飼料中有毒有害物質(zhì)的測定

10/27/20236:42AM1飼料中有毒有害物質(zhì)的測定黎觀紅江西農(nóng)業(yè)大學動物科技學院10/27/20236:42AM29飼料中有毒有害物質(zhì)的測定P244（一）飼料質(zhì)量營養(yǎng)質(zhì)量：飼料營養(yǎng)成分含量；技術(shù)質(zhì)量：飼料的物理特性、如顆粒大小、形狀、硬度、適口性等、混合均勻度；衛(wèi)生（安全）質(zhì)量：對動物、人和環(huán)境的安全；情緒質(zhì)量：倫理標準或感覺可影響對質(zhì)量的討論，如有爭議的動物性原料或人造著色劑和調(diào)味劑。一、概述公眾對飼料質(zhì)量重要性的認識的變化表1

10/27/20236:42AM39飼料中有毒有害物質(zhì)的測定（二）幾起典型的飼料安全事故２０世紀８０年代中期至９０年代中期瘋牛病（“牛海綿狀腦病”）的暴發(fā)流行。1999年1月15日以來，比利時、荷蘭、法國、德國相繼發(fā)生因動物飼料被二惡英污染，導致畜禽類產(chǎn)品及乳制品含高濃度二惡英事件。“瘦肉精”中毒問題、“毒奶粉（2008）”、“紅心鴨蛋（使用蘇丹紅，2006）”、“多寶魚（藥物殘留，2006）”等。

“配合飼料有毒”、“配合飼料生產(chǎn)的肉蛋奶不能吃”、“小孩肥胖原因是吃了含激素的肉”。

一、概述飼料安全等于畜產(chǎn)品安全！

10/27/20236:42AM4都是藥殘惹的禍！蘇丹紅三聚氰胺瘋牛病二惡英瘦肉精三聚氰胺蘇丹紅（紅心鴨蛋）孔雀石綠（水產(chǎn)品）抗生素等藥物殘留……10/27/20236:42AM5“飼料雞”“土雞”新概念雞蛋全是“扯蛋”？

10/27/20236:42AM69飼料中有毒有害物質(zhì)的測定（三）飼料衛(wèi)生標準——強制性國家標準

對飼料中有獨有害物質(zhì)及有害微生物以法律形式做出的統(tǒng)一規(guī)定。

1991年版《飼料衛(wèi)生標準》：覆蓋面較小，造成許多事故糾紛無判定依據(jù)，一些重要的產(chǎn)品衛(wèi)生指標沒有規(guī)定等。一、概述10/27/20236:42AM79飼料中有毒有害物質(zhì)的測定（三）飼料衛(wèi)生標準——強制性國家標準

2001年新版GB13078－2001《飼料衛(wèi)生標準》：

有害物質(zhì)及微生物衛(wèi)生指標項目增加了“鉻”在皮革、蛋白粉和雞、豬配合飼料中的允許量指標。即由原標準規(guī)定的16項，修訂為17項。新版標準覆蓋的產(chǎn)品品種達66種，是原標準的3倍多。砷在磷酸鹽產(chǎn)品中的允許量指標由每千克產(chǎn)品10毫克，修訂為20毫克。氟在磷酸氫鈣產(chǎn)品中的允許量指標由每千克2000毫克，修訂為1800毫克。黃曲霉毒素B1指標將肉用仔雞配合飼料分為前期料和后期料，其允許量分別為每千克飼料中10微克和20微克。補充規(guī)定了與各項指標相對應的試驗方法，消除了原標準沒有指明特定試驗方法的缺陷。一、概述10/27/20236:42AM89飼料中有毒有害物質(zhì)的測定（三）飼料衛(wèi)生標準——強制性國家標準現(xiàn)行的飼料衛(wèi)生標準將進行不斷的修訂和完善！相對于發(fā)達國家的飼料衛(wèi)生標準，我國的飼料衛(wèi)生標準項目偏少。新農(nóng)藥的不斷出現(xiàn)（現(xiàn)行飼料衛(wèi)生標準只規(guī)定了兩種農(nóng)藥的限量標準：六六六、滴滴涕）。敵敵畏、敵百蟲、甲胺磷、菊酯類、馬拉磷、蚜螨磷安全限量標準草案。測定方法靈敏度的提高，對于某些有毒有害物質(zhì)限量的規(guī)定將可能發(fā)生改變。新飼料資源的開發(fā)利用。一、概述10/27/20236:42AM99飼料中有毒有害物質(zhì)的測定（四）飼料中有毒有害物質(zhì)的分類1.按來源分：

