第二十一章 現(xiàn)代分析方法進展

現(xiàn)代分析方法進展以毛細管為分離通道、以高壓直流電場為驅(qū)動力的新型液相分離技術。毛細管電泳包含電泳、色譜及其交叉內(nèi)容，使分析化學得以從微升水平進入納升水平，并使單細胞分析，乃至單分子分析成為可能。capillaryelectrophoresis毛細管電泳1、雙電層雙電層是指兩相之間的分離表面由相對固定和游離的兩部分離子組成的與表面異號的離子層，凡是浸沒在液體中的界面都會產(chǎn)生雙電層。在毛細管電泳中，無論是帶電粒子的表面還是毛細管管壁的表面都有雙電層。一、基礎理論毛細管電泳1、雙電層

一、基礎理論毛細管電泳2、淌度、絕對淌度和有效淌度帶電粒子在直流電場作用下于一定介質(zhì)（溶劑）中所發(fā)生的定向運動稱為電泳。單位電場下的電泳速度稱為淌度。在無限稀釋溶液中（稀溶液數(shù)據(jù)外推）測得的淌度稱為絕對淌度。一、基礎理論毛細管電泳2、淌度、絕對淌度和有效淌度電場中帶電離子運動除了受到電場力的作用外，還會受到溶劑阻力的作用。實際溶液的活度、酸堿度的不同，使樣品分子的離解度不同，電荷也將發(fā)生變化，這時的淌度稱為有效淌度。一、基礎理論毛細管電泳2、淌度、絕對淌度和有效淌度一般來說，離子所帶電荷越多、離解度越大、體積越小，電泳速度就越快。一、基礎理論毛細管電泳3、電滲、電滲流和表觀淌度電滲是推動樣品遷移的另一種重要動力。電滲是指毛細管中的溶劑因軸向直流電場作用而發(fā)生的定向流動。一、基礎理論毛細管電泳3、電滲、電滲流和表觀淌度電滲是由定域電荷引起。定域電荷是指牢固結合在管壁上、在電場作用下不能遷移的離子或帶電基團。一、基礎理論毛細管電泳3、電滲、電滲流和表觀淌度在定域電荷對溶液中的反離子吸引下形成了雙電層，致使溶劑在電場作用下整體定向移動而形成電滲流（毛細管中的電滲流為平頭塞狀）。一、基礎理論毛細管電泳3、電滲、電滲流和表觀淌度一、基礎理論毛細管電泳3、電滲、電滲流和表觀淌度電滲流大小受到Zeta電勢、雙電層厚度和介質(zhì)粘度的影響。一般來說，Zeta電勢越大，雙電層越薄，粘度越小，電滲流值越大。一、基礎理論毛細管電泳3、電滲、電滲流和表觀淌度在多數(shù)的水溶液中，石英（或玻璃）毛細管表面因硅羥基解離會產(chǎn)生負的定域電荷，產(chǎn)生指向負極的電滲流。一、基礎理論毛細管電泳3、電滲、電滲流和表觀淌度在毛細管電泳中，樣品分子的遷移是有效電泳淌度和電滲流淌度的綜合表現(xiàn)，這時的淌度稱為表觀淌度。一、基礎理論毛細管電泳3、電滲、電滲流和表觀淌度電滲在電泳分離中扮演著重要角色。電滲流速度一般是電泳速度的5-7倍。因此，在毛細管電泳中利用電滲流可將正、負離子和中性分子一起朝一個方向產(chǎn)生差速遷移，同時完成正、負離子和中性分子的分離測定。一、基礎理論毛細管電泳3、電滲、電滲流和表觀淌度一、基礎理論毛細管電泳1、毛細管區(qū)帶電泳

Capillaryzoneelectrophoresis（CZE）毛細管和電極槽內(nèi)充有相同組分和相同濃度的電解質(zhì)溶液（緩沖液）。它是最基本、應用最普遍的一種分離模式二、分類毛細管電泳2、毛細管等速電泳

Capillaryisotachophoresis（CITP）二、分類毛細管電泳3、毛細管等電聚焦

CapillaryIsoelectricFocusing（CIEF）毛細管內(nèi)壁經(jīng)涂層處理使電滲流減到最小，再將樣品和兩性電解質(zhì)混合進樣，兩個電極槽中分別為酸和堿，加高電壓后，在毛細管內(nèi)產(chǎn)生pH梯度，樣品的各成分在毛細管中遷移至各自的等電點，形成區(qū)帶，再進行檢測。二、分類毛細管電泳4、毛細管凝膠電泳

