、信號傳遞、轉(zhuǎn)染與轉(zhuǎn)化，以及細(xì)胞的分離與純化等研究領(lǐng)域。GFP的紫外吸收峰值和發(fā)射峰值分別為395nm和509nm，可以產(chǎn)生清晰明亮的綠色熒光，通常均勻分布在整個(gè)細(xì)胞中?，F(xiàn)在已經(jīng)獲得幾種突變GFP，發(fā)光效率更高。在增強(qiáng)型重組GFP質(zhì)粒（pEGFP-C1/2/3）中，GFP序列位于CMV啟動(dòng)子下游，可在真核細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)。將外源DNA導(dǎo)入細(xì)胞的方法有很多種，如顯微注射、磷酸鈣-DNA共沉淀法、脂質(zhì)體介導(dǎo)法、DEAE-葡聚糖法、電穿孔法等。脂質(zhì)體是一種人工合成的膜泡，具有與生物膜相似的磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)，可以與受體細(xì)胞膜融合，從而將外源DNA轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞。這種方法轉(zhuǎn)染效率高、使用簡便，現(xiàn)已被許多實(shí)驗(yàn)室采用。該實(shí)驗(yàn)完成需時(shí)8學(xué)時(shí)。[實(shí)驗(yàn)器材]一、儀器超凈工作臺、細(xì)胞培養(yǎng)箱、倒置熒光顯微鏡、移液管、離心管、微量加樣器、培養(yǎng)皿等。二、材料