天然：棉酚、硫甙、脲酶、胰蛋白酶抑制劑等

次生：微生物次生代謝產(chǎn)物，如黃曲霉毒素B1、由氨基酸產(chǎn)生的組胺、尸胺、腐胺、精胺等

外源性：重金屬污染，2按性質(zhì)分：有機：棉籽餅粕、菜籽餅粕、蓖麻餅粕中的蓖麻毒素和蓖麻堿、四季豆中的皂甙（皂素）和胰蛋白酶抑制劑等，病原微生物、霉菌毒素、有機農(nóng)藥等。無機：鉛、砷、鉻、鎘、汞、氟、鉬等。一、概述10/27/20236:42AM10

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飼料中有毒有害物質(zhì)的測定砷的毒性：砷與動物體組織中酶的巰基結(jié)合使之失活，損害機體全身組織。砷的氧化物毒性很高，三價砷毒性>五價；無機砷毒性>有機砷：砒霜（As2O3

）。一般情況下，植物性飼料砷含量很低。植物飼料中砷含量與土壤中的水平、農(nóng)藥污染和工業(yè)污染有關(guān)。二、飼料中總砷的測定（P248）10/27/20236:42AM11

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飼料中有毒有害物質(zhì)的測定二、飼料中總砷的測定有機砷飼料添加劑：對氨基苯砷酸（阿散酸）、對氨基苯砷酸鈉和3-硝基-4-羥基苯砷酸（洛克殺生）。

促生長，抗球蟲及著色（使皮膚紅潤，毛色發(fā)亮）等功效。我國制定的飼料中砷測定標準方法是測定飼料中總砷含量（目前的檢測方法還不能區(qū)分有機砷和無機砷），而衛(wèi)生標準中砷的限量標準為無機砷，造成了使用有機砷添加劑的配合料，含砷量超過我國國家允許量標準，這也使得檢測結(jié)果無法依據(jù)產(chǎn)品衛(wèi)生標準進行質(zhì)量判定。10/27/20236:42AM129飼料中有毒有害物質(zhì)的測定二、飼料中總砷的測定10/27/20236:42AM139飼料中有毒有害物質(zhì)的測定（一）概述黃曲霉毒素（aflatoxins,AF）是由一組真菌（黃曲霉、曲霉等）產(chǎn)生的一組化學結(jié)構(gòu)類似的真菌毒素。主要污染花生、玉米、棉籽及其餅粕等。對人和動物均具有極強的毒性和致癌性。黃曲霉毒素還可在動物產(chǎn)品中蓄積，影響人體健康。目前已分離鑒定出12種，包括B1、B2、G1、G2、M1、M2、P1、Q、H1、GM、B2a和毒醇。其中黃曲霉毒B1最為多見，其毒性和致癌性也最強。在自然條件下，飼料污染的黃曲霉毒素主要為AFB1、B2、G1、G2，其中以AFB1含量最高。黃曲霉毒素的毒性、致癌性和蓄積性——飼料產(chǎn)品質(zhì)量控制中的必檢項目。

二、飼料中黃曲霉毒素B1的測定10/27/20236:42AM149飼料中有毒有害物質(zhì)的測定(二)檢測方法酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA）薄層層析法（thinlayerchromatography，TLC）快速篩選法二、飼料中黃曲霉毒素B1的測定（P288）10/27/20236:42AM159飼料中有毒有害物質(zhì)的測定酶聯(lián)免疫吸附法1、原理

ELISA的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記。以待測抗原（或抗體）與酶標抗體（或抗原）的特異結(jié)合反應為基礎(chǔ)，通過酶活力測定來確定抗原（或抗體）含量。特點：很強的特異性：建立在抗原與抗體免疫學反應的基礎(chǔ)上。

很高的靈敏度：酶催化反應。對于黃曲霉毒素B1，ELISA法最低可檢出0.1μg。

二、飼料中黃曲霉毒素B1的測定10/27/20236:42AM169飼料中有毒有害物質(zhì)的測定酶聯(lián)免疫吸附法

ELISA可用于測定抗原，也可用于測定抗體。在這種測定方法中有3種必要的試劑：固相的抗原或抗體，酶標記的抗原或抗體，酶作用的底物。

二、飼料中黃曲霉毒素B1的測定10/27/20236:42AM17酶聯(lián)免疫吸附法A、抗體將某種抗原經(jīng)各種途徑免疫動物，成熟的B細胞克隆受到抗原刺激后，將抗體分泌到血清和體液中。實際上血清中的抗體是多種單克隆抗體的混合物，因此稱之為多克隆抗體。