Capillary

gel

electrophoresis（CGE）在毛細管內(nèi)填充了多聚物作為分離介質(zhì)，填充凝膠對分子的泳動起著阻礙作用。其作用機制類似平板電泳凝膠的篩網(wǎng)作用，大分子較小分子所受的阻礙大，泳動速度減慢。二、分類毛細管電泳5、毛細管膠束電動色譜

Micellar

electrokineticcapillarychromatography將離子型表面活性劑（如SDS）加到緩沖液中，這類分子一端為親水基團，其余部分為疏水內(nèi)核，親水基團在表面，中性粒子因其本身疏水性不同而得以分離。二、分類毛細管電泳6、毛細管電色譜

Capillaryelectrochromatography（CEC）將HPLC中的固定相微粒填充到毛細管中（或涂漬在管壁上）。以樣品與固定相之間的相互作用為分離機制，以電滲流為流動相驅(qū)動力的色譜過程。二、分類毛細管電泳毛細管電泳通常使用內(nèi)徑為25-100μm的彈性（聚酰亞胺）涂層熔融石英管。標準毛細管的外徑為375μm，有些管的外徑為160μm。三、特點毛細管電泳毛細管的特點：容積?。?00cm×75μm的容積僅為4.4μL）側(cè)面/截面積比大，因而散熱快、可承受高電場（100-1000V/cm）；

可使用自由溶液、凝膠等為支持介質(zhì)；

在溶液介質(zhì)下能產(chǎn)生平面形狀的電滲流。三、特點毛細管電泳毛細管電泳系統(tǒng)的基本結構包括進樣系統(tǒng)、毛細管、兩個緩沖液槽、高壓電源、檢測器、控制系統(tǒng)和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)。四、儀器毛細管電泳四、儀器毛細管電泳四、儀器毛細管電泳四、儀器毛細管電泳UV激光光熱熒光激光誘導熒光安培電導質(zhì)譜CE具有多種分離模式，應用十分廣泛，通常能配成溶液或懸浮溶液的樣品（除揮發(fā)性和不溶物外）均能用CE進行分離和分析，小到無機離子，大到生物大分子和超分子，甚至整個細胞都可進行分離檢測。五、應用毛細管電泳（一）在堿性藥物分析中的應用（二）在手性藥物分析中的應用（三）在蛋白質(zhì)類藥物分析中的應用

SDS-GelMolecularWeightAnalysis

IsoelectricFocusingAnalysisCarbohydrateAnalysisPeptideMapping五、應用毛細管電泳（四）在藥物制劑分析中的應用（五）在藥物與蛋白質(zhì)相互作用研究中的應用（六）在藥物雜質(zhì)檢查中的應用（七）在中藥分析中的應用（八）在生物樣本中的藥物及其代謝產(chǎn)物分析中的應用五、應用毛細管電泳1982年由美國國立衛(wèi)生研究院（NationalInstitutesofHealth，NIH）的YoichiroIto博士研制開發(fā)的一種新型的、連續(xù)高效的液液分配色譜技術。High-speedCountercurrentChromatography高速逆流色譜與其它色譜技術不同的是它不需任何固態(tài)載體，因此能避免固相載體表面與樣品發(fā)生反應而導致樣品的污染、失活、變性和不可逆吸附等不良影響。High-speedCountercurrentChromatography高速逆流色譜液-液萃取一、基本原理高速逆流色譜高速逆流色譜是建立在單向性流體動力平衡體系之上的一種逆流色譜分離方法，它是在研究旋轉(zhuǎn)管的流體動力平衡時偶然發(fā)現(xiàn)的。一、基本原理高速逆流色譜當螺旋管在慢速轉(zhuǎn)動時，螺旋管中的兩相都從一端分布到另一端。用某一相作移動相從一端向另一端洗脫時，另一相在螺旋管里的保留值大約50%，但這一保留量會隨著移動相流速的增大而減小，使分離效率降低。一、基本原理高速逆流色譜但使螺旋管的轉(zhuǎn)速加快時，兩相的分布發(fā)生變化。當轉(zhuǎn)速達到臨界范圍時，兩相就會沿螺旋管長度完全分開，其中一相全部占據(jù)首端的一段，我們稱這一相為首端相，另一段全部占據(jù)尾端的一段，稱為尾端相。一、基本原理高速逆流色譜高速逆流色譜正是利用了兩相的這種單向性分布特征，在高的螺旋管轉(zhuǎn)動速下，如果從尾端送入首端相，它將穿過尾端相而移向首端，同樣，如果從首端相送入尾相，它將穿過首端相而移向螺旋管的尾端。一、基本原理高速逆流色譜分離時，在螺旋管內(nèi)首先注入其中的一相（固定相），然后從合適的一端泵入移動相，讓它載著樣品在螺旋管中無限次的分配。儀器轉(zhuǎn)速越快，固定相保留越多，分離效果越好，且大大地提高了分離速度，故稱高速逆流色譜。一、基本原理高速逆流色譜1．逆流色譜不用固態(tài)支撐體，完全排除了支撐體對樣品組分的吸附、玷染、變性、失活等不良影響。所以，能避免不可逆吸附所造成的溶質(zhì)色譜峰拖尾現(xiàn)象，能實現(xiàn)很高的回收率。例如，對于黃酮等易被填料吸附的物質(zhì)的分離與制備就具有明顯的優(yōu)勢。二、特點高速逆流色譜2．逆流色譜的分配分離是在旋轉(zhuǎn)運動中完成的，兩相溶劑都被劇烈振動的離心力場依其界面特征形成極微小的顆粒，樣品各組分會在兩相微粒的極大表面上分配，并且能在顆粒振蕩與對流的環(huán)境中有效地傳遞。所以，它就象是把通常的溶劑萃取過程成千上萬次地、高效地、自動連續(xù)地予以完成。二、特點高速逆流色譜3．沒有填料在柱內(nèi)的占空體積，逆流色譜的柱內(nèi)空間全部是有效空間。所以，它的樣品負載能力很強，制備量很大，而且重現(xiàn)性很好。二、特點高速逆流色譜三、儀器高速逆流色譜SeparationandpurificationofnaturalbioactivemoleculesSeparationandpurificationofsynthesizedcompoundsFingerprintandqualitycontrolresearchofTraditionalChineseMedicineSeparationandpurificationofantibioticsSeparationandpurificationofproteinsandpolypeptidesChiralseparation四、應用高速逆流色譜ThisnewcategoryofanalyticalseparationscienceretainsthepracticalityandprinciplesofHPLCwhileincreasingtheoverallinterrelatedattributesofspeed,sensitivityandresolution.UltraPerformanceLiquidChromatography超高效液相色譜vanDeemterequation：H=A+B/u+Cu

H=a(bp)+b/u+c(dp)2u顆粒度越小柱效越高；每個顆粒度尺寸有自己的最佳柱效的流速；更小的顆粒度使最高柱效點向更高流速（線速度）方向移動，而且有更寬的線速度范圍。一、原理超高效液相色譜降低顆粒度不但提高柱效，同時也提高了分析速度。一、原理超高效液相色譜使用更高的流速會受到色譜柱填料耐壓及儀器耐壓的限制。反之，如果不用到最佳流速，小顆粒度填料的高柱效就無法體現(xiàn)。另外，更高的柱效需要更小的系統(tǒng)體積（死體積）、更快的檢測速度等一系列條件的支持，否則小顆粒度填料的高柱效同樣無法充分體現(xiàn)。一、原理超高效液相色譜Waters公司在傳統(tǒng)HPLC系統(tǒng)基礎上開發(fā)的超高效液相色譜系統(tǒng)突破了色譜科學的瓶頸，充分利用了傳統(tǒng)HPLC望塵莫及的小粒度色譜柱的優(yōu)勢，使色譜分離的解析度達到新的高度。在儀器工藝方面，WatersACQUITYUPLC?采用了新型的色譜填料及裝填技術，配備了優(yōu)秀的超高壓液相色譜泵、自動進樣器、高速檢測器，并優(yōu)化了系統(tǒng)的綜合設計，使儀器分析能力大大增強。一、原理超高效液相色譜色譜填料超高壓液相色譜泵自動進樣器高速檢測器二、儀器超高效液相色譜Waters公司利用1999年發(fā)明的雜化顆粒技術，合成了1.7um顆粒度的第二代有機硅填料。它使用雙（三乙氧基硅）乙烷在硅膠中形成橋式乙基基團。這樣合成出來的填料在其內(nèi)部有了更多的"交聯(lián)"結構，其機械強度有了極為顯著的提高，耐壓超過了20000psi。二、儀器超高效液相色譜Waters公司的ACQUITYUPLCTM使用了更嚴格的篩分技術使1.7um填料的分布很窄，并且使用了全新篩板及其他色譜柱硬件（柱管及其連接件），在超過20000psi的壓力下裝填。二、儀器超高效液相色譜ACQUITYUPLCTM裝備一臺獨立柱塞驅(qū)動、四個溶劑切換的兩元高壓梯度泵，其1ml/min流速時的耐壓可達15000psi，具有精確、可靠的梯度性能。新型的超高壓輸液泵使獨特的小顆粒填料技術可以在最優(yōu)化的流速下工作，以充分發(fā)揮其特點。二、儀器超高效液相色譜為了降低死體積、減少交叉污染