9飼料中有毒有害物質(zhì)的測定10/27/20236:42AM18單克隆抗體是由生長在細胞培養(yǎng)物中的同一B細胞的群體（一個克?。┖铣刹⒎置诘?、均一的、識別同一抗原表位的抗體。10/27/20236:42AM19酶聯(lián)免疫吸附法B、酶與底物：在ELISA中，常用的酶為辣根過氧化物酶(horseradish

peroxidase,

HRP)和堿性磷酸酶(alkaline

phosohatase,

AP)。在少數(shù)商品ELISA試劑中，應用的酶尚有葡萄糖氧化酶、β-D-半乳糖苷酶和脲酶等。辣根過氧化物酶底物：鄰苯二胺(O-phenylenediamine,OPD)、四甲基聯(lián)苯胺(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine,TMB)和ABTS。用2mol/L硫酸終止酶反應。堿性磷酸酶底物：一般采用對硝基苯磷酸酯(p-nitrophenyl

phosphate,p-NPP)作為底物，用NaOH終止酶反應。

9飼料中有毒有害物質(zhì)的測定10/27/20236:42AM20酶聯(lián)免疫吸附法B、酶與底物：在ELISA中，常用的酶為辣根過氧化物酶(horseradish

peroxidase,

HRP)和堿性磷酸酶(alkaline

phosohatase,

AP)。在少數(shù)商品ELISA試劑中，應用的酶尚有葡萄糖氧化酶、β-D-半乳糖苷酶和脲酶等。辣根過氧化物酶底物：鄰苯二胺(O-phenylenediamine,OPD)、四甲基聯(lián)苯胺(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine,TMB)和ABTS。用2mol/L硫酸終止酶反應。堿性磷酸酶底物：一般采用對硝基苯磷酸酯(p-nitrophenyl

phosphate,p-NPP)作為底物，用NaOH終止酶反應。9

飼料中有毒有害物質(zhì)的測定10/27/20236:42AM21酶聯(lián)免疫吸附法ELISA最常用的四種方法：直接法測定抗原；間接法測定抗體；雙抗體夾心法測定抗原；競爭法測定抗原。

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飼料中有毒有害物質(zhì)的測定10/27/20236:42AM22（1）

直接法測定抗原

A.

將抗原吸附在載體表面；

B.

加酶標抗體，形成抗原—抗體復合物；

C.加底物。底物的降解量＝抗原量。10/27/20236:42AM23（2）間接法測定抗體A.

將抗原吸附于固相載體表面；B.

加抗體,形成抗原-抗體復合物;C.

加酶標抗體；D.加底物。測定底物的降解量＝抗體量。10/27/20236:42AM24（3）雙抗體夾心法測定抗原A.

將抗體吸附于固相表面;B.

加抗原，形成抗原-抗體復合物;C.

加酶標抗體;E.加底物。底物的降解量＝抗原量。

10/27/20236:42AM25（4）競爭法測定抗原A.

將抗體吸附在固相載體表面;B.加入酶標抗原和待測抗原，競爭結(jié)合抗體；對照只加入酶標抗原；C.加底物。對照孔與樣品孔底物降解量的差＝未知抗原量。10/27/20236:42AM26黃曲霉毒素B1酶聯(lián)免疫競爭檢測法

10/27/20236:42AM27樣品黃曲霉毒素B1分子10/27/20236:42AM28微孔表面情況AFB1抗體10/27/20236:42AM29標準品10/27/20236:42AM30標準溶液10/27/20236:42AM31酶標抗原10/27/20236:42AM32酶標抗原酶AFB110/27/20236:42AM33標準品,樣品

和

酶標抗原

加進微孔10/27/20236:42AM34樣品酶標抗原

樣品孔先加后加10/27/20236:42AM35標準品酶標抗原標準孔先加后加10/27/20236:42AM36孵育30分鐘抗原與抗體結(jié)合10/27/20236:42AM37微孔清洗10/27/20236:42AM38洗滌5次，間隔2分鐘10/27/20236:42AM39加入酶催化反應底物10/27/20236:42AM40加入反應底物A和B孵育15分鐘10/27/20236:42AM41顯色10/27/20236:42AM4210/27/20236:42AM43反應孔10/27/20236:42AM44陰性對照孔10/27/20236:42AM45陰性對照孔=沒有黃曲霉毒素B1分子與酶標抗原競爭所有抗體都與酶標抗原結(jié)合10/27/20236:42AM46陽性對照孔10/27/20236:42AM471ng/ml標準孔=黃曲霉毒素B1分子結(jié)合到抗體上剩余的抗體再與酶標抗原結(jié)合10/27/20236:42AM48陽性樣品酶標抗原結(jié)合得越少，顏色越淺10/27/20236:42AM49加入終止液，反應液由藍色變成黃色，上酶標儀讀取數(shù)據(jù)，畫標準曲線10/27/20236:42AM50調(diào)零孔陰性孔0.1ng/ml0.5ng/ml1ng/ml5ng/ml